啶-5-基硼酸
[0212]将2-氯啼啶-5-基硼酸4a( 765mg，4 · 83mmol)，哌嗪-1-甲酸叔丁酯（900mg， 4.83mmol)，碳酸钾（2g，14.5mmo 1)溶解于8mL的N，N-二甲基乙酰胺中，加热至90°C，搅拌反 应18小时。反应液冷却至室温，加入20mL水，滴加0.5M的盐酸至反应液pH为5用，用乙酸乙酯 萃取(20mLX3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到粗品标题产物2-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基）嘧啶-5-基硼酸4b(l .49mg，淡黄色固体），产物不经纯化直 接进行一步反应。
[0213] 第二步
[0214] 4-(5-(4-甲基-5-羰基-2,5-二氢呋喃-3-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
[0215] 将粗品2-(4-(叔丁氧基羰基）哌嗪-卜基）嘧啶-5-基硼酸4b(370mg，l·20mmol)，4- 羟基-3-甲基咲喃-2(5H)-酮（246mg， 1 mmol，米用公知的方法 "Tetrahedron Letters，52 (11)，1202-1204;201Γ制备而得），碳酸钠（212mg，2mmol)溶解于8.2mL二氧六环和水(V:V =40:1)的混合溶剂中，加入四（三苯基膦)钯（116mg，0. lmmo 1)，加热至110°C，搅拌反应15 小时。反应液冷却至室温，过滤，滤液减压浓缩，用薄层色谱法以展开剂体系A纯化所得残余 物，得到标题产物4-(5-(4-甲基-5-羰基-2,5-二氢呋喃-3-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔 丁酯4(：(221.511^，白色固体），产率 :61.5%。
[0216] 第三步
[0217] 3-甲基-4-(2-(哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)呋喃-2(5H)_酮
[0218] 将4-(5-(4-甲基-5-羰基-2，5_二氢呋喃-3-基）嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯4c (221.5mg，0.615mmol)溶解于10mL二氯甲烷中，加入3mL三氟乙酸，搅拌反应2小时。反应液 减压浓缩蒸干，加入10mL二氯甲烷溶解，反应液减压浓缩，得到粗品标题产物3-甲基-4-(2-(哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)呋喃-2(5H)_酮4d(160mg，淡黄色固体），产物不经纯化直接进行下 一步反应。
[0219] 第四步
[0220] (R)-5-(l-羟基-2-(4-(5-(4-甲基-5-羰基-2，5_二氢呋喃-3-基）嘧啶-2-基）哌 嗪-1-基）乙基)-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)_酮
[0221] 将粗品3-甲基-4-(2-(哌嗪-1-基）嘧啶-5-基）呋喃-2 (5H)-酮4d( 157.4mg， 0.6mmol)溶解于6mL乙腈中，加入(R)-4-甲基-5-(环氧乙烧-2-基）异苯并咲喃-1 (3H)_酮 (11511^，0.6111111〇1，采用专利申请"102010129379"公开的方法制备而得）和三乙胺（91.811^， 0.91mmol )，搅拌反应15小时。反应液减压浓缩，用高效液相色谱法纯化所得残余物，得到标 题产物(R) -5- (1 -羟基-2- (4- (5- (4-甲基-5-羰基-2，5-二氢呋喃-3-基）嘧啶-2-基）哌嗪- 1-基）乙基)-4-甲基异苯并呋喃-1(3!〇-酮4(711^，白色固体），产率:2.6%。
[0222] MS m/z(ESI):451.3[M+1]
[0223] 4 NMR(400MHz，CDC13):S8.48(s，2H),7.84-7.80(m，2H),5.34-5.16(m，4H),5.02 (d，2H)，4.06-3.97(m，4H)，2.88-2.86(m，2H),2.62-2.51(m，4H)，2.42(s，3H)，2.14(s，3H).
[0224] 实施例5
[0225] (R)-5-(2-(4-(6_(lH-四氮唑-1-基）哒嗪-3-基）哌嗪-1-基)-1-甲氧基乙基)-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)_酮
[0226]
[0227] 将(R)-5-(2-(4-(6_(lH-四氮唑-1-基)哒嗪-3-基）哌嗪-1-基)-1-羟乙基)-4-甲 基异苯并咲喃 _1(3H)_酮l(50mg，0.118mmol)溶解于5mL N，N-二甲基甲酰胺中，降温至0°C， 加入氢化钠(5mg，0.13mmol)，搅拌30分钟，再加入碘甲烧（18mg，0.13mmol)，升至室温，搅拌 反应1小时。加水淬灭，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓 缩，用薄层色谱法以展开剂体系A纯化所得残余物，得到标题产物(R)-5-(2-(4-(6-(lH-四 氮唑-1-基)哒嗪-3-基)哌嗪-1-基)-1-甲氧基乙基)-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)_酮5(12mg， 黄色固体），产率:23.5%。
[0228] MS m/z(ESI):437.4[M+1]
[0229] ΧΗ NMR(400MHz,DMS0-d6)：5l0.20(s,lH),8.04(d,lH),7.74-7.61(m,3H),6.60(s, 1Η),5.43(s,2H),5.20-5.17(m,lH),3.74-3.71(m,3H),3.20(s,3H),2.70-2.45(m,6H), 2.32(s,3H).
[0230] 测试例：
[0231 ] 生物学评价
[0232] 测试例1、本发明化合物对人(human)ROMK和大鼠 (rat)ROMK抑制活性的测定
[0233] 以下方法用来测定本发明中化合物对人R0MK、大鼠 R0MK活性的抑制作用
[0234] 1、实验材料及仪器
[0235] (l)FluxOR? 钾离子通道检测（potassium ion channel assay)(F10016， invitrogen)
[0236] (2)乌本苷(03125_lG，sigma)
[0237] (3)flexstation 3酶标仪(MD)
[0238] (4)人R0MK/HEK293细胞:转染有人R0MK cDNA(NCBI序列号:NM_000220 · 4)与稳定 表达R0MK通道的HEK293细胞系
[0239] (5)大鼠 R0MK/HEK293细胞:转染有大鼠 R0MK cDNA(NCBI序列号:ΝΜ_017023.1)与 稳定表达R0MK通道的HEK293细胞系
[0240] (6)HEK293细胞系：中国科学院细胞库，GNHu43
[0241] 2、实验步骤
[0242] 实验中所用试剂除ddH20,乌苯甘外均来自FluxOR?钾离子通道检测这个试剂盒， 配制方法也参照试剂盒说明书
[0243] (1)提前一天在 roL(Poly-D-lysine)包被的板子中铺人 R0MK/HEK293 细胞，20000 个/孔；
[0244] (2)过夜培养后倒掉板中的培养基，按照FluxOR?钾离子通道检测要求操作，加入 1〇〇μL7孔染料，室温孵育90分钟；
[0245] (3)然后倒掉染料，每孔加入100yL含乌本苷(300μΜ)和丙磺苏的检测缓冲液；
[0246] (4)再加入lyL化合物或DMS0到对应的反应孔中，在震荡仪上震荡30s，室温孵育30 分钟；
[0247] (5)上flexstation3酶标仪，由机器加入25μ!7孔刺激缓冲液（K2S〇4:Tl 2S〇4: lXFluxOR Chloride-free Buffer:ddH20 = 3:12:40:125)，立刻在EX/EM为490/525nm处连 续读值5分钟；
[0248] (6)经软件处理数据得到化合物对人R0MK这一离子通道的IC5〇值。
[0249] 重复以上实验步骤，将人R0MK/HEK293细胞替换成大鼠 R0MK/HEK293细胞，测试化 合物对大鼠 R0MK离子通道的IC5〇值。
[0250] 本发明化合物对人R0MK或大鼠 R0MK的抑制活性通过以上的试验进行测定，测得的 IC50值见表1。
[0251] 表1化合物对人R0MK或大鼠 R0MK蛋白活性抑制的IC50
[0252] ___
[0253] 结论:本发明的化合物对人R0MK或大鼠 R0MK蛋白活性具有明显的抑制效果。
[0254] 测试例2、本发明化合物对hERG抑制活性的测定
[0255] 以下方法用来测定本发明中化合物对hERG活性的抑制作用
[0256] 1、实验材料及仪器
[0257] (1 )FluxOR? 钾离子通道检测（F10016，invitrogen)
[0258] (2)乌本苷（03125_lG，sigma)
[0259] (3)flexstation 3酶标仪(MD)
[0260] (4)CH0细胞系：丹麦Sophion Bioscience公司
[0261] (5)hERG/CH0细胞：转染有人hERG cDNA(NCBI序列号：M1_000238(RC215928， origene))与稳定表达hERG通道的CH0细胞系
[0262] 2、实验步骤
[0263] 实验中所用试剂除ddH20,乌苯甘外均来自FluxOR?钾离子通道检测这个试剂盒， 配制方法也参照试剂盒说明书
[0264] (1)提前一天在 roL(Poly-D-lysine)包被的板子中铺 humanhERG/CHO 细胞，20000 个/孔；
[0265] (2)过夜培养后倒掉板中的培养基，按照FluxOR?钾离子通道检测要求操作，加入 1〇〇μL7孔染料，室温孵育90分钟；
[0266] (3)然后倒掉染料，每孔加入100yL含乌本苷(300μΜ)和丙磺苏的检测缓冲液；
[0267] (4)再加入lyL化合物或DMS0到对应的反应孔中，在震荡仪上震荡30s，室温孵育30 分钟；
[0268] (5)上flexstation3酶标仪，由机器加入25μ!7孔刺激缓冲液（K2S〇4:Tl 2S〇4: lXFluxOR Chloride-free Buffer:ddH20 = 3:12:40:125)，立刻在EX/EM为490/525nm处连 续读值5分钟；
[0269] (6)经软件处理数据得到化合物对hERG这一离子通道的IC5〇值。
[0270] 本发明化合物对hERG的抑制活性通过以上的试验进行测定，测得的IC5Q值见表2。
[0271] 表2化合物对hERG蛋白活性抑制的IC50
[0272]
[0273] 结论:本发明的化合物对hERG蛋白活性的抑制作用弱，对心脏毒性低。
[0274] 测试例3、电生理手动膜片钳检测对hERG钾离子通道的作用
[0275] 1、实验目的
[0276] 本实验的目的是为了检测化合物在离体实验中对CH0细胞中hERG钾离子通道的影 响。hERG钾离子通道稳定地表达在本发明的CH0细胞上。在钾离子电流稳定后，比较不同化 合物浓度应用前后钾离子电流的大小，可以得到化合物对钾离子通道的影响。
[0277] 2、实验试剂和材料
[0278] (1)CH0细胞系：丹麦Sophion Bioscience公司；
[0279] (2)hERG/CH0细胞：转染有人hERG cDNA(NCBI序列号：M1_000238(RC215928， origene))与稳定