孔板放入湿盒，37°C水浴振荡反应4h，在微孔底部包被戊二醛。
[0077](3)弃去反应液，将5个微孔用磷酸盐缓冲液(pH=5.0)和二次水各洗2次，加入200yL 10—6M的捕获探针，37 0C水浴孵育4h，将捕获探针修饰到微孔板上。
[0078](4)弃去反应液，将5个微孔用二次去离子水清洗3次，在5个孔中各加入10yL浓度为 I O—12M，I O—13M，I O—14M，I O—15M，OM的靶DNA，25 °C 反应2h。
[0079](靶DNA序列:5，-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3，)
[0080](5)三叉DNAl的制备:用二次去离子水将一端为适体序列I的三条DNA稀释至10—4M,再分别用TE缓冲液稀释至3 X 10—5M ；三条DNA各取1yL，混合均匀后，95 °C加热2min，65 °C孵育5min，60°C孵育2.5min，缓慢降温至20°C。所得产物三叉DNAl于4°C保存。同理制备三叉DNA2o[0081 ](三叉DNAl制备序列:
[0082] 1.5，-GGTTGGTGTGGTTGGTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3’
[0083 ] 2.5’-GGTTGGTGTGGTTGGCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3，
[0084]3.5'-GGTTGGTGTGGTTGGAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3'
[0085]其中:适体序列I为 5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’
[0086]三叉DNA2制备序列:
[0087]1.
[0088]5，-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3，
[0089]2.
[0090]5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3，
[0091]3.
[0092]5 ’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3’)
[0093]其中:适体序列2为5，-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’
[0094](6)弃去反应液，将5个微孔用二次去离子水清洗2次，在5个孔中各加入1yL 1(Γ5Μ的探针DNA，5yL 10—5M的三叉DNAl，5yL 10—5M的三叉DNA2，1yL混合液(包括2 X 10—6M凝血酶，5mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(pH=7.4)，200mM硝酸钠，20mM硝酸钾，2X 10—6M氯化血红素)，1yL 1mM三磷酸碱基脱氧核苷酸，IyL DNA聚合酶(5U/yL)，IyL DNA内切酶(lOU/yL)，5yLDNA聚合酶缓冲液(500mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，50mM氯化镁，1mM二硫苏糖醇，pH 8.0)，5yL 0嫩内切酶缓冲液(50禮醋酸钾，201111三氨基甲烷醋酸盐，101111醋酸镁，10(^/1^牛血清白蛋白)，3yL TE缓冲液(1mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，ImM乙二胺四乙酸二钠，pH = 8.0)，25°C 反应 lh。
[0095](探针DNA序列:5，-GGTTGGTGTGGTTGGGCCGTTGC-3’
[0096]DNA聚合酶:Klenow Fragment(exo_)DNA聚合酶
[0097]DNA内切酶:Nb.BbvCI核酸内切酶)
[0098](7)弃去反应液，将5个微孔用二次去离子水清洗3次，加入10yL显色液(IyL0.5^3,3',5,5^四甲基联苯胺，2yL 30%过氧化氢，97yL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺缓冲液，含26.6mM梓檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，15mM氯化钾)，显色反应后，进行紫外-可见光吸收检测。
[0099]实验结果:
[0100]一、基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大比色法检测DNA的的灵敏度
[0101 ]图1中从下到上依次为采用所建立的方法检测浓度为0M，10—15M, 10—14M, 10—13M, 10一 12M勒DNA所产生的紫外-可见光谱图，检出限为10—15M。
[0102]二、基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大比色法检测DNA的选择性
[0103]图2中从下到上依次为采用所建立的方法检测0M，10—12M错配靶I，10—12M错配靶2，I O—12M靶DNA，所产生的紫外-可见光谱图(错配靶I的序列为:5 ’ -GACGGCGAAGGATTGATACT-3 ’，错配靶2的序列为:5 ’ -GGGTAGGGCGGGTTGGG-3 ’)
[0104]结论:只有靶DNA能在650nm处产生紫外-可见吸收信号。
[0105]实施例2
[0106]本发明所述的三叉DNA根据文献“Controlled assembly of dendrimer-likeDNA,Nature Materials,2003,3,38-42”所述的方法制备。
[0107]上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1.基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的比色法，其特征在于， 设计与靶DNA特异性结合后，能与探针DNA互补配对的捕获探针； 向固定后的捕获探针中依次加入靶DNA、探针DNA、DNA聚合酶、DNA内切酶，引发复ffjij-剪切反应，使靶DNA进行循环放大，实现扩增； 向上述体系中继续加入凝血酶、氯化血红素，探针DNA与凝血酶特异性识别，进而与氯化血红素结合，形成过氧化物模拟酶； 再向上述体系中加入能够通过凝血酶相互连接形成网络型结构的三叉DNA;所述三叉DNA分为两类，分别为三叉DNAl和三叉DNA2，所述三叉DNAl的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点I的适体序列I，所述三叉DNA2的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点2的适体序列2; 网络型结构中的凝血酶适体序列与氯化血红素结合，形成大量过氧化物模拟酶； 向上述产物中加入相应的底物，采用比色法对靶DNA进行检测； 所述凝血酶含有两个识别位点，分别为凝血酶识别位点I和凝血酶识别位点2; 所述三叉DNA末端的适体序列I或适体序列2皆含有富G序列； 所述探针DNA—端为能够特异性识别“凝血酶识别位点I或2”的适配体序列。2.如权利要求1所述的比色法，其特征在于，所述捕获探针为茎环结构，与靶DNA特异性结合后，茎环结构被打开，被打开的茎环末端可与探针DNA互补配对。3.如权利要求1所述的比色法，其特征在于， 所述适体序列 I为5 ’-GGTTGGTGTGGTTGG-3 ’ ； 或所述适体序列2为5 ’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3 ’。4.如权利要求1所述的比色法，其特征在于， 所述捕获探针的序列为: 5'-CCGCCGTTGAACACCATTGTCACACCCTCAGCAACGGCGG-3’； 或所述靶DNA序列为:5 ’-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3 ’； 或所述三叉DNAl的序列为: I )5 ’-GGTTGGTGTGGTTGGTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3 ’； 2)5’-GGTTGGTGTGGTTGGCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3 ’； 3)5’-GGTTGGTGTGGTTGGAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3 ’； 或三叉DNA2的序列为:1) 5 ’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3 ’；2) 5 ’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3 ’；3) 5 ’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3 ’。5.—种基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的试剂盒，其特征在于，包括: 能与靶DNA特异性结合的捕获探针； 探针DNA，所述探针DNA—端为能够特异性识别“凝血酶识别位点I或2”的适配体序列，另一端为能够与被靶DNA打开的捕获探针互补配对的序列； 能够通过凝血酶相互连接形成网络型结构的三叉DNA;所述三叉DNA分为两类，分别为三叉DNAl和三叉DNA2，所述三叉DNAl的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点I的适体序列I，所述三叉DNA2的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点2的适体序列2; 凝血酶、氯化血红素、DNA聚合酶、DNA内切酶； 所述凝血酶含有两个识别位点，分别为凝血酶识别位点I和凝血酶识别位点2; 所述三叉DNA末端的适体序列I或适体序列2皆含有富G序列。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获探针为茎环结构，与靶DNA特异性结合后，茎环结构被打开，被打开的茎环末端可与探针DNA互补配对。7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于， 所述适体序列 I为5 ’-GGTTGGTGTGGTTGG-3 ’ ； 或所述适体序列2为5 ’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3 ’。8.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于， 所述捕获探针的序列为: 5'-CCGCCGTTGAACACCATTGTCACACCCTCAGCAACGGCGG-3’； 或所述靶DNA序列为: 5 ’-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3 ’； 或所述三叉DNAl的序列为: I )5 ’-GGTTGGTGTGGTTGGTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3 ’； 2)5’-GGTTGGTGTGGTTGGCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3 ’； 3)5’-GGTTGGTGTGGTTGGAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3 ’； 或三叉DNA2的序列为:1) 5 ’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAGGTC-3 ’；2) 5 ’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCTGTC-3 ’；3) 5 ’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCAGTC-3 ’。9.一种基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的装置，其特征在于，包括权利要求6-8任一项所述的试剂盒。10.—种网络型过氧化物模拟酶纳米结构放大检测信号的方法，其特征在于，包括: 加入能够通过凝血酶相互连接形成网络型结构的三叉DNA;所述三叉DNA分为两类，分别为三叉DNAl和三叉DNA2，所述三叉DNAl的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点I的适体序列I，所述三叉DNA2的末端为能够特异性识别凝血酶识别位点2的适体序列2; 加入凝血酶和氯化血红素;所述凝血酶含有两个识别位点，分别为凝血酶识别位点I和凝血酶识别位点2，在凝血酶作用下，三叉DNA中的适体序列I和适体序列2与凝血酶特异性识别，进而与氯化血红素结合，形成网络型过氧化物模拟酶纳米结构，催化反应底物，放大检测信号； 所述三叉DNA末端的适体序列I和适体序列2皆含有富G序列。
【专利摘要】本发明提供了基于网络型核酸纳米探针的酶循环放大检测DNA的比色法。采用适体自组装网络型核酸纳米探针和酶循环放大技术，以达到对靶DNA的痕量检测。其设计原理为：将三叉DNA1和三叉DNA2的末端分别设计为能够特异性识别凝血酶的适体序列1和适体序列2，使两种三叉DNA通过与凝血酶的特异性识别互相连接，形成网络型结构。其中，适体序列1和适体序列2又为富G序列，能与氯化血红素结合形成大量过氧化物模拟酶，催化反应底物产生放大的检测信号。通过本方法，可实现对靶DNA的超高灵敏检测，无需复杂仪器设备,简单易行。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105567839
【申请号】CN201610076457
【发明人】毕赛, 王宗花, 王赛, 龚世达, 夏延致
【申请人】青岛大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年2月3日