一种稠环化合物、其制备方法和应用及其中间体化合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种稠环化合物、其制备方法和应用及其中间体化合物。该化合物可以用作磷脂酰肌醇3?激酶的抑制剂。
【专利说明】
一种稠环化合物、其制备方法和应用及其中间体化合物
技术领域
[0001] 本发明属于药物化学领域，具体而言，涉及一种稠环化合物以及它们的制备方法 和其作为磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂的用途。本发明同时涉及该化合物的中间体化合物。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康的重大疾病。临床上应用的大部分小分子抗肿 瘤药物或是影响DNA的结构和功能、或是干扰核酸的合成与修复、或是抑制某种管家蛋白 (如微管蛋白）的合成与功能，因而具有普遍的细胞毒性，临床应用中存在毒副作用大、易产 生耐药性等缺点。
[0003] 分子靶向药物的出现是抗肿瘤药物发展史上的里程碑式事件。这类药物作用于肿 瘤细胞的特定分子靶标，对肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为具有抑制作用从 而产生抗肿瘤作用。这些分子靶标在肿瘤组织中特异性表达或过高表达，而在正常组织中 不表达或常规表达，因此分子靶向药物一般能够选择性地杀伤肿瘤细胞或抑制其生长增 殖，而对正常细胞的毒性作用较小。寻找和开发新的分子靶向药物，代表了肿瘤精准治疗的 发展方向。
[0004] 大量研究结果表明，人体内肿瘤的发生和发展与PI3K/Akt/mT0R信号通路的调节 和异常活化密切相关。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是磷脂 激酶家族中的一个重要成员，它能特异性地催化磷脂酰肌醇3位羟基的磷酸化，是PI3K/ Akt/mTOR信号通路上的关键位点，对细胞的增殖、生存和代谢等起关键作用。
[0005] PI3K依其结构特征、活化机制和底物选择的不同，可分为I、II、III三种类型。由于 迄今为止功能研究最多的是I型PI3K，因此通常所说的PI3K就是指I型PI3K。〗型PI3K依其调 节亚基和上游调节分子的不同又分为IA和IB两个亚类。IA亚类PI3K可被各种受体酪氨酸激 酶和Ras激活，包括ΡΙ3Κα、ΡΙ3Κβ和ΡΙ3Κδ三个亚型，分别由各自的催化亚基pi 10与调节亚基 ρ85组成。IB亚类PI3Κ主要被G蛋白耦联受体激活，仅ΡΙ3Κ γ -个亚型，它由催化亚基ρ 110 γ 和调节亚基ρ 101或ρ84组成。
[0006] 以上四种亚型的ΡΙ3Κ在体内的分布有所不同：ΡΙ3Κα和ΡΙ3Κβ在各种器官均有表 达，而ΡΙ3Κδ和ΡΙ3Κ γ主要分布在骨髓细胞中。四种亚型ΡΙ3Κ的功能也有所不同：ΡΙ3Κα与肿 瘤的关系最为密切，编码PllOa的基因 PIK3CA的突变、扩增和过表达广泛存在于多种恶性肿 瘤中，因此，ΡΙ3Κα被认为在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用，此外还有研究表明ΡΙ3Κα 与胰岛素信号传导和葡萄糖代谢有关;ΡΙ3Κβ可激活血小板，因此在血栓性疾病的发展中起 着重要的作用，此外，ΡΙ3Κβ近年来被报道在PTEN缺失的癌症患者中起着比ΡΙ3Κα还重要的 作用;ΡΙ3Κδ和ΡΙ3Κ γ与炎症和免疫等有密切的关系。
[0007] 由于ΡΙ3Κ与癌症等疾病的密切关系，以ΡΙ3Κ为靶标的抑制剂的开发受到了国际制 药界的高度重视。
[0008] 第一个报道的ΡΙ3Κ合成抑制剂是LY294002,它对I类ΡΙ3Κ的抑制活性达微摩尔级， 对PI3Ka的IC5q值达0.63μΜ，在动物体内实验中也显示了一定的抗肿瘤作用，但由于安全性、 稳定性等原因，未能进入临床试验。
[0009]
[0010] 随着PI3K晶体结构的阐明，PI3K抑制剂的药物设计和发现得到了快速推进，目前 已有多种具有不同结构的PI3K抑制剂陆续被报道，包括嘧啶类、噻吩并嘧啶类、喹唑酮类、 双烯酮类、咪唑并喹啉类、咪唑并吡啶类、苯并吡啶类及其他分子骨架化合物。
[0011] 嘧啶类、噻吩并嘧啶类及其衍生物：
[0012] GDC-0941 是由 Genentech 公司开发的一种泛 PI3K 抑制剂，其对 pll〇a、pl 1〇β、ρ110 δ、ρ110 γ的IC5q分别为31^、331^、31^、751^。〇)(：-0941的临床1期试验结果表明其在乳腺癌、
[0014] BKM120是由Novartis公司开发的一种2,4_双吗啉取代嘧啶类的泛PI3K抑制剂，其 对口110〇、？11(^、？11(^、？110丫的比5()分别为5211]\1、16611]\1、11611]\1、26211]\1，用于治疗转移性乳 腺癌的研究正处于III期临床。 卵巢；癌》爾伍查癒串去由且右檢辟的祐日*癒任_ it曰耐疼_f生较好。
[0013]
[0015]
[0016] 喹唑酮类及其类似物：
[0017] IC-87114是一种选择性ΡΙ3Κδ抑制剂，其对ΡΙ3Κδ的IC5q为0.5μΜ，较之于对ΡΙ3Κα、 ΡΙ3Κβ、ΡΙ3Κ γ的抑制活性，选择性高达58到100倍。
[0018]
[0019] CAL-101 (Idelalisib)也是一种选择性 ΡΙ3Κδ 抑制剂，其对 ρΙΙΟδ 的 IC5q为 2 ·5ηΜ，较 之于对？110€[、？11(^、？110丫的抑制活性，选择性高达40到300倍。基于？131^在炎症中的重 要作用，最初关于CAL-101的药理研究集中在其抗炎和治疗自身免疫性疾病上。后来基于 ΡΙ3Κδ主要在骨髓细胞中表达，对CAL-101的药理研究转移到对白血病和淋巴瘤的治疗上。 在多个临床试验结果的支持下，美国Π )Α于2014年7月批准了Idelalisib三个适应症:与利 妥昔单抗(Rituxan)联合治疗复发的慢性淋巴细胞白血病、作为单药治疗复发性滤泡B细胞 非霍奇金淋巴瘤和复发性小淋巴细胞淋巴瘤。
[0020]
[0021]双烯酮类及其类似物：
[0022] ?乂866是一种双烯酮类的泛？131(抑制剂，其对？131(€[、？13狀、？131(丫的1(： 5()分别为 6ηΜ、3ηΜ、9ηΜ。目前处于I/II期临床试验中。
[0023]
[0024] 咪唑并喹啉类、咪唑并吡啶类及其类似物：
[0025] BAY80-6946是Bayer公司开发的一种高活性的泛PI3K抑制剂，其对ΡΙ3Κα、ΡΙ3Κβ、 P13Κδ、P13Κ γ的IC5Q分别为0 · 5ηΜ、3 · 7nM、0 · 7ηΜ、6 · 4ηΜ。目前处于II期临床试验中。
[0026]
[0027] PIK75为咪唑并吡啶衍生物，是一种选择性ΡΙ3Κα抑制剂，其对ρ11〇α、ρ11〇β、ρ11〇 δ、ρ110γ 的IC5Q分别为5·8ηΜ、1·3μΜ、0·51μΜ、76ηΜ。
[0028]
[0029]苯并吡啶类及其衍生物：
[0030] CN103788071A要求保护下述通式化合物，部分化合物显示了较高的体外增殖抑制
作用。
[0031]
[0032]
[0033] XL147是一种选择性PI3K抑制剂，其对ΡΙ3Κα、ΡΙ3Κβ、ΡΙ3Κδ、ΡΙ3Κγ 的IC5q分别为 39ηΜ、383ηΜ、36ηΜ、23ηΜ。
[0034]
[0035] PCT/US2009/045713公开了下述通式化合物或其药学上可接受的盐：
[0036]
[0037] 具体公开了 137个化合物，包括：
[0038] N-( 2-氯-5-( 3-甲氧基-6喹啉基)-3-吡啶基)-4-氟苯磺酰胺；
[0039] N-(2-氯-5-(4-苯氧基-6-喹啉基)-3-吡啶基）甲磺酰胺；
[0040] N-(2-氯-5-(6-喹啉基)-3-吡啶基)-4-氟苯磺酰胺）；
[0041] N-( 2-甲氧基-5-( 4-吗啉基喹啉-6-基)吡啶-3-基）甲磺酰胺等。
[0042] PI3K小分子抑制剂作为新一类的分子靶向药物，潜力巨大，前景广阔。因此，需要 更多结构新颖、生物活性高、成药性良好的PI3K抑制剂，用于肿瘤的靶向治疗，以及用于抗 炎或治疗自身免疫性疾病。
【发明内容】
[0043]本发明提供了一种新型的PI3K选择性抑制剂。具体而言，本发明提供了一种由以 下通式（I)表示的稠环化合物或其药学上可接受的盐：
[0044]
[0045]其中，X表示0、S、NR、SO2或NH2Cl，R选自 H、C1-6的烷基，优选C1-4的烷基，Ri、R2、R 3、R4、 尺5、1?6、办、1?8为独立地选自由11、(：1-6的烷基、或具有0!1取代基的(： 1-6的烷基，优选为!1、(：1-4的烷 基或具有OH取代基的&-4的烷基。Ri、R 2、R3、R4、R5、R6、R7、R 8为独立地选自由H、Ci-6的烷基、或 具有OH取代基的Ck的烷基。
[0046]具体而言，本发明可以选自以下化合物或其药学上可接受的盐：
[0057] 其他化合物的结构可以参照以上化合物进行解释。
[0058] 本发明同时提供了包含上述化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。本发明 稠环化合物或其药学上可接受的盐或所述的药物组合物可以有效地抑制PI3K的活性。 [0059]所述化合物或其药学上可接受的盐，或所述药物组合物作为PI3K抑制剂，可以作 为抗肿瘤药物用于脑癌、头颈癌、食管癌、肺癌、肝癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠 癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、白血病、骨髓异常增生综合症、肉瘤、骨肉瘤或横纹 肌瘤等肿瘤的治疗。
[0060]所述化合物或其药学上可接受的盐，或所述药物组合物作为PI3K抑制剂，可以作 为抗炎药物用于慢性阻塞性肺病、哮喘等疾病的治疗。
[0061] 所述化合物或其药学上可接受的盐，或所述药物组合物作为PI3K抑制剂，可以作 为治疗自身免疫性疾病(例如风湿性关节炎、银肩病、系统性红斑狼疮)的药物。
[0062] 本发明的化合物可以通过以下方法制备。所述方法包括使式（ΙΙΓ)的化合物与式 (IV)的化合物反应，得到式(I)的化合物的步骤：
[0063]
[0064] 其中X、R1、R2、R3、R4、R5、R 6、办和心如前文所定义。
[0067] 本发明还提供了一种式(I)的化合物的制备方法，所述方法包括使式(IV'）的化合 物与式(ΠI)的化合物反应，得到式(I)的化合物的步骤：
[0065] 所述方法还包括使式(II)的化合物与式(III)的化合物反应得到式(ΙΙΓ)的化合 物白勺来藤.
[006d
[0068]
[0069] 其中父、1^、1?2、1?3、1?4、1?5、1? 6、1?7和1?8如前文所定义。
[0070] 所述方法还包括使式(II)的化合物与式(IV)的化合物反应得到式(IV'）的化合物 的步骤，
[0071]
[0072] 通过上述方法，能够以高产率得到所需化合物。
[0073] 另外，本发明还提供了一种式(ΙΙΓ)的化合物或式(IV'）的化合物，
[0074]
[0075] 其中乂、1^、1?2、1?3、1?4、1^、1?6、办和1? 8如前文所定义。式(111'）的化合物或式（1￥'）的化 合物可以用作合成式(I)的化合物的原料或中间体。
[0076] 发明人通过大量探索及试验验证，在稠环上特异性的引入氰基，与没有氰基的化 合物以及氰基用其他取代基代替的化合物相比，本发明得到的上述化合物或其药学上可接 受的盐具有出乎预料的、非显而易见对PI3K的抑制活性。
【具体实施方式】
[0077] 以下实施例中使用的原料、试剂均为市购。
[0078] 实施例1:Ν-(5-(3-氰基-4-硫代吗啉基喹啉-6-基)-2_甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰 胺(化合物3)
[0079]
[0080] 步骤I :N-(5-(4-氯-3-氰基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲烷磺酰胺
[ΠΠΗ11
123 将6-溴-4-氯喹啉-3-甲腈（140mg，0 · 6mmol)，N-(2-甲氧基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基）吡啶-3-基）甲磺酰胺(203mg，0 · 618mmol，1 · 03eq)和2N碳酸 钾水溶液(0. 9mL，1.8mmo I，3. Oeq)于二氧六环(6mL)中的混合物脱气，并加入二(三苯基膦） 二氯化钯（2Img，0.03mmol，0.05eq)。将产生的反应混合物脱气并回充氩气(三个循环），然 后在100 °C下氩气气氛中搅拌7小时。将反应混合物冷却至室温，用水(30mL)稀释，乙酸乙酯 萃取(30mLX3)。合并有机层并用食盐水(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，经快速 柱色谱(硅胶，二氯甲烷/甲醇=350:1，v/v)纯化得到黄色固体(82mg，产率35 % )。 2 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)59.47(s,lH),9.21(s,lH),8.55(d,J = 2.2Hz,lH),8.44 (d ,J=1.6Hz,lH) ,8.39(dd ,J = 8.8,1.6Hz,lH) ,8.29(d ,J = 8.8Hz , 1H) ,8.09(d ,J = 2.2Hz, lH),4.01(s,3H),3.13(s,3H). 3 步骤2: N-( 5-( 3-氰基-4-硫代吗啉基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺
[0085]
[0086] 将N-(5-(4-氯-3-氰基喹啉-6-基）-2-甲氧基吡啶-3-基）甲烷磺酰胺（156mg， 0.4mmol)溶于NMP(5mL)中，加入碳酸钟（83mg，0·6mmol，I · 5eq)和硫代吗琳（62mg，0 ·6mmol, 1.5eq)。将产生的反应混合物在100°C下搅拌2小时。冷却反应混合物，用水(30mL)稀释反应 混合物，乙酸乙酯(20mL X 3)萃取。合并有机层，依次用水(20mL)和食盐水（I OmL)洗涤，无水 硫酸钠干燥，过滤，浓缩，经快速柱色谱（硅胶，DCM/MeOH= 100 :1，v/v)纯化得白色固体 (63mg，产率为 34.6%)。
[0087] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)59.44(s,lH),8.81(s,lH),8.50(s,1H),8.25-8.15(m, 2H),8.13-8.03(m,2H),4.01(s,3H),3.88(br s,4H),3.13(s,3H),2.95(br s,4H).
[0088] 实施例2:
[0089] N-(5-(3-氰基-4-吗啉基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺(化合物6)
[0090]
[0091]
[0092]
[0093] 将6_漠_4_氣-卩奎琳_3_甲臆（535mg，2 .Ommol)和吗琳（523mg，6 .Ommol，3eq)于二氧 六环(7.5mL)中、在100°C下搅拌。反应结束后真空浓缩，浓缩液用水(20mL)稀释，乙酸乙酯 (2〇11^\3)萃取。合并有机层，依次用水（2〇11^)和食盐水（2〇11^)洗涤，无水硫酸钠干燥，过 滤，浓缩，经快速柱色谱(硅胶，石油醚/乙酸乙酯= 3:1，v/v)纯化得到黄色固体(556mg，产 率为 87.4%)。
[0094] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)58.81(s,lH),8.20(d,J = 2.0Hz,lH),7.99(dd,J = 8.8, 2.0Hz,lH),7.93(d ,J = 8.8Hz,lH),3.87(t ,J = 4.4Hz,4H),3.68(t ,J = 4.4Hz,4H).
[0095] 步骤2: N_( 5-( 3-氰基-4-吗啉基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺
[0096]
[0097] 将6-溴-4-吗啉基喹啉-3-甲腈(96mg，0 · 3mmol)，N-(2-甲氧基-5-(4，4，5，5-四甲 基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶-3-基）甲磺酰胺（118mg，0.36mmol，1.2eq)和2N碳酸 钾水溶液(〇. 45mL，3. Oeq)于二氧六环(4mL)中的混合物脱气，然后加入[I，1 '-双(二苯基膦 基)二茂铁]二氯化钯（1111^，0.015111111〇1，0.0569)。将产生的反应混合物脱气并回充氩气(三 个循环），然后在l〇〇°C下氩气气氛中搅拌5小时。将反应混合物冷却至室温，用（30mL)水稀 释，用乙酸乙酯（30mL X 3)萃取。合并有机层并用食盐水（30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过 滤，浓缩，经快速柱色谱(硅胶，二氯甲烷/甲醇= 200:1，v/v)纯化得到白色固体（104mg，产 率为 78.9%)。
[0098] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)59.45(s,lH),8.79(s,lH),8.48(d,J = 2.4Hz,lH),8.20 (d ,J=1.6Hz,lH) ,8.18(dd ,J = 8.6,2.0Hz,lH) ,8.08(d ,J = 8.6Hz , 1H) ,8.05(d ,J = 2.4Hz, lH),4.00(s,3H),3.91(t ,J = 4.4Hz,4H),3.73(t ,J = 4.4Hz,4H),3.13(s,3H).
[0099] 实施例3 :N-(5-(3-氰基-4-(2,6-二甲基吗啉基）喹啉-6-基）-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺(化合物2)
[0100]
[0101] 制备方法如实施例1，步骤2)中将N-(5-(4-氯-3-氰基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶- 3-基）甲烷磺酰胺
￡室温下反应。
[0102] 1H NMR(400MHz,DMS0)59.42(s,1H) ,8.76(s,lH) ,8.45(d,J = 2.0Hz, 1H) ,8.26-8.14(m,2H) ,8.12-8.01 (m,2H),4.00(s,3H),3.99-3.90(m,2H),3.85(d J= 12.4Hz ,2H), 3.29-3.18(m,2H),3.13(s,3H),1.17(d ,J = 6.1Hz,6H).
[0103] 实施例4:N-(5-(3-氰基-4-(4-甲基哌嗪-I-基)喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基） 甲磺酰胺(化合物1)
[0104]
123 制备方法如实施例1，其中步骤2)将N-(5_(4-氯-3-氰基喹啉-6-基)-2_甲氧基吡 啶-3-基）甲烷磺酰胺与N-甲基哌嗪在室温下反应。 2 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.42(s，lH)，8.75(s，lH)，8.44(d，J = 2.2Hz，lH)，8.19 (d J= 1.6Hz, 1H) ,8.16(dd ,J = 8.8,1.6Hz,0H) ,8.06(d ,J = 8.8Hz , 1H) ,8.04(d ,J = 2.2Hz, lH),4.00(s,3H),3.72(br s,4H),3.13(s,3H),2.65(br s,4H),2.31(s,3H). 3 实施例5: (R)-N-(5-(3-氰基-4-(3-甲基吗啉基）喹啉-6-基）-2-甲氧基吡啶-3- 基）甲磺酰胺(化合物4)
[0108]
[0109] 制备方法如实施例1，其中步骤2)将N-(5-(4-氯-3-氰基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡 啶-3-基）甲烷磺酰胺?
i在同样条件下反应。
[0110] 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.45(s，lH)，8.89(s，lH)，8.49(d，J = 2.4Hz，lH)，8.33 (d J= 1.6Hz, 1H) ,8.23(dd ,J = 8.8,2.0Hz,lH) ,8.13(d ,J = 8.8Hz , 1H) ,8.06(d ,J = 2.4Hz, 1H),4.18-4.05(m,2H),4.01(s,3H),4.00-3.93(m,1H),3.92-3.82(m,1H),3.82-3.73(m, lH),3.63(dd J = 10.8,4.0Hz,lH),3.30-3.26(m,lH),3.13(s,3H),l.ll(d ,J = 6.4Hz,3H).
[0111] 实施例6: (S)-N-(5-(3-氰基-4-(3-甲基吗啉基）喹啉-6-基）-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺(化合物5)
[0112]
[0113] 制备方法如实施例1，其中步骤2)将N-(5-(4-氯-3-氰基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡 啶-3-基）甲烷磺酰胺与
生同样条件下反应。
[0114] 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.45(s，lH)，8.89(s，lH)，8.49(d，J = 2.4Hz，lH)，8.32 (d J= 1.6Hz, 1H) ,8.23(dd ,J = 8.8,2.0Hz,lH) ,8.13(d ,J = 8.8Hz , 1H) ,8.06(d ,J = 2.4Hz, 1H) ,4.18-4.05(m,2H) ,4.01(s,3H) ,4.00-3.93(m,lH) ,3.93-3.72(m,2H) ,3.63(dd J = 11.2,4.0Hz,lH),3.30-3.26(m,lH),3.14(s,3H),l.ll(d,J=6.4Hz,3H).
[0115] 实施例7:N-(5-(3-氰基-4-((23,61〇-2,6-甲基吗啉基)喹啉-6-基)-2-甲氧基吡 啶-3-基）甲磺酰胺(化合物56)
[0116]
[0117] 制备方法如实施例1，其中，步骤2)将N_(5-(4-氯-3-氰基喹啉-6-基)-2_甲氧基吡 啶-3-基）甲烷磺酰胺』
E同样条件下反应。
[0118] 1H NMR(500MHz,DMS0-d6)59.42(s,lH),8.77(s,lH),8.45(s,1H),8.22-8.15(m, 2H) ,8.11-7.99(m,2H) ,4.00(s,3H),3.98-3.91 (m,2H),3.85(d J= 12.5Hz ,2H),3.23(t J = 11.5Hz,2H),3.13(s,3H),1.17(d ,J = 6.0Hz,6H).
[0119] 实施例8:N-(5-(3-氰基-4-(1， 1-二氧代硫代吗啉基)喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺(化合物67)
[0120]
[0121 ] 制备方法如实施例1，其中，步骤2)将N_(5-(4-氯-3-氰基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡 啶-3-基）甲烷磺酰胺』
￡同样条件下反应。
[0122] 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.44(s，lH)，8.88(s，lH)，8.59(d，J = 2.0Hz，lH)，8.33 (d J= 1.6Hz, 1H) ,8.20(dd ,J = 8.8,1.6Hz,lH) ,8.13(d ,J = 8.8Hz , 1H) ,8.08(d ,J = 2. OHz, lH),4.05(br s,4H),4.01(s,3H),3.56(br s,4H),3.13(s,3H).
[0123] 实施例9:N-(5-(3-氰基-4-(哌嗪-I-基)喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰 胺(化合物68)
[0124]
[0125] 按照实施例1的方法制备中间体4-(3-氰基-6-(6-甲氧基-5-(甲磺酰胺基）吡啶_ 3-基)喹啉-4-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯，再使用盐酸甲醇溶液脱除Boc基团得到化合物68。
[0126] 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.63(br s，2H)，9.46(s，lH)，9.00(s，lH)，8.54(d，J= 2.2Hz,lH) ,8.27(dd ,J = 8.8,1.6Hz,lH) ,8.23(d ,J=1.6Hz,lH) ,8.17(d ,J = 8.8Hz , 1H), 8.08(d ,J = 2.2Hz,lH),4.01(br s, 7H), 3.46(br s,4H) ,3.14(s,3H).
[0127] 实施例10其余化合物制备方法如实施例1，差别在于步骤2中采用下述表1中的原 料替换硫代吗啉。
[0128] 表1
[0133] 对比例化合物：
[0134] 对比例1化合物:N-(2-甲氧基-5-(4-吗啉基喹啉-6-基)吡啶-3-基）甲磺酰胺
[0135]
123456 步骤1:4-(6-溴喹啉-4-基)吗啉 2 将6_漠 _4_氣-卩奎琳（243mg，1 · Ommol)和吗琳（523mg，6 · Ommol，6eq)于二氧六环 (3mL)中的溶液在110 °C下搅拌48小时。在真空中浓缩反应混合物冷却至室温，用水(20mL) 稀释，用乙酸乙酯（20mL X 3)萃取。用水(20mL)和食盐水(20mL)洗涤合并的有机层，用无水 硫酸钠干燥，过滤，浓缩。残留物经快速柱色谱(硅胶，二氯甲烷/甲醇=1 〇〇: 1)纯化得到产 物为淡黄色油状物(21 Img，产率为72 % )。 3 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)58.75(d,J = 5.0Hz,lH),8.15(d,J = 2.2Hz,lH) ,7.92(d, J = 8.8Hz,lH) ,7.84(dd,J = 8.8,2.2Hz,lH) ,7.07(d,J = 5.0Hz,lH) ,3.94-3.82(m,4H), 3.20-3.09(m,4H). 4 步骤2:N-(2-甲氧基-5-(4-吗啉基喹啉-6-基)吡啶-3-基）甲磺酰胺 5 将6-溴-4-吗啉基喹啉（105mg，0 · 36mmol)，N-(2-甲氧基-5-(4,4,5,5-四甲基-1, 3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基）吡啶-3-基）甲磺酰胺（14111^，0.43111111〇1，1.26卩)和2~碳酸钾水 溶液(〇. 54mL，1.08mmol，3. Oeq)于二氧六环(4mL)中的混合物脱气，然后加入[I，1 '-双(二 苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（1311^，0.018111111〇1，0.0569)。将产生的反应混合物脱气并回充 氩气（三个循环），然后在l〇〇°C下氩气气氛中搅拌5小时。将反应混合物冷却至室温，用 (30mL)水稀释，用乙酸乙酯（30mL X3)萃取。用食盐水(30mL)洗涤合并的有机层，用无水硫 酸钠干燥，过滤，浓缩。残留物经快速柱色谱(硅胶，二氯甲烷/甲醇=60:1)纯化得到产物为 淡黄色固体(11411^，产率为76.4%)。 6 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)59.42(s,lH),8.72(d,J = 4.9Hz,lH),8.45(d,J = 2.0Hz, 1H) ,8.16(dJ=1.2Hz,lH),8.10-7.98(m,3H),7.04(d,J = 5.0Hz,lH),4.00(s,3H),3.95-3.86(m,4H),3.27-3.19(m,4H),3.13(s,3H).
[0142] 对比例2化合物:N-(5-(3-(二氟甲基)-4-吗啉基喹啉-6-基）-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺
[0143]
[0144] 步骤1:2-(((4-溴苯基)氨基)亚甲基)丙二酸二乙酯
[0145] 将 4-溴苯胺（10.328,60!11111〇1)和2-乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯（12.968,60111111〇1， I.Oeq)的混合物在150°C下搅拌3小时。将反应混合物冷却至室温，用正己烷（IOOmL)稀释。 抽滤收集产生的白色固体，用正己烷（50mL X 2)洗涤，真空中干燥得到产物为白色固体 (19.2g，产率为93.9%)，不作进一步纯化直接用于下一步。
[0146] 步骤2:6-溴-4-羟基喹啉-3-羧酸乙酯
[0147] 将搅拌中的2-(((4-溴苯基)氨基)亚甲基）丙二酸二乙酯（10g，29.2mmol)和二苯 醚（IOOmL)的混合物加热至回流。在其加热至回流的过程中，将氮气缓慢鼓泡进入反应混合 物在，然后在回流过程中在溶剂上方轻轻地吹氮气。将反应混合物回流1小时，然后在氮气 流下冷却至室温。用正己烷（IOOmL)稀释反应混合物，抽滤收集产生的白色固体，用正己烷 (50mLX 3)洗涤，真空中干燥，得到产物为白色固体(7.8g，产率为90%)，不作进一步纯化直 接用于下一步。
[0148] 步骤3:6_溴-4-氯喹啉-3-羧酸乙酯
[0149] 将6-溴-4-羟基喹啉-3-羧酸乙酯（IOg)于三氯氧磷（IOOmL)中的混合物在120 °C下 回流3小时。将反应混合物在真空中蒸发除去三氯氧磷。将残留物倒入冰水中，用饱和碳酸 氢钠水溶液调节pH值至6。用乙酸乙酯（IOOmL X 3)萃取产生的混合物。用食盐水（IOOmL X 2) 洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。残留物经快速柱色谱(硅胶，石油醚/乙 酸乙酯=80:1)纯化得到产物为白色固体(IOg，产率为94.1 % )。
[0150] 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.19(s，lH)，8.53(d，J = 2.0Hz，lH)，8.14(dd，J = 8.9， 2.0Hz,lH),8.11(d ,J = 8.9Hz,lH),4.44(q ,J = 7.1Hz,2H),1.39(t ,J = 7.1Hz,3H).
[0151] 步骤4:6-溴-4-氯喹啉-3-甲醛
[0152] 在_80°C下氩气气氛中，向6-溴-4-氯喹啉-3-羧酸乙酯（I. 573g，5mmol)与无水二 氯甲烷（24mL)中的溶液中滴加 DIBAL-H溶液（1M甲苯溶液，8mL，8mmoI，1.6eq)。将产生的反 应混合物在-80°C下搅拌1小时，然后用甲醇淬灭，用水(20mL)稀释，用二氯甲烷(20mLX3) 萃取。用水(30mL)和食盐水(30mL)洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。残留 物经快速柱色谱(硅胶，石油醚/乙酸乙酯=15:1)纯化得到产物为白色固体（I.075g，产率 为 79.5%)〇
[0153] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)5l0.54(s,lH),9.18(s,lH),8.57(d,J = 2.0Hz,lH),8.19 (dd ,J = 8.8,2.0Hz,lH),8.12(d ,J = 8.8Hz,lH).
[0154] 步骤5:6-溴-4-吗啉基喹啉-3-甲醛
[0155] 将6-溴-4-氯喹啉-3-甲酸（324mg，I · 2mmol)和吗啉（314mg，0 · 314mL，3 · 6mmol， 3. Oeq)于二氧六环（2.5mL)中的混合物在110°C下搅拌2.5小时。用水(30mL)稀释反应混合 物，用乙酸乙酯（20mL X 3)萃取。用水(30mL)和食盐水(30mL)洗涤合并的有机层，用无水硫 酸钠干燥，过滤，浓缩。残留物经快速柱色谱(硅胶，石油醚/乙酸乙酯=5:1)纯化得到产物 为黄色固体(338mg，产率为87.7 % )。
[0156] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)5l0.42(s,lH),8.97(s,lH),8.34(d,J = 2.0Hz,lH),7.97 (dd ,J = 8.8,2.0Hz,lH),7.93(d ,J = 8.8Hz,lH),3.93-3.84(m,4H),3.68-3.57(m,4H).
[0157] 步骤6:4-(6-溴-3-(二氟甲基)喹啉-4-基)吗啉
[0158] 在〇°C下向6-溴-4-吗啉基喹啉-3-甲醛（321mg，I .Ommol)和乙醇（11.6yL， 0 · 2mmol，0 · 2eq)于二氯甲烧（5mL)中的溶液中加入二乙胺基三氟化硫（645mg，526yL， 4. Ommol，4eq)。将产生的反应混合物在0°C下搅拌0.5小时，在室温下搅拌3小时。将反应混 合物倒入冰水中（20mL)，用饱和碳酸氢钠水溶液调节pH至7，用二氯甲烧(20mL X 3)萃取。用 水(30mL)和食盐水(30mL)洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。残留物经快 速柱色谱(硅胶，石油醚/乙酸乙酯=10:1~4:1)纯化得到产物为黄色固体(296m g，产率为 86.3%)〇
[0159] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)58.98(s,lH),8.36(d,J=1.8Hz,lH),8.01(d,J = 9.0Hz, 1H) ,7.97(dd,J = 9.0,1.8Hz,lH),7.53(t,J = 54.4Hz,lH) ,3.91-3.82(m,4H),3.37-3.24 (m,4H).
[0160] 步骤7:N-(5-(3-(二氟甲基)-4-吗啉基喹啉- 6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰 胺
[0161] 将 4-(6-溴-3-(二氟甲基)喹啉-4-基)吗啉(8611^，0.25_〇1)，^(2-甲氧基-5-(4， 4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基）吡啶-3-基）甲磺酰胺（99mg，0.30mmol， 1.4eq)和2N碳酸钾水溶液(0.375mL，0.75mmol，3eq)于二氧六环(4mL)中的混合物脱气，然 后加入PdCl 2(dppf) (13mg，0.0175mmol，0.07eq)。将产生的反应混合物脱气并回充氩气(三 个循环），然后在l〇〇°C下氩气气氛中搅拌5小时。将反应混合物冷却至室温，用水(30mL)稀 释，用乙酸乙酯萃取(30mL X 3)。用饱和食盐水(30mL)洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干 燥，过滤，浓缩。残留物经快速柱色谱(硅胶，DCM/CH 30H= 100 :1)纯化得到产物为黄色固体 (95mg，产率为 81.8%)。
[0162] 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.46(s，lH)，8.94(s，lH)，8.49(d，J = 2.4Hz，lH)，8.38 (d J= 1.2Hz, 1H) ,8.17(dd ,J = 8.8,1.6Hz,lH) ,8.14(d ,J = 8.8Hz , 1H) ,8.07(d ,J = 2.4Hz, 1H) ,7.54( t,J = 54.6Hz,lH) ,4.01 (s , 3H), 3.93-3.85(m, 4H), 3.43-3.35(m,4H), 3.13(s, 3H).
[0163] 对比例3化合物:N-(5-(3-(l，l-二氟乙基)-4-吗啉基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺
[0164]
[0165] 步骤1:6-溴-3-碘喹啉-4-酚
[0166] 将6_漠卩奎琳_4_酸(2· 15g，9·6mmol)和N-鹏代丁二醜亚胺（2·6g，11 ·6mmol，I · 2eq) 于冰醋酸（25mL)中的混合物在50 °C下搅拌1小时。将反应混合物倒入水（IOOmL)中，抽滤收 集产生的黄色固体，用甲醇洗涤，在50°C下烘干，得淡黄色固体(2.7g，产率81 %)。该粗产物 不作进一步纯化直接用于下一步。
[0167] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)5l2.37(s,lH) ,8.57(d,J = 4.6Hz,lH) ,8.19(d,J = 2.4Hz,lH),7.84(dd ,J = 8.8,2.4Hz,lH),7.57(d ,J = 8.8Hz,lH).
[0168] 步骤2:6-溴-4-氯-3-碘喹啉
[0169] 将6-溴-3-碘喹啉-4-酚（2 · 769g，7 · 9lmmol)于三氯氧磷（25mL)中的混合物回流 2.5小时。在真空中浓缩反应混合物，用水(IOOmL)稀释残留物。用饱和碳酸氢钠水溶液中和 产生的混合物，用乙酸乙酯（I OOmL X 3)萃取。用水（I OOmL)和食盐水（I OOmL)洗涤合并的有 机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。残留物经快速柱色谱(硅胶，石油醚/乙酸乙酯= 25: 1)纯化得到产物为白色固体(0.93g，产率32 % )。
[0170] 1H NMR(400MHz，CDC13)S9.11(s，1H)，8.43(d，J = 2.0Hz，1H)，7.95((1, J = 8.8Hz， lH),7.84(dd ,J = 8.8,2.0Hz,lH).
[0171 ] 步骤3:6-漠氣乙氧基乙烯基)卩奎琳
[0172] 将6-溴-4-氯-3-碘喹啉（921mg，2.5mmol)，三丁基（1-乙氧基乙烯基）锡（948mg， 2.625mmol，I · 05eq)和三苯基神（153mg，0 · 5mm ο I，0 · 2eq)于 DMF( IOmL)中的混合物脱气，然 后加入Pd2(dba)3(57mg，0.0625mmol，0.025eq)。将产生的反应混合物脱气并回充氩气(三个 循环），然后在60 °C下氩气气氛中搅拌6小时。将反应混合物冷却至室温，用水(IOOmL)稀释， 用乙酸乙酯萃取(50mLX3)。用水(50mLX2)和饱和食盐水(50mL)洗涤合并的有机层，用无 水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。残留物经快速柱色谱(硅胶，石油醚/乙酸乙酯=140:1~100:1) 纯化得到产物为黄色固体(461mg，产率为59 % )。
[0173] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)58.89(s,lH),8.43(d,J=1.8Hz,lH),8.06(d,J = 8.8Hz, lH),8.03(dd ,J = 8.8,1.8Hz,lH),4.75(d ,J = 2.8Hz,lH),4.57(d ,J = 2.8Hz,lH),3.98(q J = 7.0Hz,2H),1.34(t ,J = 7.0Hz,3H).
[0174] 步骤4: ^6-溴-4-氯喹啉-3-基）乙酮
[0175] 将6-溴-4-氯-3-(1-乙氧基乙烯基）喹啉（461mg，1.47mmol)和2N HCl水溶液 (2. OmL)于THF( IOmL)中的混合物在室温下搅拌3小时。将适量硅胶加到反应混合物中，真空 中除去挥发物。残留物经快速柱色谱(硅胶，石油醚/乙酸乙酯=10:1)纯化得到产物为黄色 固体(30〇11^，产率为71.5%)。
[0176] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)59.11(s,lH),8.50(d,J=1.6Hz,lH),8.13-8.07(m,2H), 2.76(s,3H).
[0177] 步骤5:6-溴-4-氯-3-( I，1-二氟甲基)喹啉
[0178] 在0 °C 下向 1_(6-溴-4-氯喹啉-3-基）乙酮（350mg，1.23mmol)和乙醇（14.3yL， 0.246_31，0.269)于二氯甲烧(71111^)中的溶液中加入二乙胺基三氟化硫(79311^，4.92_31， 4eq)。将产生的反应混合物在0°C下搅拌0.5小时，在室温下搅拌过夜。将反应混合物倒入冰 水中（30mL)，用饱和碳酸氢钠水溶液调节pH至7，用二氯甲烧(20mL X 3)萃取。用水(30mL)和 食盐水(30mL)洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。残留物经快速柱色谱(硅 胶，石油醚/乙酸乙酯=20:1)纯化得到产物为黄色固体(156mg，产率为41.3% )。
[0179] 1H NMR(400MHz，DMSO-Cl6)δ9 ·07(s，1H)，8 · 50(d，J = 2 ·OHz，1H)，8 · 14-8 · 08(m，2H)， 2.18(t ,J = 19.2Hz,3H).
[0180] 步骤6:4-(6-溴-3-(1,1-二氟乙基)喹啉-4-基）吗啉
[0?81 ] 将6-溴-4-氯-3-( 1,1-二氟甲基)喹啉（137mg，0 · 45mmo 1)于吗啉(5mL)中的混合物 在100 °C下搅拌2小时。用水（30mL)稀释反应混合物，用乙酸乙酯（20mL X 3)萃取。用水 (30mL)和食盐水(30mL)洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。残留物经快速 柱色谱（硅胶，石油醚/乙酸乙酯=20 :1~10 :1)纯化得到产物为黄色固体（48mg，产率为 30%)。回收原料72mg。
[0182] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)59.01(s,lH),8.43(d,J = 2.0Hz,lH),8.06(d,J = 8.8Hz, 1H) ,7.99(dd,J = 8.8,2.0Hz,lH) ,3.81(t,J = 4.4Hz,4H) ,3.26(br s,4H) ,2.19(t,J = 19.2Hz,3H).
[0183] 步骤7:N-(5-(3-(l，l-二氟乙基)-4-吗啉基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲 磺酰胺
[0184] 将4-(6-溴-3-(1，1-二氟乙基)喹啉-4-基）吗啉(4511^，0.126_〇1)，^(2-甲氧基-5-(4,4,5,5-四甲基-1，3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基）吡啶-3-基）甲磺酰胺（5〇11^， 0.15Immol，1.2eq)和2N碳酸钟水溶液(0.189mL，0.378mmol，3eq)于二氧六环(4mL)中的混 合物脱气，然后加入PdCl 2(dppf) (6 · 5mg，0 · 0088mmol，0 · 07eq)。将产生的反应混合物脱气 并回充氩气(三个循环），然后在l〇〇°C下氩气气氛中搅拌5小时。将反应混合物冷却至室温， 用水(30mL)稀释，用乙酸乙酯萃取(30mL X 3)。用饱和食盐水(30mL)洗涤合并的有机层，用 无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。残留物经快速柱色谱(硅胶，DCM/CH 30H= 110:1)纯化得到产 物为黄色固体(36mg，产率为59.7 % )。
[0185] 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.47(s，lH)，8.98(s，lH)，8.50(d，J = 2.4Hz，lH)，8.44 (d J= 1.3Hz, 1H) ,8.20(d,J = 8.8Hz,lH),8.16(dd,J = 8.8,1.6Hz,lH),8.07(d,J = 2.4Hz, lH),4.01(s,3H),3.84(t ,J = 4.0Hz,4H) ,3.33(br s,4H) ,3.13(s,3H) ,2.21(t ,J = 19.2Hz, 3H).
[0186] 试验部分
[0187] PI103指:3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3'，2'，4,5]呋喃并[3,2_d]嘧啶-2-基）]苯酚。
[0188] 试验1化合物对激酶ΡΙ3Κα的抑制活性
[0189] 一、试验方法
[0190] 1.制备IX激酶缓冲液
[0191] 50mM HEPES，pH 7.5
[0192] 3mM MgCl2
[0193] ImM EGTA
[0194] IOOmM NaCl
[0195] 0.03 % CHAPS
[0196] 2mM DTT
[0197] 2.待测化合物DMSO溶液的制备及稀释
[0198] 1)将化合物用100 % DMSO溶解，所配浓度为测试中所需最高抑制浓度的100 X。转 移IOOyL该溶液至96孔板的一个孔内。例如，如果所需最高抑制剂浓度是ΙμΜ，则这一步需制 备1 ΟΟμΜ的化合物DMSO溶液。
[0199] 2)对于所有的化合物，将管内的化合物转移至96孔储备板的一个孔内，再转移30μ L至含有60yL 100%DMS0的下一个孔内，以此方式对化合物进行稀释。
[0200] 3)在同一张96孔板上，分别加入IOOyL 100%DMS0至2个空白孔内作为无化合物对 照和无酶对照，这张板记为源板。
[0201] 3.制备中介板
[0202] 1)从源板转移4yL化合物至一张新的96孔板，以此作为中介板。
[0203] 2)中介板每孔内加入96yL IX激酶缓冲液。
[0204] 3)在振荡器上将中介板内的化合物混合IOmin。
[0205] 4.制备测试板
[0206]从中介板的每孔中转移2.5yL的液体至一张384孔板，并设立复孔。例如，96孔板的 Al转移到384孔板的Al和A2孔。96孔板的A2转移到384孔板的A3和A4,以此类推。
[0207] 5.ΡΙ3Κα 激酶反应 [0208]制备4 X激酶溶液
[0209] 1)在I X激酶缓冲液中制备ΡΙ3Κα溶液，每种试剂的浓度为测试时最终浓度的4倍。
[0210]最终浓度:ΡΙ3Κα为 1·65ηΜ。
[0211] 2)测试板每孔加2.5yL激酶溶液，不含酶的对照孔除外（加2.5yL I X激酶缓冲液 代替）。
[0212] 3)振荡测试板。
[0213] 制备2 X底物溶液
[0214] 1)在IX激酶反应缓冲液中制备含PIP2底物和ATP的底物溶液，每种试剂的浓度均 为测试时最终浓度的2倍。
[0215] 最终浓度:PIP2 为 50μΜ，ΑΤΡ 为 25μΜ。
[0216] 2)测试板每孔加入5yL底物溶液开始反应。
[0217] 3)振荡测试板
[0218]激酶反应
[0219] 1)测试板加盖于室温孵育1小时。
[0220] 6激酶检测
[0221] 1)将Kinase-Glo试剂平衡至室温。
[0222] 2)测试板每孔加入IOyL的Kinase-Glo试剂终止反应。
[0223] 3)离心短暂混合，在用读板器测量发光强度之前于振荡器上缓慢振摇15min。
[0224] 7 读板
[0225]在Synergy上收集数据
[0226] 8.曲线拟合
[0227] 1)从Synergy程序中拷贝RLU(相对光单位)值。
[0228] 2)将RLU值转换成百分抑制率。
[0229] 百分抑制率= 100-(最高RLU-样本RLU)/(最高RLU-最低RLU)*100
[0230] "最高RLU"指无酶对照孔的RLU值，"最低RLU"指DMSO对照孔的RLU值。
[0231]二、结果：
[0233]同样的试验方法测得下述化合物的IC50:
[0235] 三、结论：
[0236] 实施例化合物都显示了对激酶ΡΙ3Κα的抑制活性，尤其是化合物1~6具有很高的 活性:对激酶PI 3Κα的I C5q都在IOnM左右甚至以下。
[0237] 试验2化合物对激酶PI3K γ的抑制活性
[0238] -、试验方法
[0239] 1.制备IX激酶缓冲液
[0240] 50mM HEPES，pH 7.5
[0241] 3mM MgCl2
[0242] ImM EGTA
[0243] IOOmM NaCl
[0244] 0.03 % CHAPS
[0245] 2mM DTT
[0246] 2.制备4X激酶溶液
[0247] 1)在I X激酶缓冲液中制备PI3K γ溶液，每种试剂的浓度为测试时最终浓度的4 倍。
[0248] 终浓度:ΡΙ3Κγ 为7·6ηΜ。
[0249] 2)测试板每孔加2.5yL激酶溶液，不含酶的对照孔除外（加2.5yL I X激酶缓冲液 代替）。
[0250] 3)振荡测试板。
[0251] 3.制备2 X底物溶液
[0252] 1)在I X激酶反应缓冲液中制备含PIP2底物和ATP的底物溶液，每种试剂的浓度均 为测试时最终浓度的2倍。
[0253] 终浓度：PIP2 为 50μΜ，ΑΤΡ 为 25μΜ。
[0254] 2)测试板每孔加入5yL底物溶液开始反应。
[0255] 3)振荡测试板
[0256] 4.激酶反应
[0257] 测试板加盖于室温孵育1小时。
[0258] 5.激酶检测
[0259] 1)将ADP-Glo试剂平衡至室温。
[0260] 2)从384孔板转移5yL反应混合物至一张新的384孔板。
[0261] 3)新测试板每孔加入5yL ADP-Glo试剂终止反应。
[0262] 4)离心短暂混合，于振荡器上缓慢振摇，平衡40min。
[0263] 5)每孔加入IOyL激酶检测试剂，振摇lmin，在用读板器测量发光强度之前平衡 60min〇
[0264] 6.读板
[0265]在Synergy上收集数据。
[0266] 7.曲线拟合
[0267] 1)从Synergy程序中拷贝RLU值。
[0268] 2)将RLU值转换成百分抑制率。
[0269] 3)数据存于MS Excel，用Graphpad 5.0拟合曲线。
[0270] 百分抑制率= 100-(最高RLU-样本RLU)/(最高RLU-最低RLU)*100
[0271] "最高RLU"指无酶对照孔的RLU值，"最低RLU"指DMSO对照孔的RLU值。
[0272] 二、结果： LUZ/4」 二、铦论：
[0275] 实施例化合物1、4、6都显示了很高的对激酶PI3K γ的抑制活性，其IC5q都在IOnM以 下。
[0276] 试验3:化合物在MCF-7细胞上对Akt的Serine 473磷酸化的抑制
[0277] 细胞株 L0279」一、买验万法
[0280]第1天细胞铺板
[0281] a.在显微镜下观察细胞株生长状态，在细胞株生长状态良好时开始实验。
[0282] b.将细胞培养瓶从培养箱中取出，核对瓶上标记的细胞名称，培养基类型及细胞 代数。
[0283] c.弃去培养基，用胰酶消化，消化完后，用含血清的培养基中和，吹打细胞，使细胞 脱落。
[0284] d.用移液管将细胞悬液移入离心管中，1000 rpm的转速离心5分钟。
[0285] e.吸弃离心管中的细胞上清液。
[0286] f.向离心管中加入适当体积的培养基，轻柔吹打使细胞重悬均匀。
[0287] g.使用Vi-Ce 11 XR细胞计数仪计数。
[0288] h.将细胞悬液调至合适浓度。
[0289] i .将细胞悬液加入384孔细胞培养板中，36μ!7孔。标记细胞名称，种板密度，日期 等详细信息，将培养板放置于CO2培养箱中孵育过夜。
[0290]实验条件：
[0292] 第2天加化合物
[0293] 」.吸弃24以1^细胞上清，加24以1^新鲜01^1+10%?83培养基，37°(：，5%0)2孵育211。
[0294] k.用DMSO将待测化合物配制成8mM溶液，然后3倍梯度稀释成9个浓度。
[0295] 1.将梯度稀释的化合物用完全培养基(DMEM+10 %FBS)配成4 X溶液，每孔加12yL 化合物到384孔细胞培养板(3701)(化合物的排布和最终浓度如下），37°C，5%CO2孵育2h。
[0297] 注:Torin 1作为内参化合物;DMSO的最终浓度是0.5%。
[0298] m.吸弃上清38yL，加 IOyL 2X裂解缓冲液，室温振30min后-80°C过夜。
[0299] 第3天AlphaScreen 检测
[0300] η·室温解冻细胞裂解液，转移IOyL裂解液到检测板(Optiplate-384)。
[0301] 〇 ·加5yL Acceptor beads到检测板，室温孵育2小时。
[0302] p ·加5yL Donor beads到检测板，室温孵育2小时。
[0303] q.用EnSpire Multimode读板器检测，读取结果。
[0304] r ·在Exce 1中用XL-fi t软件计算化合物抑制的IC50值。
[0305] 二、结果：
[0307] 三、结论：
[0308]该实验为细胞水平的活性测试，体现了化合物在活细胞上对PI3K的抑制活性。化 合物6相较于对比例1化合物，分子结构中仅增加了一个氰基，但是其细胞活性却显著高于 后者，IC5q值相差4倍多。可见，化合物6中氰基的引入，具有出乎预料的、非显而易见的提升 细胞活性的效果。
[0309] 试验4:化合物在MCF-7细胞上对Akt的Serine 473磷酸化的抑制
[0310] -、试验方法:与试验3相同。
[0311] 二、结果：
[0313] 三、结论：
[0314] 该细胞水平的活性测试，显示了化合物1~4在活细胞上对PI3K的抑制活性均显著 优于对比例1化合物，IC5q值相差3到5倍。与对比例1化合物相比，本发明化合物1~4均在稠 环上相同取代位置引入一个氰基，这些结果进一步表明，化合物1~4中氰基的引入，具有显 著的提升细胞活性的效果。
[0315] 试验5心111^6广61〇((^)法测试化合物在1]87]\^细胞株的细胞增殖实验
[0316] -、实验设计
[0317] 在U87MG细胞中测定化合物对细胞增殖的抑制活性，并每株细胞设定一个阳性对 照、一个空白对照和一个溶媒对照。
[0318] 二、实验材料
[0319] 细胞系
[0321] 置于37 °C、5 % CO2、95 %湿度条件下培养。
[0322] 试剂和耗材
[0323] 胎牛血清FBS(GBICO)，CdiTiter-Gloi.Luminescent Cell Viability Assay (Promega)，96孔透明平底黑壁板(Corning)。
[0324]待测药
[0326] 母液冻存于-20 °C。
[0327] 阳性药
[0329] 三、实验仪器
[0330] EnVis ion 多标记微孔板检测仪，PerkinElmer，2104_0010A;
[0331] CO2培养箱，Thermo Scientific，Model 3100Series;
[0332] 生物安全柜，Thermo Scientific，Model 1300Series A2;
[0333] 倒置显微镜，Olympus，CKX41 SF;
[0334] 电子天平，METTLER-TOLEDO，AL-104;
[0335] 冰箱，SIEMENS，ΚΚ25Ε76ΤΙ。
[0336] 四、对细胞增殖的抑制活性测定
[0337] 细胞培养和接种：
[0338] 收获处于对数生长期的细胞并采用血小板计数器进行细胞计数。用台盼蓝排斥法 检测细胞活力，确保各细胞系活力在96%以上。
[0339] 用培养液稀释调整细胞浓度，添加90yL细胞悬液至的96孔板中使细胞密度达到指 定的浓度。
[0340] 96孔板中的细胞置于37 °C、5 % C〇2、95 %湿度条件下培养过夜。
[0341] 加药：
[0342] 药物稀释。用相应溶剂溶解被测化合物形成储存液并进行梯度稀释，得到10倍溶 液;同样制备阳性药的10倍溶液。
[0343] 加药。在已接种细胞的96孔板中每孔加入IOyL药物溶液，每个细胞浓度设置三个 复孔。被测化合物的最高浓度为50μΜ，9个浓度，3.16倍稀释。
[0344]培养。将已加药的96孔板中的细胞置于37°C、5%⑶2、95%湿度条件下继续培养96 小时，分别进行CTG分析。
[0345] 终点读板：
[0346] 融化CTG试剂并平衡细胞板至室温30分钟。
[0347] 每孔加入等体积的CTG溶液。
[0348] 在定轨摇床上振动2分钟使细胞裂解。
[0349] 将细胞板放置于室温10分钟以稳定冷光信号。
[0350] 用EnVision读取冷光值。
[0351] 数据处理
[0352]使用GraphPad Prism 5.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出 剂量-效应曲线，并由此计算IC5Q值。
[0353 ]细胞存活率（％) = ( Lu_sr-L_舖卿,?) / (Lu_j_rLum賴|_照）X 100 %
[0354] Lum是指:冷光值。
[0355] 五、结果：
[0357] 为另一次以相同方法独立进行的实验结果。
[0358]六、结论：
[0359]该实验为细胞水平的增殖抑制测试，体现了化合物对细胞增殖的抑制活性。与化 合物6相比，对比例1化合物稠环上没有氰基，对比例2化合物和对比例3化合物在相同取代 位置用其他基团替代氰基。试验结果表明，化合物6对U87MG细胞的增殖抑制活性显著高于 所有对比例化合物，IC 5q值均相差在3倍以上。可见，化合物6中氰基的引入，具有出乎预料 的、非显而易见的提升细胞活性的效果。
[0360]试验eCellTiter-Glo法测试化合物对5株人肿瘤细胞株增殖活性抑制的研究 [0361 ] -、实验方法:与试验5相同。
[0363]二、结果：
[0365] 三、结论：
[0366] 该实验比较了化合物6与对比例1化合物对不同肿瘤细胞株的增殖抑制活性。化合 物6相较于对比例1化合物，分子结构中仅增加了一个氰基，但是其细胞增殖抑制活性却显 著高于后者，二者在了470、1^^7^2780、％1-!11975^549等多种细胞株上的1(： 5()值均相差约3 ~6倍。可见，化合物6中氰基的引入，具有出乎预料的、非显而易见的提升细胞活性的效果。
[0367] 试验7CellTiter-Glo法测试化合物对5株人肿瘤细胞株增殖活性抑制的研究
[0368] 一、实验方法:与试验5相同。
LUJ/Ζ」 二、珀化：该头版测讯」亿甘彻个丨η」^熘瑚胭休的項甩仰明沾怔，珀米衣明，亿 合物6在^'20、8了474、31(-0￥-3、％1-!1460、％1-!11650等多种肿瘤细胞株上都表现出了很好 的增殖抑制活性，IC5Q值均在ΙμΜ以下。
【主权项】
1. 一种由以下通式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐：其中，X表示0、S、NR、S〇2 或NH2C1，R选自 Η、Ci-6 的烷基，Ri、R2、R3、R4、R5、R6、R7、Rs独立地选 自Η、&-6的烷基、或具有OH取代基的6的烷基。2. 如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，RSCh的烷基，R^R^Rs、 R4、Rs、R6、R7、Rs为独立地选自Η、&-4的烷基、或具有OH取代基的4的烷基。3. 如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，R为甲基或乙基， R4、R5、R6、R7、R8为甲基或乙基。4. 如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物选自以下化合 物或其药学上可接受的盐：5. -种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-4中任一项所述的化合物或其 药学上可接受的盐。6. 如权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、或如权利要求5所述 的药物组合物在制备用于抑制磷脂酰肌醇3-激酶的药物中的应用。7. 如权利要求6所述的应用，其中所述的药物为抗肿瘤药物。8. 如权利要求7所述的应用，其中，所述的肿瘤选自：脑癌、头颈癌、食管癌、肺癌、肝癌、 胃癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、白血病、骨髓 异常增生综合症、肉瘤、骨肉瘤或横纹肌瘤。9. 如权利要求6所述的应用，其中所述的药物为抗炎药物或治疗自身免疫性疾病的药 物。10. 如权利要求9所述的应用，其中所述的抗炎药物是用于治疗慢性阻塞性肺病或哮喘 的药物。11. 如权利要求9所述的应用，其中自身免疫性疾病选自风湿性关节炎、银肩病或系统 性红斑狼疮。12. -种如权利要求1-4任一项所述的式（I)的化合物的制备方法，所述方法包括使式 (IIΓ )的化合物与式(IV)的化合物反应，得到式(I)的化合物的步骤：其中乂、1?1、1?2、1?3、1?4、1^、1?6、1?7和1?8如权利要求1-4中任一项所定义。13. 如权利要求12所述的方法，其中，所述方法包括使式（II)的化合物与式（III)的化 合物反应得到式(IIΓ )的化合物的步骤，14. 一种如权利要求1-4任一项所述的式（I)的化合物的制备方法，所述方法包括使式 (IV '）的化合物与式(III)的化合物反应，得到式(I)的化合物的步骤：其中乂、1?1、1?2、1?3、1?4、1^、1?6、1?7和1?8如权利要求1-4中任一项所定义。15. 如权利要求14所述的方法，其中，所述方法包括使式(II)的化合物与式（IV)的化合 物反应得到式(IV'）的化合物的步骤，16. -种式(IIΓ )的化合物或式(IV'）的化合物，其中乂、1?1、1?2、1?3、1?4、1^、1?6、1?7和1?8如权利要求1-4中任一项所定义。
【文档编号】A61P17/06GK105859684SQ201610235304
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月15日
【发明人】龙凯, 廖立东, 王万
【申请人】四川赛诺唯新生物技术有限公司