Fe 3〇4的比例较 小，合成改性磁性壳聚糖微球时，配体的成功引入也会降低Fe3〇4的比例。磁滞回线不存在明 显的滞后性，为S型磁化曲线，几乎无磁滞现象，说明两种磁性壳聚糖微球具有良好的超顺 磁性。磁性微球在使用过程中易于在外加磁场作用下分离，这对于固定化酶的回收利用极 其重要。
[0053] 实验 1-2
[0054] 取适量充分干燥后的样品，使用梅特勒TGA/DSC1型同步热分析仪进行热重分析。 分析条件:载气:N2;载气流量:20mL/min;升温程序:20°C/min，起止温度:25°C-1000°C。
[0055] 图3是磁性壳聚糖微球(MCTS)、2,4,6_三氨基嘧啶（TAP)和改性磁性壳聚糖微球 (MCTS-TAP)的热重分析图。磁性壳聚糖微球的失重主要分为两个阶段，第一阶段为25-150 °C，主要是水分的散失，失重率为4.3 %，第二阶段为220-400°C，主要是壳聚糖分子热分解， 失重率为49.2 %。2，4，6-三氨基嘧啶在250-350°C内失重加剧，失重率为77.2 %，450°C后分 解减缓，850°C时分解完全。MCTS-TAP在200-350°C失重现象明显，失重率为44.1%，温度在 400°C之后MCTS-TAP与TAP失重曲线基本相似，并最终缓慢趋于平衡，但其分解温度却高于 TAP，说明母体与功能基结合的化学键较为牢固，增加了微球的热稳定性。
[0056] 实施例2
[0057] (1)准确称取10mg的磁性壳聚糖微球载体，用10mL的磷酸缓冲液(PBS，pH= 7)溶胀 24小时后分离；
[0058] (2)在步骤(1)的所得物中加入1 OmL的5 %戊二醛溶液，于25°C下振荡活化5小时并 过滤，用蒸馏水洗去多余的戊二醛；
[0059] (3)在步骤(2)的所得物中加入2. Omg的纤维素酶酶液，30°C恒温振荡固定5小时 后，过滤，滤渣用磷酸缓冲液进行反复冲洗后得固定化酶，将得到的固定化酶置于冰箱中保 存(4°C)备用。
[0060] 以下说明纤维素酶活力的测定方法及由实施例2得到的固定化酶的酶活力测定方 法。
[0061] 游离酶活力测定：取适量纤维素酶溶于HAc-NaAc缓冲液，配置成一定浓度的纤维 素酶溶液。取lmL酶液加入5mLHAc-NaAc缓冲液，再加入10mL浓度为1%羧甲基纤维素钠 (CMC-Na)溶液，并做平行。对照组的酶液在沸水中灭活15min，空白组中不加催化底物，用等 量的HAc-NaAc缓冲液替代。在50°C振荡器中以150r/min反应30min，立即取2mL反应液与比 色管中，加入2mLDNS试剂，混勾后于沸水中加热1 Om i η后用流水冷却，定容至2 5mL，摇勾后静 置15min，用空白调零点，于540nm处测定吸光度，并计算纤维素酶的活力。
[0062 ]固定化酶活力测定：取等当量的固定化酶加入5mL HAc -NaAc缓冲液，再加入1 OmL 浓度为1%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液，在50°C振荡器中以120r/min反应30分钟，立即取 2mL反应液于比色管中，加入2mL DNS试剂，混匀后于沸水中加热10分钟后用流水冷却，定容 至25mL，摇匀后静置15分钟，于540nm处测定吸光度，并计算纤维素酶的活力。同样设置平行 和对照。
[0065]其中：A平均:样品液的平均吸光值;Αχ?:对照液的吸光值;G: Δ A值在葡萄糖标准曲 线上对应的葡萄糖量;η:酶粉(液)的稀释倍数;t:反应时间min;Μ:样品重量(mg)。
[0066]固定化酶的活力回收率是指固定化酶总活力与固定化时加入游离酶总活力的比 值，以百分数表示。
[0068] 固定化酶或游离酶的相对酶活（％):指在同组实验中以活力最高的为100,与其余 的固定化酶或游离酶的活力之比，通常以百分数表示。
[0069] 其中，上述提及的葡萄糖标准曲线的制作如下：
[0070] 取11支比色管，洗净烘干并编号，按表1加入1.0mg/mL葡萄糖标准溶液和蒸馏水， 配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。
[0071] 表1不同浓度的葡萄糖溶液
[0072]
[0073] 将溶液摇匀后，向各比色管中加入2.0mL DNS，摇匀后在沸水浴中加热lOmin，然后 流水冷却，用蒸馏水定容至25mL，充分摇勾后静置15min，以0号试管为参比，于540nm处测吸 光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值A 54Q为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。如图4所示，得到 的线性方程为y = 1 · 1895x-0 · 0007(R2 = 0 · 9996)。
[0074] 实验 2-1
[0075] 平行取各类微球载体10.Omg多份，在其它固定化条件相同的情况下，改变固定化 时间分别为2小时、3小时、4小时、5小时、6小时，然后在其它固定化条件相同的情况下，按照 实施例2的方法制备固定化酶。
[0076] 图5为时间对纤维素酶固定化的影响。
[0077] 如图5所示，固定化时间对酶活力有很大影响。MCTS和MCTS-TAP载体固定化酶的相 对活力均随时间的延长而增大，MCT S和MCT S-TAP载体固定化酶的相对活力在5小时达到最 大，此后随着时间的继续增加，相对酶活呈现下降的趋势。若时间太短，酶分子与载体不能 进行充分的接触固定，导致固定于载体上的酶分子较少，固定化酶活力低;若时间过长，载 体上经过戊二醛活化产生的与酶结合的位点趋于饱和，酶分子在载体上积聚过多，导致空 间位阻的增大，影响酶和底物的有效接触，以及底物的扩散作用，影响酶分子活力的发挥。 另外，固定化是在振荡条件下进行，过长的时间也可能使载体表面结合不牢的酶蛋白脱落 下来，这也会导致酶活性的下降。因此，MCTS和MCTS-TAP载体对纤维素酶的固定化时间为5 小时。
[0078] 实验 2-2
[0079] 用不同pH的缓冲液(?!1=4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)配置一系列浓度为0.111^/1^的纤 维素酶溶液，并分别测定不同pH值下的游离酶活力，再平行取壳聚糖微球载体10.Omg多份， 在其它固定化条件不变的情况下，分别加入20mL上述不同pH值的纤维素酶溶液，然后在其 它固定化条件相同的情况下按照实施例2的方法制备固定化酶。
[0080]图6为pH值对纤维素酶固定化的影响。
[0081 ] 如图6所示，当pH在6.0-7.0范围时，MCTS和MCTS-TAP载体固定化酶均表现出较高 的活性，超出此范围，酶活力均出现不同程度的下降。由于pH值对纤维素酶的活性中心和结 构稳定性以及酶与载体的结合具有影响，固定化酶的形成最好在中性(pH=7.0)或偏中性 条件下进行，过酸或者过碱的pH环境都会降低酶的活力。
[0082]实验 2-3
[0083]平行取壳聚糖微球载体10.Omg多份，在其它固定化条件相同的情况下，分别加入 不同量的纤维素酶，使给酶量为1.0/10. 〇mg载体、1.5/10.0 mg载体、2.0/10.0 mg载体、2.5/ 10.0 mg载体和3.0mg/10.0 mg载体，然后在其它固定化条件相同的情况下按照实施例2的方 法制备固定化酶。
[0084] 图7为给酶量对纤维素酶固定化的影响。
[0085] 如图7所示，壳聚糖微球载体质量一定，固定化酶的活力随着给酶量的增加而变 大，当给酶量增加到一定值时，酶活力反而有所降低。由图7可知给酶量在2.0-2.5mg/ 10 · Omg (MCTS-TAP载体)和1 · 5-2 · Omg/10 · Omg (MCTS载体）范围内，固定化酶均具有较高的酶 活力。
[0086] 实验 2-4
[0087] 平行取壳聚糖微球载体10.Omg多份，在其它固定化条件相同的情况下，改变固定 化温度分别为15°〇、20°〇、25°〇、30°〇和35°〇，然后在其它固定化条件相同的情况下按照实 施例2的方法制备固定化酶，观察温度对酶固定化的影响。
[0088] 图8为温度对纤维素酶固定化的影响。
[0089] 如图8所示，相对酶活随固定化温度的升高呈现出先增加而后减小的趋势。当固定 化温度在25-35°C范围时，固定化纤维素酶的相对活力均达到了78%以上。
[0090]综上，磁性壳聚糖微球载体MCTS固定化酶的最佳条件：固定化时间5h，固定化pH = 7，给酶量为1.5mg/10.0 mg载体，固定化温度为30°C。在此最佳固定化条件下，酶的固载量为 73 · 5mg/g(载体），酶活力回收率达到了 71 · 6 %。
[0091 ]实验 3-1
[0092] 对应取适量的游离酶和固定化酶，分别加入不同pH(2.8-7.8)的HAc-NaAc缓冲液 和对应pH值的CMC-Na溶液，按照游离酶活力测定方法和固定化酶活力测定方法测定酶活 力，最高的酶活力设为100 %。
[0093]图9为pH对游离酶(Free enzyme)和固定化酶相对活力的影响。
[0094]如图9所示，随着pH值的增大，游离酶和固定化酶活性均呈现先增大而后减小的变