豆科植物叶片组织特异性启动子及其应用

豆科植物叶片组织特异性启动子及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种豆科植物叶片组织特异性启动子及其应用。具体地，本发明人从大量的豆科植物基因中筛选到一种特别适合驱动外源基因在植物叶片特异性表达，而在豆科植物其他部位不表达的启动子。本发明启动子的表达特异性和专一性很高。本发明还提供了具有所述启动子的构建物、表达盒和载体等。含本发明启动子的转基因豆科植物可以特异性地改善豆科植物叶片的农艺性状，并有效避免外源基因导入对豆科植物其他组织的影响。
【专利说明】
豆科植物叶片组织特异性启动子及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种豆科植物组织中的特异性启 动子及其应用。
【背景技术】
[0002] 常规育种方法在品质改良和新品种选育方面发挥着重要作用，但也存在育种年限 长、难以打破性状连锁、多基因重组几率低、远缘杂交困难等种种弊端。植物基因工程技术 能定向改良植物的不良性状，使植物获得常规方法难以得到的特定性状，并能大大缩短育 种年限，提高经济效益。此种技术在供体总DNA导入前不经过任何修饰和构建，从而避免基 因构建元件可能对生态和环境造成的负面影响。转基因育种技术可按人们的预选设计改良 作物，创造新种质，丰富种质资源，提尚作物的品质、抗性、耐性、增加广量等，可极大的提尚 育种效率，加快育种进程，对解决粮食和蔬菜安全、生态恶化、资源匮乏及效益低下等问题 具有重大的社会、生态和经济意义。
[0003] 转基因技术在我国主要农作物育种（水稻、小麦、玉米、大豆、高粱、向日葵、油菜） 的应用已取得成果。特别是在大豆育种上，采用外源DNA导入技术将优良性状的目的基因 导入栽培大豆，获得的后代既保持了原有受体的产量，又培育出集高产、优质、优良性状于 一体的新品种和品系。
[0004] 尽管我国在转基因技术应用于农作物育种方面虽然已取得可喜成绩，与国际水平 相比仍有较大的差距。寻找有效的组织特异性基因，并构建高效可用的转化载体是改良大 豆品质性状和研究大豆功能基因的先决条件。但是转基因质粒的构建是该技术的瓶颈之 一，其主要原因是缺乏有效的转基因载体能定向在豆科植物中进行组成型表达，或进行组 织特异型表达，以及缺乏能高效转化的载体。
[0005] 因此，本领域迫切需要找到一种组织特异性启动子，能够准确有效地改变豆科植 物的各种性状，改良其品系，更好地调控其生长发育以及产量。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种豆科植物的组织特异性启动子及其应用。
[0007] 本发明第一方面提供了一种启动子元件，所述的启动子元件是豆科植物的1-脱 氧-D-木酮糖醇-5-磷酸还原异构酶基因（dxr)的启动子，并且所述启动子具有豆科植物 叶片特异启动功能。
[0008] 在另一优选例中，所述的启动子元件选自下组：
[0009] (a)核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示的多核苷酸；
[0010] (b)核苷酸序列与SEQ ID NO. : 1所示序列的同源性彡90% (较佳地彡95%，更佳 地多98% )，且具有植物叶片特异启动功能的启动子活性的多核苷酸；
[0011] (c)如SEQ ID NO. : 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-100个（较佳地 1-50,更佳地1-20个）核苷酸，且具有豆科植物叶片特异启动功能的启动子活性的多核苷 酸。
[0012] 在另一优选例中，所述启动子元件是来源于豆科（如大豆）的1-脱氧-D-木酮糖 醇-5-磷酸还原异构酶基因（dxr基因）的启动子。
[0013] 在另一优选例中，所述的"豆科植物叶片特异启动功能"，表示所述启动子在叶片 具有的启动功能（或相应表达量）远大于在其他部位的启动功能（或相应表达量），或仅在 豆科植物的叶片具有启动功能。
[0014] 在另一优选例中，所述的豆科植物包括百脉根（Lotus corniculatus)、豌豆 (Lathyrus odoratus)、大豆（Glycine max)或苜蓿（Medicago sativa) 〇
[0015] 在另一优选例中，所述启动子元件的序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0016] 本发明第二方面提供了一种构建物，所述构建物含有外源基因以及与外源基因可 操作连接的本发明第一方面所述的启动子元件；
[0017] 较佳地，所述外源基因包括：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因、RNAi基因、 microRNA基因、生物制剂基因、或植物品质相关基因。
[0018] 在另一优选例中，所述的外源基因在天然状态下并不存在。
[0019] 在另一优选例中，所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基因、耐寒基 因、耐高温基因、抗旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。
[0020] 在另一优选例中，所述的筛选标记基因选自下组：gus(i3-葡萄糖苷酸酶）基因、 hyg(潮霉素）基因 、neo (新霉素）基因、或gfp (绿色荧光蛋白）基因。
[0021] 在另一优选例中，所述的抗原蛋白基因选自下组：细菌类抗原蛋白（如霍乱毒素 B，破伤风毒素等）、病毒类抗原蛋白（如犬细小病毒）、原生动物类抗原蛋白（如阿米巴病 原LecA)、或自身抗原蛋白（如I型糖尿病的CTB - pins抗原蛋白）。
[0022] 在另一优选例中，所述的生物制剂基因选自下组：a 2b干扰素基因、或胰岛素样 生长因子基因。
[0023] 在另一优选例中，所述的植物品质相关基因选自下组：氣基酸改良相关基因、脂肪 改良相关基因、淀粉改良相关基因、或雄性不育相关基因。
[0024] 本发明第三方面提供了一种表达盒，所述表达盒从5'至3'依次具有下述元件：本 发明第一方面所述的启动子元件、基因0RF序列、和终止子。
[0025] 在另一优选例中，所述的表达盒还包括选自下组的一种或多种元件：p〇ly(A)元 件、增强子、转运元件、或基因祀向元件。
[0026] 本发明第四方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第一方面所述的启动子元 件、或本发明第三方面所述的表达盒。
[0027] 在另一优选例中，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或植物细胞病毒载 体、穿梭载体。
[0028] 本发明第五方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的 载体、或其染色体整合有外源的本发明第一方面所述的启动子元件、或其染色体整合有本 发明第三方面所述的表达盒。
[0029] 在另一优选例中，所述宿主细胞的染色体具有一个或多个（如1-50个，较佳地2-6 个）拷贝的本发明第一方面所述的启动子元件、或本发明第三方面所述的表达盒。
[0030] 在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：原核细胞（如大肠杆菌、链霉菌属、 或农杆菌）、低等真核细胞（如酵母细胞）、或高等真核细胞（如植物细胞）。
[0031] 在另一优选例中，所述的宿主细胞为植物细胞，较佳地为农作物、蔬菜、或花 丼的植物细胞，更佳地为豆科植物细胞，最佳地为百脉根（Lotus corniculatus)、豌豆 (Lathyrus odoratus)、大豆（Glycine max)或苜蓿（Medicago sativa)植物细胞。
[0032] 本发明第六方面提供了一种本发明第一方面所述的启动子元件、本发明第二方面 所述的构建物、或本发明第三方面所述的表达盒的用途，用于特异性调控外源基因在豆科 植物叶片的表达。
[0033] 本发明第七方面提供了一种在豆科植物叶片特异性表达外源基因的方法，包括步 骤：
[0034] (a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作地连接的 本发明第一方面所述的启动子元件；
[0035] (b)将步骤（a)中的构建物导入豆科植物细胞，获得转化的豆科植物细胞；
[0036] (c)将步骤（b)中转化的豆科植物细胞再生成豆科植株，从而使外源基因在豆科 植物叶片特异性表达。
[0037] 在另一优选例中，所述外源基因仅在豆科植物的叶片表达。
[0038] 本发明第八方面提供了一种制备转基因豆科植物的方法，包括步骤：
[0039] (a)提供转基因豆科植物细胞，所述豆科植物细胞含有本发明第四方面所述的载 体、或其染色体整合有本发明第一方面所述的启动子、或其染色体整合有本发明第三方面 所述的表达盒；
[0040] (b)将（a)的转基因豆科植物细胞再生为豆科植株，从而获得转基因豆科植物。
[0041] 在另一优选例中，所述转基因豆科植物选自下组：大豆、百脉根、豌豆、苜蓿等。
[0042] 本发明第九方面提供了一种豆科植物愈伤组织或豆科植物体细胞胚胎，所述的豆 科植物愈伤组织或豆科植物体细胞胚胎包括以下豆科植物细胞或由以下豆科植物细胞构 成：所述豆科植物细胞含有本发明第四方面所述的载体、或其染色体整合有本发明第一方 面所述的启动子元件、或其染色体整合有本发明第三方面所述的表达盒。
[0043] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0044] 下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的 本发明范围。
[0045] 图1是pCAMBIA1391Z载体的结构示意图。
[0046] 图2是转基因后的愈伤组织照片。
[0047] 图3显示农杆菌介导本发明转基因百脉根的生长情况良好。
[0048] 图4显示了对百脉根叶片DNA进行PCR扩增的结果。
[0049] 图5显示生长2周的转基因百脉根叶片的⑶S染色结果。
[0050] 图6显示生长2周的转基因百脉根全植株⑶S染色结果。
【具体实施方式】
[0051] 本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选的豆科植物基因及其相关元件， 首次意外地筛选到一种特别适合驱动外源基因在豆科植物叶片特异性表达的启动子，具体 地，本发明的启动子能够高效、专一地驱动外源基因在豆科植物叶片中表达，而其他部位无 任何表达。使用本发明的启动子可以用于特异性改善豆科植物的农艺性状，避免外源基因 对豆科植物的生长和发育产生影响。在此基础上完成了本发明。
[0052] 术语
[0053] 如本文所用，术语"本发明启动子"、"豆科植物叶片特异表达的启动子"、"启动 子P2480" "P2480"可互换使用，指来源于豆科植物（较佳地来自大豆、百脉根或类似植 物）1_脱氧-D-木酮糖醇-5-磷酸还原异构酶酶基因（drx)的启动子元件。一种典型本发 明启动子的序列如SEQ ID N0. :1所示。应理解，该术语还包括来自其他不同豆科植物的 与SEQ ID N0. :1所示启动子同源的、叶片特异表达的启动子。此外，该术语还包括SEQ ID NO. :1所示启动子或其同源启动子的衍生启动子或活性片段，主要这些衍生启动子或活性 片段保留了叶片特异表达（或特异启动）功能，例如保留至少50% SEQ ID N0. :1所示启动 子的特异启动功能（以可以被启动的外源基因的表达量进行表示）。
[0054] 如本文所用，术语"豆科植物"包括百脉根（Lotus corniculatus)、豌豆（Lathyrus odoratus)、大豆（Glycine max)或苜蓿（Medicago sativa) 〇
[0055] 如本文所用，术语"启动子"或"启动子区（域）"是指一种准确有效起始基因转录 功能的核酸序列，引导基因核酸序列转录为mRNA，其通常存在于目的基因编码序列的上游 (5'端），一般地，启动子或启动子区域提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子 的识别位点。
[0056] 本发明提供了一种能够在豆科植物叶片特异性表达的启动子，所述启动子来源于 大?基因组的gma. 2480基因的启动子。gma. 2480基因是大?基因的编号，也称为I-脱 氧-D-木酮糖醇-5-磷酸还原异构酶酶基因（dxr)。一种优选的启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0. :1所示。本发明的启动子能够高效、专一地在豆科植物叶片中表达，而在其他部位没 有任何表达，因此本发明的启动子可以用于特异性改善豆科植物的农艺性状，避免外源基 因对豆科植物生长和发育产生影响。
[0057] 在本文中，所述启动子或启动子区（域）包括启动子的变体，启动子变体可以通过 插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
[0058] 本发明还包括与本发明的优选启动子序列（SEQ ID NO. :1)具有50%或以上（优 选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如 99% )同源性的核酸，所述核酸也具有特异性调控启动豆科植物叶片表达的功能。"同源性" 是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平（即序列相似性或同一性）。
[0059] 应理解，尽管本发明的实例中提供了来源于大豆的启动子P2480,但是来源于其它 类似的植物（尤其是与大豆、百脉根属于同一科）的、与本发明启动子具有一定同源性（保 守性）的启动子，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据 本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该启动子。
[0060] 如本文所用，术语"特异性表达"是指目的基因在植物中特定的时间和/或特定的 组织的表达。所述的"豆科植物叶片特异性的表达"是指在本发明的启动子调控下，目的基 因高度特异性和专一性地在豆科植物叶片中表达。
[0061] 如本文所用，"外源的"或"异源的"是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列 之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于 该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是"外源的"。
[0062] 如本文所用，"顺式调控元件"是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保 守性碱基序列。
[0063] 本发明的启动子可以被可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子而言 可以是外源（异源）的。本发明所述的外源基因（也称为目的基因）没有特别的限制，可 以为RNAi基因或编码具有特定功能蛋白的基因，例如某些在农业或植物改良上具有重要 特性或功能的蛋白。
[0064] 所述外源基因的代表性例子包括（但不限于）：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋 白基因及生物制剂基因、或植物品质相关基因。
[0065] 所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基因、耐寒基因、耐高温基因、抗 旱基因、抗涝基因、或抗虫基因。所述的筛选标记基因选自下组：gus(i3-葡萄糖苷酸酶）基 因、hyg(潮霉素）基因 、neo (新霉素）基因、或gfp (绿色荧光蛋白）基因。所述的抗原蛋 白基因及生物制剂基因选自下组：细菌类抗原蛋白（如霍乱毒素 B，破伤风毒素等）、病毒类 抗原蛋白（如犬细小病毒）、原生动物类抗原蛋白（阿米巴病原LecA)、自身抗原蛋白（如I 型糖尿病的CTB-pins)、或生物制剂（如a 2b干扰素，胰岛素样生长因子等）。所述的植 物品质相关基因选自下组：氣基酸改良相关基因、脂肪改良相关基因、淀粉改良相关基因或 雄性不育相关基因。
[0066] 本发明还提供了一种基因表达盒，所述表达盒从5' -3'依次具有下列元件：启动 子、基因0RF序列、和终止子。优选地，所述启动子序列如SEQ ID N0. :1所示或与SEQ ID NO. : 1所示序列的同源性彡90 %，较佳地彡95 %，更佳地彡98 %。
[0067] 本发明还提供了一种包括本发明的启动子和/或基因表达盒的重组载体。作为一 种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达 目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动 子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括（从5'到3'方向）：启动子， 目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3'多聚核苷 酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记（二氢叶酸还原酶、新霉 素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等）；增强子；或操作子。
[0068] 用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌 质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够 在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被米用的。
[0069] 本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的启动子和/或 目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术 等。
[0070] 本发明的启动子、表达盒或载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋 白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵 母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体 和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主 为原核生物（如大肠杆菌）时，可以用CaCV法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核 生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法（如显微注射、电穿孔、 脂质体包装等）。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转 化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而 获得转基因的植物。
[0071] 作为本发明的一种优选方式，制备转基因植物的方法是：将携带启动子和目的基 因（两者可操作地连接）的载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段 整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是百脉根、大豆、豌豆、苜蓿等。在本 发明的实例中，所述的重组载体是带有⑶S报告基因的pCAMBIA1391Z穿梭载体，将本发明 的启动子构建到该载体中GUS基因的上游，转化植株，启动子将激活GUS基因的表达，所述 启动受到启动子区顺式作用元件的调控，可以有效模拟基因在体内被激活转录的状况。
[0072] β -葡萄糖苷酸酶（⑶S)能催化裂解一系列的β -葡萄糖苷，产生具有发色团或荧 光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学等方法对GUS活性进行定量和空间定位分 析。在本领域中，GUS基因已被广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，特别是其 可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。
[0073] 在本发明的一具体实例中，在本发明启动子的启动或指导下，可以使GUS基因特 异地在豆科植物叶片中表达，而豆科植物的其他部位没有任何表达。因此该启动子可以用 于特异性改善豆科植物的农艺性状，避免外源基因对豆科植物的生长和发育产生影响。
[0074] 应用
[0075] 本发明启动子、构建物、或表达盒等可用于在豆科植物叶片特异表达外源基因，从 而改善豆科植物叶片的农艺性状（如豆科植物的产量、品质），或增强豆科植物叶片对不利 环境（如冷冻、高温、干旱、病毒、病菌、虫害或人工除草剂）的抵抗能力。本发明也可用于 在豆科植物叶片生产特定的蛋白产物（如抗原蛋白及生物制剂），或用于研究外源基因在 豆科植物叶片中的特定功能（如对叶肉细胞发育的作用等）。
[0076] 本发明的主要优点包括：
[0077] (1)本发明的启动子在豆科植物叶片中表达，而其他部位无任何表达；
[0078] (2)本发明的启动子启动效率很高，且专一性极强；
[0079] (3)本发明的启动子可以用于特异性改善豆科植物的农艺性状，避免外源基因对 豆科植物的生长和发育产生影响。
[0080] (4)本发明的启动子是豆科植物自有的序列，适用于包括大豆、百脉根在内的多种 豆科植物，避免了外源序列可能引起的植物内基因表达水平的紊乱；基于本发明启动子开 发的转基因品系不存在由启动子序列导致的生物安全性的问题；
[0081] (5)本发明的表达载体不受转基因技术种类的影响，适用于包括农杆菌侵染愈伤 组织，茎尖法在内的多种转基因技术。
[0082] (6)利用本发明启动子构建的转基因表达载体以及对大豆进行基因改造（抗逆、 抗虫害、提高固氮效率）的工具，能够有效挖掘未知功能的基因，筛选有效的组织特异启动 子载体，用于构建转基因载体。
[0083] (7)在植物基因工程中利用本发明启动子能够使得外源目的基因在特定组织中高 效表达，以便实现对外源基因表达进行定时、定点、定量的三维精确调控。
[0084] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0085] 实施例1启动子克隆
[0086] 合成一对引物：
[0087] 正向引物
[0088] gma. 2480-GUS-p5:AACTGCAGCTGTGAATTGAGCCTCTT(SEQID No. :2)
[0089] 反向引物
[0090] gma. 2480-⑶S-p3:CGGGATCCCACCTCAGTTGAACCAGCCAC(SEQIDNo. :3)。
[0091] 以液氮研磨的方法抽提大豆的基因组DNA为模板，用上述引物（SEQ ID N0. :2和 3)，通过常规PCR方法，扩增出大豆gma2480基因起始密码子ATG上游2349bp的DNA片段。
[0092] 对扩增产物进行测序验证，结果表明与大豆的核苷酸野生序列相符。
[0093] 获得的启动子全序列如下所示：

[0097] 实施例2载体构建
[0098] 将实施例1获得的启动子序列与PCAMBIA1391Z载体（购于优宝生物公司）连接， 并进行测序验证。然后用PstI和BamHI双酶切pCAMBIA1391Z载体，回收约1. 4kb的启动 子片段，将该片段和含有⑶S报告基因的二元载体pCAMBIA1391Z (购于优宝生物公司）分 别用限制性内切酶PstI和BamHI进行双酶切，酶切产物通过凝胶回收后用T4-DNA连接酶 进行连接，并转化到大肠杆菌DH5 α菌株中加以保存。
[0099] 获得的最终载体命名为pCAMBIA1391Z-P2480-gus。用热激转化法将重组载体 pCAMBIA1391Z-P2480-gus转化到农杆菌EHA105菌株中，并用PCR扩增验证。
[0100] 实施例3转基因百脉根的获得
[0101] 将构建好的载体pCAMBIA1391Z-P2480-gus通过热激转化至市售的农杆菌EHA105 菌株。将农杆菌转染百脉根胚轴切片，感染后的组织切片于25°C暗培养三天后，转移至愈伤 组织诱导培养基于22°C至长出愈伤组织，再转移至芽诱导培养基至长出组织，再转移至根 诱导培养基直至长出根，再移栽从而获得转基因百脉根植株。
[0102] 实施例4⑶S基因检测
[0103] 提取实施例3获得的转基因百脉根的叶片，采用液氮研磨的方法提取转基 因百脉根植株的基因组DNA，以该DNA为模板用⑶S基因引物进行PCR扩增验证载 体pCAMBIA1391Z-P2480-gus是否已经转化到转基因百脉根植株中。PCR扩增条件为： 94°C，5s ;94°C，30s ;60°C，30s ;72°C，45s ;35cycles，72°C，10s。
[0104] 如图4所示，结果表明，有3个转基因株系能在叶片中观察到GUS基因条带。
[0105] 实施例5⑶S组织化学染色
[0106] 将生长2周的转基因百脉根苗取下，放在离心管/烧杯中，加入适量的⑶S染色液 于37°C保温过夜，然后用70%的乙醇脱色2-3次，到对照材料显现白色为止。肉眼或显微 镜下观察⑶S表达部位（蓝色即为⑶S表达部位），并通过照相记录染色结果。
[0107] ⑶S染色结果：图5为生长2周的转基因百脉根叶片的⑶S染色结果。
[0108] 图6为生长2周的转基因百脉根全植株⑶S染色结果。
[0109] 结果表明，GUS基因在生长2周的转基因百脉根的叶片中都有很强的表达强度，但 在植物的根或茎中没有观察到GUS的染色信号。这表明，在本发明启动子的调控下，外源基 因仅在植物的叶片特异性表达，在其他部位不表达。
[0110] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种启动子元件，其特征在于，所述的启动子元件是豆科植物的1-脱氧-D-木酮糖 醇-5-磷酸还原异构酶基因（dxr)的启动子，并且所述启动子具有豆科植物叶片特异启动 功能。2. 如权利要求1所述的启动子元件，其特征在于，所述的启动子元件选自下组： (a) 核苷酸序列如SEQ ID NO. :1所示的多核苷酸； (b) 核苷酸序列与SEQ ID NO. : 1所示序列的同源性彡90% (较佳地彡95% )，且具有 植物叶片特异启动功能的启动子活性的多核苷酸； (c) 如SEQ ID NO. : 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60个（较佳地1-30， 更佳地1-6个）核苷酸，且具有豆科植物叶片特异启动功能的启动子活性的多核苷酸。3. -种构建物，其特征在于，所述构建物含有外源基因以及与外源基因可操作连接的 权利要求1所述的启动子元件； 较佳地，所述外源基因包括：抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因、RNAi基因、 microRNA基因、生物制剂基因、或植物品质相关基因。4. 一种表达盒，其特征在于，所述表达盒从5'至3'依次具有下述元件：权利要求1所 述的启动子元件、基因0RF序列、和终止子。5. -种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的启动子元件、或权利要求4 所述的表达盒。6. -种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的载体、或其染色体 整合有外源的权利要求1所述的启动子元件、或其染色体整合有权利要求4所述的表达盒。7. 权利要求1所述的启动子元件、权利要求3所述的构建物、或权利要求4所述的表达 盒的用途，其特征在于，用于特异性调控外源基因在豆科植物叶片的表达。8. -种在豆科植物叶片特异性表达外源基因的方法，其特征在于，包括步骤： (a) 提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作地连接的权利 要求1所述的启动子元件； (b) 将步骤（a)中的构建物导入豆科植物细胞，获得转化的豆科植物细胞； (c) 将步骤（b)中转化的豆科植物细胞再生成豆科植株，从而使外源基因在豆科植物 叶片特异性表达。9. 一种制备转基因豆科植物的方法，其特征在于，包括步骤： (a) 提供转基因豆科植物细胞，所述豆科植物细胞含有权利要求5所述的载体、或其染 色体整合有权利要求1所述的启动子、或其染色体整合有权利要求4所述的表达盒； (b) 将（a)的转基因豆科植物细胞再生为豆科植株，从而获得转基因豆科植物。10. -种豆科植物愈伤组织或豆科植物体细胞胚胎，其特征在于，所述的豆科植物愈伤 组织或豆科植物体细胞胚胎包括以下豆科植物细胞或由以下豆科植物细胞构成：所述豆科 植物细胞含有权利要求5所述的载体、或其染色体整合有权利要求1所述的启动子元件、或 其染色体整合有权利要求4所述的表达盒。
【文档编号】A01H5/00GK105985958SQ201510064426
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月6日
【发明人】李轩, 荆新云, 余曜, 戴小密
【申请人】中国科学院上海生命科学研究院