的是，9顺式维甲酸以及HX531处理后给以调整部分基因的基础表达，这说明RXR的活化在正常生理状态下可能会抑制抗病毒基因饿激活(如图4B和4C所示)在J2病毒持续存在的骨髓巨噬细胞中，我们发现9顺式维甲酸抑制干扰素I以及干扰素4的表达，然而Poly 1:C转染的巨噬细胞中，HX531对干扰素的表达增加。(如图10所示)。病毒感染可以直接触发主要抗病毒基因(例如干扰素l、Isgl5)的表达，产生干扰素，并通过自分泌/旁分泌放大抗病毒效应。(Sadler和Williams2008)。为了验证RXR是否可以抑制主要抗病毒基因的产生从而抑制干扰素非依赖性下游通路信号，I型干扰素受体缺乏的骨髓源性巨噬细胞(IFNar-/-)给予9顺式维甲酸以及HX531处理后，Poly1:C激活。在干扰素受体缺乏的骨髓源性巨噬细胞里，基因分析显示9顺式维甲酸处理组显著下调Poly 1:C产生IFNl和Isgl5的表达。(如图4D所示)而0as2、Gbpl、I rf7以及Isg20没有显著。(数据未显示)。这说明其诱导方式为干扰素依赖型。这些结果表明给予Poly 1:C刺激或，RXR的活化调节一组特定的包括干扰素在内的主要基因的表达。
[0080]
实施例4
RXR通过靶向调节下游RIG-1以及TLR3信号通路来抑制干扰素的转录:
[0081 ] 为了进一步研究RXR是如何抑制I型干扰素，本发明发明人应用了干扰素催化剂荧光素酶受体(IFN-1uc)并发现由Poly I:C转染的9顺式维甲酸处理组显著降低干扰素启动子的激活。(如图5A所示)。这些数据表明RXR抑制干扰素转录。
[0082]转染的Poly 1:C可以被TLR3以及RIG-1识别，TLR3和RIG-1分别募集下游接头分子IPSl和TRIF。IPSl和TRIF均可以促进TBKl激酶和干扰素调节因子3磷酸化，然后干扰素调节因子3的二聚体进入细胞核内促使干扰素转录(Newton和Dixit2012 ；Takeuchi和Akira2009，2010)。RXR的联合超表达显著抑制由RIG_1、IPS1、TBK1，IRF3和TRIF活化的干扰素启动子激活。(如图5B-5G所示)除干扰素启动子激活外，RXR的联合超表达减弱由RIG-1、IPSU TBKl或IRFl调节的对水泡型口炎病毒的清除。(如图5G及图1lA-1lEK示)。考虑到RXR可以阻断干扰素启动子的活性，而干扰素启动子是由几乎所有I型干扰素通路的作用元件驱动激活，RXR很可能在RIG-1和TLR3调节的信号通路对下游干扰素调节因子3发挥其抑制功能。
[0083]
实施例5
通过对9顺式维甲酸的前处理来抑制I型干扰素的表达:
[0084]在之前的实验中，本发明发明人已经注意到，RXR激动剂过夜处理显著抑制I型干扰素的表达。为了进一步确定RXR激动剂的功能动力学，在Poly 1:C刺激前，根据不同的时间点给予RAW264.7细胞DMSO或9顺式维甲酸预处理，仅在给予9顺式维甲酸预处理超过12小时的细胞中观察到干扰素表达的显著降低，其中干扰素的表达是由Poly I =C引起的。(如图6A所示)与RAW264.7细胞相似的是，给予9顺式维甲酸和DMSO预处理6小时的骨髓源性巨噬细胞中，Poly 1:C诱导的干扰素I和干扰素4mRNA水平变化无差异。给予9顺式维甲酸预处理4小时或8小时后，RIG-1，(一种干扰素刺激基因)也没有影响。(如图12C所示)然而，给予9顺式维甲酸预处理超过12小时候后，干扰素的表达显著被抑制。(如图6B所示)根据这些结果可以看出，我们假设9顺式维甲酸诱导型基因可以调节RXR对I型干扰素的表达的抑制作用。
[0085]
实施例6
RXR配体激活诱导环氧合酶I和环氧合酶2的表达:
[0086]为了探讨9顺式维甲酸诱导型基因可能参与抑制I型干扰素的表达，本发明发明人对给予DMSO和9顺式维甲酸处理的巨噬细胞基因表达分析进行了比较，在这些9顺式维甲酸诱导型基因中(如图6C)，我们发现环氧合酶I是表达量最高的9顺式维甲酸诱导型基因。众所周知，炎症反应中，环氧合酶2是可以诱导的，而在以往的报道中环氧合酶I在多种细胞中作为本构表达基因起作用。(Vane等1998)有趣的是，在RXR激活的细胞中，环氧合酶ImRNA显著诱导，而环氧合酶2mRNA显著被抑制。在骨髓源性巨噬细胞中，在不同的时间点给予细胞9顺式维甲酸，四小时后，环氧合酶I表达显著增加，而环氧合酶2显著下降(如图6D和6E所示)，我们也发现，给予原发性骨髓源性巨噬细胞9顺式维甲酸过夜处理后，可以显著增加环氧合酶I的表达。(如图13A所示)Poly 1:C活化可以显著诱导环氧合酶2的表达。然而，给予9顺式维甲酸处理后可以阻断环氧合酶2的表达。(如图13B所示)然而在给予9顺式维甲酸8小时后，环氧合酶I蛋白是检测不出来的。经过16小时后，环氧合酶I蛋白大量聚集。(如图6所示)这也解释了为什么给予9顺式维甲酸过夜处理可以抑制I型干扰素的表达。作为RXR的潜在合作伙伴，RAR可以促进病毒感染(如图SC所示)骨髓源性巨噬细胞给予RAR激动剂AM580处理，环氧合酶I在过夜处理后显著表达，而环氧合酶2并没有被显著抑制。
[0087]实施例7
环氧合酶I调节RXR对抗病毒基因的抑制作用:
[0088]考虑到环氧合酶I和环氧合酶2在催化花生四烯酸转化为多个前列腺素的功能非常相似，(Vane等1998)，我们在基因水平上检测了环氧合酶I和环氧合酶2的相对探针强度，发现在9顺式维甲酸预处理组以及Poly 1:C激活巨噬细胞组，环氧合酶I的表达比环氧合酶2的表达更多(如图7A所示)。随后，环氧合酶I以及环氧合酶2的表达也可以用来对二者进行完全复制。(如图14A所示)与基因相对探针强度数据相一致的是，在9顺式维甲酸预处理组以及Poly 1:C激活巨噬细胞组，环氧合酶I的完全复制产物的表达比环氧合酶2的完全复制产物的表达要高很多。(如图14B所示)这些结果表明，在RXR激活的细胞病毒感染期间，环氧合酶I在花生四烯酸转化为其终产物的过程中起到了关键作用。
[0089]为了明确环氧合酶I和环氧合酶2对I型干扰素的作用，非甾体类抗炎药(NSAID)双氯芬酸和吲哚美辛最初被用来阻断环氧合酶I和环氧合酶2酶活性。在Poly I:C激活巨噬细胞组，吲哚美辛和双氯芬酸可以明显逆转9顺式维甲酸对干扰素I和干扰素4表达的抑制作用。环氧合酶I和环氧合酶2特异性合成物以及干扰RNA用作后续应用。(如图14C所示)敲除环氧合酶I以及敲除环氧合酶I和2后能够明显逆转9顺式维甲酸对干扰素的表达的抑制效应，然而干扰环氧合酶2仅有轻微的影响(如图7C所示)。为了验证在病毒感染期间，环氧合酶I对9顺式维甲酸处理组特异性抑制I型干扰素的作用，我们对环氧合酶I特异性抑制剂SC-560和环氧合酶2特异性抑制剂NS398进行了测试。SC560可以显著逆转9顺式维甲酸对干扰素表达的抑制作用，而NS398没有对其起作用(如图7D所示)，最后，为了使结果更加合理，原发性骨髓源性巨噬细胞敲除环氧合酶I后给予RXR阻断剂和激动剂。在野生型细胞中，9顺式维甲酸显著抑制干扰素I和干扰素4的表达，而在环氧合酶I敲除的巨噬细胞中没有相同的变化(如图7F所示)，在野生型以及环氧合酶I敲除的骨髓源性巨噬细胞中也可以得到同样的结果。以往的研究表明，前列腺素E2，是一种由环氧合酶I催化花生四烯酸的产物，它可以在TLR配体刺激时对巨噬细胞以及浆细胞样树突细胞中均抑制I型干扰素的表达。(Fabricius等2010 ;Xu等2008)，因此我们9顺式维甲酸处理组检测其细胞上清液中前列腺素E2的表达。9顺式维甲酸过夜处理的细胞提取其上清液，其前列腺素E2的表达显著提高(如图14E-F所示)。总而言之，这些结果表明，环氧合酶I调节RXR对抗病毒基因表达的抑制作用。我们的研究表明干扰素调节因子3除了可以直接诱导I型干扰素，也可以间接通过减轻RXR-COXl依赖性抑制通路来激活I型干扰素的转录。
[0090]综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0091]上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1.RXR在筛选用于治疗由于鼠的Y -疱疹病毒68易感引起的疾病的药物中的用途。2.如权利要求1所述RXR在筛选用于治疗由于鼠的Y-疱瘆病毒68易感引起的疾病的药物中的用途，其特征在于，所述用途为鼠的Y-疱疹病毒易感细胞模型构建中的用途。3.如权利要求2所述RXR在筛选用于治疗由于鼠的Y-疱疹病毒68易感引起的疾病的药物中的用途，其特征在于，所述易感细胞模型为胚胎癌细胞模型。4.如权利要求3所述RXR在筛选用于治疗由于鼠的Y-疱疹病毒易68感引起的疾病的药物中的用途，其特征在于，所述细胞模型为癌细胞模型。5.RXR的过度表达所引起的鼠的Y-疱疹病毒68胚胎癌细胞模型的构建方法，所述方法具体为:对野生型RXR和缺乏F9胚胎癌细胞预处理，给予注射鼠的Y-疱疹病毒68(*PFU/ μ L)，再通过噬菌斑实验计数上清液中不同特定时间点的病毒滴度。
【专利摘要】本发明涉及生物医药领域，特别是涉及RXR在筛选用于治疗由于鼠的γ-疱疹病毒68易感引起疾病的药物中的用途。本发明发明人提供了RXR在筛选用于治疗鼠的γ-疱疹病毒68易感引起疾病的药物中的用途以及RXR过度表达所引起的鼠的γ-疱疹病毒68易感细胞模型的构建方法，并发现COX感受通路以RXR依赖的方式在对于鼠的γ-疱疹病毒68的宿主防御中起着关键性的作用，且进一步证实了RXR在筛选用于治疗水泡型口炎病毒、鼠的γ-疱疹病毒68和1型单纯疱疹病毒易感引起疾病的药物中的用途。
【IPC分类】C12N5/09, C12Q1/70, C12R1/93, C12Q1/02
【公开号】CN105586435
【申请号】CN201410565856
【发明人】田晓丽
【申请人】宁波美丽人生医药生物科技发展有限公司
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2014年10月21日