抗癌萃取物及化合物的制作方法
【专利说明】
[00011 本申请是申请号为201180047555.6，申请日为2011年9月30日，发明名称为"抗癌 萃取物及化合物"的中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002]本发明为关于自植物中萃取的具有抗癌活性的新颖萃取物及新颖化合物。
【背景技术】
[0003] 石莲(Graptopetalum paraguayense，GP)为一种中国传统中草药，且对于健康有 多种帮助。根据其古老的中国处方，GP被认为具有多种有益效用，如:缓和肝的病症、降低血 压、美白、缓解疼痛及感染、抑制发炎及改善脑部的功能。
[0004] 于研究中发现，GP的叶子萃取物可抑制酪胺酸酶及血管收缩素转化酶的活性，以 及于体外试验中可清除自由基（Chen，S-J等，石莲（Graptopetalum paraguayense E.Walther)萃取物于血管收缩素转化酶的抑制效果的研究<^〇〇(1〇161^8杜7 100:1032-1036，2007;Chung，Y_C等，石莲（Graptopetalum paraguayense E .Walther)的抗氧化活性 的研究。Food Chemistry 91:419-424,2005;及 Huang，K_F等，石莲（Graptopetalum paraguayense E.Walther)萃取物于燕类酪胺酸酶的抑制效果的研究Food Chemistry 89: 583-587，2005)。另外，发现GP的水、及50 %乙醇的、及95 %乙醇的茎部萃取物具有抗氧化活 性，该等萃取物亦以人类HCC细胞株(HepG2)的增生作用，进行抑制效果的分析(Chen，S J等， 石莲的茎部萃取物于体外试验的抗氧化活性及抗增生活性Am J Chin Med36 :369-383， 2008)。体内试验研究证明GP的叶子萃取物可抑制小神经胶质细胞活化、氧化压力及iNOS表 现，以降低缺血性脑损伤(Kao，TK等，石莲(Graptopetalum paraguayense E· Walther)的叶 子萃取物于缺血性老鼠中可保护、抵抗脑损伤Am J Chin Med 38:495-516,2010)。
[0005] 由Hsu等人于2004年申请的美国专利（专利号：7,364,758)，其的体内及体外试验 中石莲乙醇萃取物具有抗肝纤维化及抗发炎功效于2008年被授予专利。接着，其的部分连 续申请案(美国专利号7，588，776)于2008年提出申请，并于2009年授予专利，其发现石莲水 溶性分液对于肝病或肝状况，如发炎、脂肪变性、及纤维化，具有治疗效果。
【发明内容】
[0006] 本发明关于从植物中所分离的一种新颖萃取物及其分液及新颖化合物;该植物尤 其是指缟瓣属(Graptopetalum sp)的植物。本发明亦提供一种使用该新颖萃取物或新颖化 合物以治疗癌症的新颖方法，该癌症尤其是指肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma， HCC) 〇
[0007] 在一方面，本发明提供一种具有抗癌活性的萃取物，该萃取物是以二甲基亚砜 (Dimethyl sulfoxide，DMS0)从植物中萃取，该植物是选自由缟瓣属（Graptopetalum sp.)、红景天属(Rhodiola sp.)及石莲花属(Echeveria sp.)所组成的群组。在本发明中不 可预期地发现了该DMS0萃取物具有抗癌活性。
[0008] 于本发明的一具体实施例中，该植物为石莲(Graptopetalum paraguayense)或红 景天(Rhodiola rosea)。于本发明的一实例中，藉由30%DMS0萃取该植物以取得该萃取物。
[0009] 另一方面，本发明提供来自植物的含有丰富抗癌成分的分液，该植物为选自由缟 瓣属(Graptopetalum sp·)、红景天属(Rhodiola sp.)及石莲花属（Echeveria sp.)所组成 的群组；尤其为石莲(Graptopetalum paraguayense)或红景天(Rhodiola rosea);该分液 是藉由二甲基亚砜(DMS0)萃取该植物，并藉由色层分析分离而制备得的分液，称为HH-F3， 该分液具有细胞毒杀作用，及于癌细胞中向下调控AURKA、AURKB、及FLJ10540的表现的效 果。
[0010] 本发明的一具体实施例中，使用Sephadex LH-20管柱作为层析管柱。根据本发明， 该分液具有高度的细胞毒杀效果，以及于Huh7及HepG2细胞中，具有向下调控AURKA、AURKB、 及FLJ10540的表现的效果。
[0011]于分液HH-F3的机转研究方面，发现分液HH-F3可诱发HCC进行细胞凋亡。换句话 说，分液HH-F3对于癌细胞，尤其是HCC，具有疗效。
[0012] 又一方面，本发明提供一化合物，该化合物具有下式I的结构式，
[0013]
[0016]
OH
[0017] 以及该原飞燕草素(PD)单元的结构为
[0018]
[0019] 根据本发明，具有式I结构式的化合物可分离自植物，该植物是选自由缟瓣属 (Graptopetalum sp·)、红景天属（Rhodiola sp.)或石莲花属(Echeveria sp.)所组成的群 组。本发明的一具体实施例中，该化合物是从石莲(Graptopetalum Paraguayense)或红景 天(Rhodiola rosea)的分液中纯化而得。具有式I结构式的化合物被发现富含3，4,5-三轻 基苯甲基部份(moieties)且具抗癌活性。
[0020] 又另一方面，本发明提供一组合物或一医药组合物，其包含本发明的萃取物、分液 或化合物，及医药上可接受的载剂。再者，该医药组合物具有抗癌活性，其可用以有效预防 或治疗癌症，如:肝癌，尤其是HCC。
[0021] 再一方面，本发明提供该萃取物、该分液或具有式I结构式的化合物于制备用以治 疗癌症(尤其是HCC)的医药的用途。
[0022] 又一方面，本发明提供一种预防或治疗癌症的方法，其包含投与治疗有效量的本 发明的萃取物、分液或化合物至有需求的对象。在本发明一实例中，该癌症为HCC。
【附图说明】
[0023]本发明前述的
【发明内容】
，以及的后的详细说明，于阅读时可配合图示以更加了解。 为了阐述本发明，所呈现的图示为具体实施例中较佳的呈现方式。需明了的是，本发明并不 受限于该等具体实施例，或其呈现的图示。
[0024] 于图示中：
[0025] 图1提供本发明的分液HH-F3的HPLC图谱，其中该层析图谱及该梯度冲提曲线分别 以X线及Y线表示。
[0026]图2中显示本发明的分液HH-F3于增加细胞毒杀作用的功效;其中图2(A)图显示于 Huh7细胞的效果，及图2(B)图显示于Mahlavu细胞的效果;将自不同溶剂所制得的萃取物进 行比较;其中Huh7(A)及Mahlavu(B)细胞为以自水、丙酮、甲醇、100%乙醇、70%乙醇、50% 乙醇、100%DMS0、及 30%DMS0 制备的 GP 萃取物，以 100、150、250、500、750、1000、&1500yg/ ml的浓度处理72小时，接着将该等细胞进行MTT分析。于该等萃取制备物中，该30%DMS0的 GP萃取物，于72小时时，具有明显抑制Huh7及Mahlavu细胞存活性的功效。
[0027]图3中显示本发明的分液HH-F3，于HSC-T6 (A)、及HepG2及Huh7细胞（（B)及（C))的 间期（interphase)及Μ期中，可降低许多有丝分裂调控子的降解;其中（A)HSC-T6细胞是以 30%DMS0 GP萃取物处理。将细胞溶解物以抗Fljl0540及抗Aurkb抗体进行免疫墨点法分 析；（B)HepG2及Huh7细胞是以不同浓度的30%DMS0 GP萃取物处理，及将细胞溶解物以抗 FLJ10540、抗AURKA、及抗AURKB抗体，进行免疫墨点法分析。（C)HepG2及Huh7细胞是以75ng/ ml诺可达唑(nocodazole，N0C)处理16~18小时。经过同步剂（synchronizing agent)前处 理后，该等细胞遂以750μg/ml 30%DMS0 GP萃取物或空白对照组（30%DMS0)再处理3小时； 再以抗FLJ10540、抗AURKA、及抗AURKB抗体进行西方墨渍法;下列数点需特别注意：（1)相较 于位于间期的细胞，AURKA、AURKB、及FLJ10540可于有丝分裂的细胞中高度表现;及(2)经过 30%DMS0 GP萃取物处理后，可抑制于间期及中期(metaphase)的AURKA、AURKB、及FLJ10540 的蛋白表现程度。
[0028] 图4中显示本发明的分液HH-F3于HCC细胞株：Huh7细胞（A)、及HepG2及Huh7细胞 ⑶，的抑制AURKA蛋白表现的效果;其中(A)Huh7细胞是以500μg/ml浓度的GP萃取物处理48 小时；该等GP萃取物是从水、丙酮、甲醇、100%乙醇、70%乙醇、50 %乙醇、100% DMS0、及 30%DMS0所制得;显示以30%DMSO GP萃取物处理后，可抑制AURKA的表现程度；（B)于HepG2 及Huh7细胞中，AURKA、AURKB、及FLJ10540的表现程度无法被水及BuOH分液所抑制。
[0029] 图5中显示本发明的分液HH-F3于两个HCC细胞株:Huh7细胞(A)及Mahlavu细胞(B) 中所造成的细胞毒杀的时间及剂量相关性的反应；其中Huh7(A)及Mahlavu(B)细胞是以 30 %DMS0 GP萃取物，于0、250、500、750、及1000μg/ml的浓度处理24、48及72小时，接着进行 MTT分析。由30%DMS0 GP萃取物于Huh7及Mahlavu细胞所造成的生长抑制的IC50值，于48 小时，分别约为500及250μg/ml。
[0030] 图6中显示不同的GP纯化分液于HCC细胞株中的AURKA蛋白表现的效果；包含图6 (A)图阐述本发明的GP萃取物及分液HH-F3的纯化方式；图6(B)图显示HepG2细胞是以30% DMS0 GP萃取物，HH-F1、HH-F2、HH-F3、及HH-F4，处理3小时。结果显示，于Η印G2细胞处理HH-Fl、HH-F2、及HH-F4分液，无法抑制AURKA及AURKB表现程度；图6 (C)图显示经过30 %DMS0 GP 萃取物及HH-F3分液的处理后，可抑制AURKA的表现；以及图6(D)图显示经过HH-F3a分液的 处理后，可抑制AURKA的表现。
[0031] 图7中显示本发明的分液HH-F3于抑制Huh7细胞(A、E)、Mahlavu细胞(B、F)、PLC5细 胞(C、G)、及 HSC-T6 细胞(D)的细胞存活性的效果；其中 Huh7(A、E)、Mahlavu(B、F)、PLC5(C、 6)、及批(^6(0)细胞是以册43分液，于5、25、50、及75以8/1111的浓度，处理24、48、及72小时， 之后接着进行MTT分析(A至D)及台酸蓝（trypan blue)分析(E至F)。于Huh7、Mahlavu、PLC5、 及HSC-T6细胞中，经由HH-F3分液处理，所造成的细胞存活性抑制效果的IC50值，经过处理 72小时后，分别约为50、37 · 5、75、及20μg/ml。
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