[0076] 5、提取转化子的质粒，用Pst I和EcoR I双酶切，酶切产物大小约为4. 4化和 2. 6化的质粒为阳性质粒，将此重组表达载体命名为P19-PCAB，如图1所示。
[0077] 将得到的重组表达载体P19-PCAB进行测序验证，结果表明；在PMD19-T载体的Pst I和EcoR I酶切位点间插入了如序列表中序列1所示的核巧酸分子，表明载体正确。
[0078] 实施例2、重组表达载体pMCS-pctAAK的构建
[0079] 1、人工合成序列表中序列2所示的DNA序列，其中第13-55位核巧酸为启动子 序列；第72-1625位核巧酸为pet基因序列；第1655-2593位核巧酸为曲rA基因序列；第 2623-3927位核巧酸为aceA基因序列；第4110-5826位核巧酸为aceK基因序列；
[0080] 2、用EcoR I和化0 I双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小约为5. 8化的基 因片段；
[0081] 3、用EcoR I和化〇 I双酶切载体地BR1MCS-2 (公众可根据NCBI GenBank号为 U23751的序列自己合成），回收大小约为5. 1化的载体片段；
[0082] 4、将步骤2得到的基因片段与步骤3得到的载体片段连接（Takara的solution I连接试剂盒），得到连接产物通过化学转化的方法导入到E. coli JM109中，并涂布于 LB-Kan固体培养基，37°C培养16h，得到转化子。
[0083] 5、提取转化子的质粒，用Eco I和化0 I双酶切，酶切产物大小约为5. 8化和5. 1化 的质粒为阳性质粒，将此重组表达载体命名为pMCS-pctAAK，如图2所示。
[0084] 将得到的重组表达载体pMCS-pctAAK进行测序验证，结果表明；在地BR1MCS-2载 体的EcoR I和化0 I酶切位点间插入了如序列表中序列2所示的核巧酸分子，表明载体正 确。
[00财实施例3、大肠杆菌JM1091dM的构建
[0086] 1、合成 1 化A 基因敲除所用的引物 1 化AF ; 5 ' -CTCCCCTGGAATGCAGGGGAGCGGCAAGATT AAACCAGTTCGTTCGGGCAATTCCGGGGATCCGTCGACC-3 ' 和 1 化AR ; 5 ' -TATTTTTAGTAGCTTAAATGTGAT TCAACATCACTGGAGAAAGTCTTATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3'，W质粒地D13 为模板，采用 1 化AF 和1化AR引物PCR扩增得到1. 5化左右的DNA片段，该片段的序列如SEQ ID No. 3所示，琼 脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段进行纯化；
[0087] 2、用LB-Amp液体培养基中在3(TC的条件下培养含有PKD46的大肠杆菌，提取质粒 PKD46,利用电转化的方法转化至受体菌株E. coli JM109中，并涂布于LB-Amp固体培养基， 3(TC培养2地，得到转化子，获得E. coli JM109(p邸46);
[0088] 3、将E. coli JM109(p邸46)接种到LB-Amp液体培养基中，30°C培养地，加入阿拉 伯糖至终浓度20旨/1，继续培养1.化，接下来制备E. coli JM109(pKD46)的感受态细胞，将 步骤1中获得的DNA片段转入E. coli JM109 (PKD46)的感受态细胞中，并涂布于LB-Kan固 体培养基，37°C培养24h，得到转化子；
[0089] 4、利用菌落PCR的方法，W 1化AF和1化AR为引物，将PCR产物纯化之后测序，筛选 正确的1化A基因已经被替换为Kan抗性基因的克隆，得到E. coli JM1091化A-K(p邸46);
[0090] 5、将E. coli JM1091化A-K(p邸46)接种于LB液体培养基中，42°C培养传代Η次， 除去地D46质粒，得到Ε. coli JM1091化Α-Κ ;
[0091] 所述E. coli JM1091化A-K是1化A基因被Kan基因替换了的E. coli JM109 ;
[0092] 6、将E. coli JM1091化A-K接种到LB-Kan液体培养基中，37°C培养2地，转接到 LB-Kan液体培养基中，37°C培养化，制备E. coli JM1091化A-K感受态细胞；
[0093] 7、LB-Amp液体培养基中3(TC培养含有PCP20的大肠杆菌，提取质粒PCP20,利用 电转化的方法将PCP20转化到E. coli JM1091dM-K感受态细胞中，并涂布于LB-Amp固体 培养基，37°C培养24h，得到转化子；
[0094] 8、利用菌落PCR的方法，W 1化AF和1化AR为引物，将PCR产物纯化之后测序，筛 选Kan基因缺失的克隆，最终获得IdM基因缺失的突变体E. coli JM1091dM。
[0095] 实施例 4、重组菌 E. coli JM109 (pl9-PCAB+pMCS-pctAAK)和重组菌 E. coli JM1091 化A(pl9-PCAB+pMCS-pctAAK)的构建
[0096] 1、将实施例1得到的重组质粒P19-PCAB和实施例2得到的重组质粒pMCS-pctAAK 通过电转化的方法转化到E. coli JM109中，并涂布于LB-Amp-Kan固体培养基，37°C培养 2地，得到为重组菌 E. coli JM109 (pl9-PCAB+pMCS-pctAAK)。
[0097] 2、将实施例1得到的重组质粒P19-PCAB和实施例2得到的重组质粒pMCS-pctAAK 通过电转化的方法转化到E. coli JM1091dM中，并涂布于LB-Amp-Kan固体培养基，37°C培 养24h，得到重组菌E.coliJM1091化A(pl9-PCAB+pMCS-pctAAK)。
[009引 实施例5、重组菌E. coli JM109(pl9-PCAB+pMCS-pctAAK)在生产己醇酸基聚合物 中的应用
[009引 1、发酵培养
[0100] (1)种子液的获得：将重组菌 E. coli JM109(pl9-PCAB+pMCS-pctAAK)在 LB-Amp-Kan液体培养基中培养16h(37°C摇床，200巧m)作为种子液；
[0101] (2)发酵；按体积比4 %的接种量将种子液接种到MSG-Amp-Kan液体培养基、 LBG-Amp-Kan液体培养基、MSM-Amp-Kan液体培养基、LBM-Amp-Kan液体培养基中，37°C摇 床，200rpm，发酵培养72h，收集发酵产物。
[0102] 2、检测细菌胞内积累的聚合物含量
[0103] 通过气相色谱法（Gas C虹omatography，GC)对细菌胞内的聚合物进行定量检测， 测定细胞的生物量、胞内聚合物含量和聚合物中各单体的比例。
[0104] 具体检测方法如下；气相色谱分析使用HP 6890型气相色谱仪，色谱柱为HP-5毛 细管柱，柱长30m，内径320 μ m，固定相为25nm厚的苯基甲基聚娃氧焼；检测器为火焰离子 化检测器（Flame ionization detector, FID);用高纯氮气作为载气，氨气作为燃气，空气 为助燃气。
[0105] 气相色谱分析的条件如下：
[0106] (1)柱温；8(TC开始，停留1. 5min ;30°C /min的速率升温到140。停留Omin ; 40°C /min的速率升温到220。停留Imin。总计时间为6. 5min。
[0107] 似柱压；10psi开始，停留1. 5min ;2. 5psi/min的速率升压到20psi，停留 0. 5min。（psi为压力单位，即磅/平方英寸，Ipsi = 6. 89476kPa)
[0108] (3)进样口；温度为20(TC，使用分流模式，分流比为30。
[010引 （4)检测器；温度为22(TC，氨气流量30血/min,空气流量400血/min。
[0110] (5)检测步骤如下：
[0111] 1)将上述步骤1中得到的发酵产物，离必（10000g，10min)收集菌体，然后用蒸傭 水洗涂两次后再次离必；将细胞冰冻干燥，测定细胞干重（Cell化y wei曲t，CDW);
[011引。取50mg干细胞于醋化管中，加入2血醋化液（按体积百分含量为3 %将浓硫酸 溶于甲醇中，得到硫酸-甲醇溶液，再按照终浓度为Ig/L将苯甲酸作为内标加入硫酸-甲 醇溶液中，得到醋化液）、2mL氯仿，加盖密闭，10(TC烘箱中反应4h ;冷却至室温后，加入ImL 去离