一种隐绿原酸的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种有机酸的制备方法，具体涉及一种隐绿原酸的制备方法。
【背景技术】
[0002]隐绿原酸即4-咖啡酰奎宁酸，属于单咖啡酰奎宁酸类化合物，是绿原酸(3-咖啡酰奎宁酸)同分异构体。近年来，国内外学者就咖啡酰奎宁酸类化合物药理活性进行了深入研究，发现其具有一些重要生物活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抑制平滑肌收缩、降血脂等，极具临床应用价值，有望在治疗病毒性肝炎及宫颈癌疾病中发挥重要的作用。但由于目前此类化合物仅停留在是实验室研究阶段，还未见规模制备的方法技术，这样很大地限制了此类化合物的深入研究开发。因此，对于此类化合物包括隐绿原酸的规模分离、纯化及制备成为其深入开发的关键问题。
[0003]国内外关于隐绿原酸的分离纯化仅少数文献报道，许小方(许小方，李会军，李萍，冯煦，袁昌齐.灰毡毛忍冬花蕾中的化学成分[J]，中国天然药物，2006,4(1):45-47.)从15kg灰毡毛忍冬中通过D101大孔树脂、SephadexLH-20、RP-C18和重结晶等方法分离得到200mg隐绿原酸。王琦(王琦.金银花的化学成分研究[D].沈阳药科大学，2008.)采用萃取、反复硅胶柱层析、SephadexLH-20和重结晶等方法从280g金银花浸膏中分离得到隐绿原酸30mg。王岱杰(王岱杰.忍冬叶化学成分及其抗H5亚型禽流感病毒研究[D].山东农业大学，2013.)从10kg忍冬叶中通过MCI树脂、SephadexLH-20及制备液相等手段分离得到13mg隐绿原酸。然而，上述研究中普遍存在一个问题，隐绿原酸都是在化学成分研究过程中发现的，这些方法并不是针对隐绿原酸的分离、纯化和制备，具有随机性、重现性差，而且分离纯化步骤较繁琐，不适合大规模分离制备。另外，由于隐绿原酸在植物中含量低，通过植物化学手段来分离得到的量非常小，无法满足动物实验的研究应用。同时，也有报道国外学者采用化学合成隐绿原酸(张亚梅.咖啡酰奎宁酸类化合物的合成研究[J].江西中医药，2012，8
(43):78.),但隐绿原酸通过奎宁酸选择性酯化合成收率很低，且成本高，污染很大，未进入规模化生产，而国内无人问津，所有以上均制约了其进一步的开发应用。
[0004]因此，很有必要在现有技术的基础之上，研究开发一种制备效率高，产率高，生产成本低，具有很好应用前景的隐绿原酸的制备方法。
【发明内容】
[0005]发明目的:本发明的目的是为了解决现有技术的不足，经过大量实验筛选，提供优选的隐绿原酸的制备方法。本发明提供的隐绿原酸的制备方法，以绿原酸为原料，采用优选的酸处理工艺使绿原酸稳定的、高效的转化为隐绿原酸，并通过优选的工业制备色谱纯化方法，将性质较接近的绿原酸和隐绿原酸等分离纯化，制备得到纯度高的隐绿原酸，工艺简单，步骤简便，制备效率高，得率高，制备得到的隐绿原酸纯度高，整个过程生产成本低，可操作性强，适合大规模制备，具有很好的应用前景。
[0006]技术方案:为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]一种隐绿原酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0008](1)取绿原酸，加5?10倍量体积浓度为50 %?80 %甲醇溶解，加10?20倍量的1?2mol/L盐酸，于60°C水浴上搅拌反应6?8h，反应结束后冷却至室温，得反应液；
[0009](2)反应液中加1?2mol/LNaOH溶液调pH至中性，50°C以下减压浓缩至干，加甲醇溶解，析出白色固体滤过，滤液在50°C以下减压浓缩至干，加少量水溶解，滤过，得滤液；
[0010](3)取滤液经反相Ci8柱预处理，水洗，收集水洗液浓缩，离心，过0.45μπι滤膜，反相工业制备色谱法制备得到隐绿原酸。
[0011]作为优选方案，以上所述的隐绿原酸的制备方法，步骤(1)中，取绿原酸，加10倍量体积浓度为50 %甲醇溶解，然后加20倍量的lmol/L盐酸，然后于60°C水浴上搅拌反应6h，反应结束后冷却至室温。
[0012]作为优选方案，以上所述的隐绿原酸的制备方法，反相工业制备色谱法的色谱条件为:色谱柱为反相C18色谱柱(30?150X250?600111111))，流速为15?1000111171^11，波长为326nm，流动相为乙腈(A)-0.5%甲酸溶液⑶，梯度洗脱，进样量1.0?20.0g。
[0013]实验例
[0014](一)酸反应优选试验:
[0015]由于绿原酸结构不稳定，极易发生变化，本发明通过大量实验筛选转化条件，在60°C水浴下进行反应。
[0016]1、考察60°C下，绿原酸的转化实验:
[0017](1)0.lmol/L盐酸反应8个小时，每隔2h取样，以绿原酸为对照进行HPLC检测。
[0018](2)0.lmol/L氢氧化钠反应8个小时，每隔2h取样，以绿原酸为对照进行HPLC检测。
[0019]检测结果:在酸性条件下，绿原酸可转化为隐绿原酸;但是在碱性条件下，无隐绿原酸生成。
[0020]因此，本发明选择酸性条件下进行隐绿原酸的转化。
[0021 ] 2、考察60°C下，在不同浓度的酸性条件下绿原酸的转化实验:
[0022](1 )0.0lmol/L盐酸反应8个小时，每隔2h取样，以绿原酸为对照进行HPLC检测。
[0023](2)0.lmol/L盐酸反应8个小时，每隔2h取样，以绿原酸为对照进行HPLC检测。
[0024](3)lmol/L盐酸反应8个小时，每隔2h取样，以绿原酸为对照进行HPLC检测。
[0025]检测结果:
[0026]a、0.0lmol/L盐酸反应条件下，反应终点隐绿原酸生成量很少。
[0027]b、0.lmol/L盐酸反应6h有微量隐绿原酸生成，8h有少量隐绿原酸生成。
[0028]c、lmol/L盐酸反应4h有少量隐绿原酸生成，6h有大量隐绿原酸生成，8h的生成杂质较多。
[0029]因此，本发明优选的隐绿原酸的最佳转化反应条件为:浓度为lmol/L盐酸下，反应6h0
[0030](二)工业制备色谱法制备条件的优选
[0031]1、检测波长:本发明通过全波长扫描和3D等高线检测，优选出最佳的检测波长为326nm，在该波长下隐绿原酸有最大吸收，故选择检测波长为326nm。
[0032]2、流动相的组成，本发明以甲醇-水，甲醇-0.5%甲酸溶液，乙腈-水和乙腈-0.5%甲酸溶液分别为流动相，实验结果表明，以甲醇-水，甲醇-0.5 %甲酸溶液，乙腈-水为流动相时，系统分离效果较差，洗脱速度慢，峰形不佳，因此本发明选择乙腈(A)-0.5%甲酸溶液(B)为洗脱剂。
[0033]3、洗脱程序筛选:由于隐绿原酸和绿原酸极性接近，在色谱柱上完全分离具有较大的难度，并且绿原酸和隐绿原酸的化学性质很不稳定，因此，本发明通过大量实验筛选梯度洗脱条件，优选得到最佳的梯度洗脱程序为:0?30min，8%?30%A;30?35min，30%?100%Ao
[0034]本发明提供的隐绿原酸的制备方法，采用优选的酸性条件下转化后，再用优选浓度的碱将过量的酸进行中和，通过实验筛选，采用1?2mol/LNa0H溶液不仅可以将反应体系中过量的酸中和，并且不会影响隐绿原酸的结构稳定性，可防止隐绿原酸结构再次转化，保证产率。
[0035]经过酸性转化和碱性中和后，反应体系中存有一定的杂质和未反应完的绿原酸等，为了提高后续制备液相的纯化效率，本发明通过大量实验筛选，将碱中和后的反应液先经反相C18柱预处理，可以将反应体系中的部分杂质去掉，大大提高后续工业制备色谱的制备效率和提高隐绿