气道上皮与气道平滑肌细胞共培养装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及细胞培养实验器材，具体地说涉及一种气道上皮与气道平滑肌细胞共培养装置。
【背景技术】
[0002]气道平滑肌原代培养是体外研究气道重塑的重要手段之一，也是对哮喘等气道慢性炎症性疾病进行细胞分子水平研究的基础。建立气道平滑肌细胞和气道上皮细胞共培养模型对研究呼吸系统疾病，特别是气道上皮细胞的损伤、炎症对平滑肌细胞增生、肥大的作用尤为重要。
[0003]目前存在的气道上皮和气道平滑肌细胞共培养的装置主要是Transwell小室。Transwell小室的底部滤膜材质为聚苯二甲酸乙二醇酯(polythylene terephthalate，PET)，膜表面经过钛酸酯偶联剂(titanate coupling agent，TC)处理，改善了细胞的贴壁性；另外，插入式细胞培养皿包含有透明的B1pore膜，可直接透过膜观察细胞。利用插入式培养皿可将气道上皮细胞或气道平滑肌细胞接种于可通透性的PET膜上，直径为12 mm和30 mm的插入式细胞培养皿可悬挂于24孔或6孔板上，其原理是将气道上皮细胞和气道平滑肌细胞在同一培养基中的两个层面上进行培养，两种细胞分泌的各种细胞因子和营养物质可以通过插入式培养皿的微孔膜在细胞间进行交换。插入式培养皿为悬挂式设计，方便移液管操作，而且插入皿会自动归位。
[0004]但上述Transwell小室存在以下缺陷:(I) Transwell小室中，生长于不同层面的气道上皮细胞和气道平滑肌细胞通过滤膜进行对话，并不符合实际生理情况。(2)尤其在共培养的短期作用观察中，Transwell小室的滤膜在一定程度上，不利于细胞因子和营养物质的迅速扩散和相互交流，导致介质分布不均，影响细胞间对话。(3) Transwell小室的PET材质滤膜，孔径一般较小，最大不超过12 ym，仅有少数细胞可以通过，由于滤膜本身面积有限，且气道上皮细胞系较气道平滑肌原代细胞生长迅速，因此，滤膜上的气道上皮细胞常会累积生长，导致位于内层的气道上皮细胞氧气、营养物质获取不足；气道上皮细胞和气道平滑肌细胞的生长状态难以协调一致。(4) Transwell小室费用较贵，难以应用于大规模、大批次的细胞共培养。
【实用新型内容】
[0005]发明目的:本实用新型的目的是提供一种低成本、建立培养体系简捷有效、且便于后续实验操作的气道上皮与气道平滑肌细胞共培养装置。
[0006]技术方案:为实现上述目的，本实用新型的气道上皮与气道平滑肌细胞共培养装置包括:设有至少一个皿状空间的容器、设于所述容器皿状空间底面的若干根立柱、以及对应任一皿状空间内被立柱稳定在某一水平高度的尼龙网。
[0007]所述容器包括但不限于6孔板、12孔板、24孔板、细胞培养皿的任意一种。优选地，所述容器为12孔板。
[0008]任一皿状空间内的立柱设有3~6个。本实用新型的立柱是根据实际需要手动安装在容器底壁的，立柱与尼龙网形成一个气道上皮细胞和气道平滑肌细胞的共培养体系。所述若干根立柱为底部熔融状态下焊接在皿状空间底面的玻璃柱，立柱的高度不超出皿状空间高度的1/3~1/2。
[0009]气道平滑肌细胞种植于容器皿状空间的底壁，气道上皮细胞种植于尼龙网上。培养时整个体系在培养基中，立柱需要方便设置且利于尼龙网的取出。所述若干根立柱距其顶端1/4~1/3处设有与所述尼龙网间隙配合的横向切槽。进一步地，在任一皿状空间内，立柱切槽的槽口方向面向皿状空间的中心，所述尼龙网为圆形尼龙网。
[0010]所述尼龙网为300目~600目尼龙网，优选为400目尼龙网，原因主要是:(I)尼龙网为柔性材料，方便细胞培养过程中用镊子夹取和卡在切槽内。(2)尼龙网同时具有一定韧性和表面摩擦力，卡在切槽内的尼龙网不会下沉和漂浮。(3)气道上皮细胞直径一般十几微米，不超过40 μ m，300目~600目尼龙网的直径在23~48 μ m之间，其中400目尼龙网直径为38μπι左右；气道上皮细胞具有贴壁性强和生长速度快的特性，选择网眼直径略大于气道上皮细胞的尼龙网，有利于细胞贴壁生长和自由穿越，同时有利于营养物质的渗透。
[0011]利用本实用新型的培养装置建立气道上皮细胞和气道平滑肌细胞培养体系的处理步骤包括:
[0012](I)玻璃柱酸处理后进行高压灭菌，然后焊接到孔板内底面；
[0013](2)冷却后将焊接有玻璃柱的孔板紫外消毒，多聚赖氨酸包被，37° C过夜；
[0014](3)将气道平滑肌细胞种植于孔板内底面，48 h后全量换液，以后每2~3 d换液一次；
[0015](4)气道平滑肌细胞种植第3 d，尼龙网75%酒精浸泡30 min，紫外消毒，多聚赖氨酸包被，37° C过夜；
[0016](5)离体培养2~4 d气道上皮细胞系种植于尼龙网，24 h后全量换液，以后每2~3d换液一次；
[0017](6)气道平滑肌细胞种植第5 d，条件培养基预孵气道上皮细胞系24 h，收集条件培养基；次日，条件培养基半量更换平滑肌细胞培养基，37° C孵育24 h ;
[0018](7)气道平滑肌细胞种植第7~9 d，更换新鲜平滑肌细胞培养基，将气道上皮细胞系尼龙网小心反扣并卡在玻璃柱切槽内，建立体系。
[0019]有益效果:(1)本实用新型设计合理、操作简便、易行，克服了 Transwell小室气道上皮细胞生长不易控制的问题。利用300目~600目尼龙网，可减缓上皮细胞生长速度，且上皮细胞可自由穿越尼龙网的两面进行生长，防止因复层累积生长导致内层细胞营养不良。(2)本实用新型改良了 Transwell小室，气道上皮细胞和气道平滑肌细胞生长在同一细胞外液的不同平面上，气道上皮细胞和气道平滑肌细胞分泌的各种细胞因子和营养物质可以相互交换；同时通过反扣尼龙网，可以使气道上皮细胞与气道平滑肌细胞直接对话，相对于Transwell小室通过滤膜进行分子生物交换，更直接、更接近于生理情况。(3)本实用新型应用过程中