专利名称：一类氟化硼络合二吡咯甲川染料、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于生物荧光分析领域的一类新型氟化硼络合二吡咯甲川类荧光 染料、及其制备方法和应用。
背景技术：
荧光分析技术作为一种传统的分析方法，特别是近年来随着新型荧光分析技术的 出现与应用而得到了长足的发展。这些新技术具有灵敏度高、选择性好、取样量少、方法快 速简便等优点，已成为多种研究领域中进行痕量和超痕量甚至分子水平上分析的一种重要 工具。荧光分析方法可提供包括激发光谱、发射光谱和三维光谱以及荧光强度、荧光效率、 荧光寿命等多种物理参数。这些参数反映了分子的各种特性，能从不同角度提供研究对象 的微观结构信息。众所周知，对蛋白质和DNA等生物大分子进行定性分析和定量测定是生物化学和 生命科学中经常涉及的分析内容，建立高灵敏度、低检测限的荧光探针定量测定的方法仍 具有重要意义；另外，在DNA测序、蛋白质标记、新药研发、细胞内组织成分测定、生物药代 跟踪与分析及疾病发病机理研究等领域无不涉及到现代荧光分析检测技术。而荧光染料 作为荧光分析技术中的前提条件，其性能的优劣将直接影响甚至决定整个荧光检测的灵敏 度、可靠性和实用价值。因此，开发性能优异、适合生物荧光分析应用的荧光染料显得尤其 重要。一般来讲，适合荧光分析应用的荧光染料通常要具备以下主要性质一、染料的荧光量子产率较高，最好应该大于0.5。荧光量子产率高将有助于提高 检测的灵敏度，使检测极限维持在较低浓度的水平。荧光量子产率的高低是衡量一个荧光 染料优良与否的最重要因素之一。二、染料应该具有较长的最大吸收和发射波长，最好在可见光区。因为生物体内存 在很多的有机共轭小分子，例如嘌呤、嘧啶、各种氨基酸，蛋白质分子等，他们在紫外区域都 有吸收和发射光谱，如果荧光染料的吸收波长在紫外或者较短波长区域，将会降低荧光探 针的灵敏度；并且某些干扰分子的自发荧光会掩盖探针的发射光谱，容易使检测的结果出 现偏差；另外，紫外激发光照射在生物组织内而造成的散射光也对荧光的检测灵敏度构成 了很大障碍。三、荧光染料应该具有较高的稳定性。无论是在光照下、酸碱条件下，还是在较高 温度下，染料的化学性质应该稳定不会发生严重的光氧化现象，不会在酸碱条件有较小改 变的状况下光谱发生较大的波动，当然也不应该在稍高的温度下就迅速地发生分解。四、染料分子应该具有较好的细胞穿透能力和细胞内的溶解能力。只有这样才能 够设计出适合在细胞中应用的荧光探针。染料分子既要有一定的油溶性又要有一定的水溶 性，油溶性是为了便于穿透细胞膜，水溶性是为了有助于在细胞内很好的分散。染料分子的 这两种性质可以通过引入合适的亲水性或者亲油性基团来调节。五、染料基团对生物体应该没有或者仅有极小的毒害。这就要求荧光探针只对特定的靶标发生作用，而不应该由于自身结构的原因而对细胞内其它活性组织产生破坏作 用，否则就失去了荧光探针的生物应用价值。而作为荧光探针重要组成部分的荧光团当然 对细胞的毒害作用要小，尽量不要干扰细胞的活性。在常用的荧光染料中，芘类与香豆素类荧光染料吸收波长较短，在生物分析中不 利于提高检测的灵敏度；菁染料虽然具有较长的发射波长，但其光稳定性较差，荧光量子产 率也较低。因此，开发具有良好荧光光谱性能的新型荧光染料，仍然是荧光分析技术发展的 关键。氟化硼络合二吡咯甲川(简称B0DIPY)类荧光染料是近二十几年才发展起来并受 到广泛重视的一类新型荧光化合物。由于BODIPY类荧光染料具有荧光量子产率高、摩尔 消光系数大、光谱性质非常稳定(不易受到溶剂极性和PH值的影响)、染料的荧光光谱峰宽 较窄及光稳定性较好等非常优异的理化性能，最近几年来在生物分子荧光标记、核酸检测、 病理分析及细胞显像等诸多领域得到了大量应用。而合成具有特定活性基团，如氨基，羧 基，羟基及特定识别基团等新的活性衍生物，是这类荧光染料在生物化学及生命科学等领 域进一步应用的基础。对应用于生物分析领域的荧光染料，通常是在荧光染料的母体引入带羧基的活性 官能团，并通过N-羟基丁二酰亚胺活化后，直接用于生物分子或生命有机体中进行分析检 测。例如有文献报道在BODIPY染料母体结构的侧面2号位置引入脂肪链羧酸， 合成路线达六步之多，产率只有12%，生产成本很高。[参见Ludmila A. Alexandrova和 Marina K. Kukhanova 等人发表于 Bioconjugate Chem, 2007 ；18 :886-93.的 ^； $ "New Triphosphate Conjugates Bearing Reporter Groups Labelingof DNA Fragments for Microarray Analysis，，]。另外，Niko等人通过含有自由羧基的吡咯与另一分子的取代吡咯发生不对称缩 合，最终生成带有活性羧基的BODIPY类荧光染料，但此方法原料很难合成，且整个反应进 程也不易操作，收率也较低。参见Niko J. Meltola,Rina Wahlroos，和Aleksi E. Soini.发 表于 J. Fluorescence. Vol. 14，No. 5，635-647 的文章。
发明内容
综上所述，本行业内需求采用方便易行的新方法来合成新型的带有羧酸活性基团 的BODIPY类荧光染料，促进该类染料更快更好的应用于生物荧光分析领域。本发明运用取代吡咯与不同的酸酐反应，简单可行地合成了一系列新型的带有羧 酸活性基团的BODIPY类荧光染料。反应步骤简单，几步反应一锅完成，条件温和，产率较高。本发明方法不同于传统的利用醛类或酰氯类化合物与取代吡咯反应制备该系列 染料的合成方法，而是采用酸酐直接与取代吡咯反应，并且对合成方法进行了改进和优化， 从而使产率最高达到25%。合成的染料具有下面的通式I :
权利要求
1.-类氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料，其特征在于该荧光染料具有如下结构通式
2.如权利要求1所述的氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料，其中所述的礼、R2>R3、R5> R6、R7各自为H或Ch的烷基。
3.如权利要求1所述的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料，其中所述的&、R1(1、Rn、R12各 自为H或Cy烷基。
4.如权利要求1-3中任一项所述的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料，其特征在于该染 料具有如下结构式II、III、或IV :
5. 一种制备如权利要求1所述荧光染料的方法，包括(1)被取代的吡咯与有机二元酸酐，在有机溶剂或绝对无水的有机溶剂中发生缩合，在 缩合过程中，两分子的取代吡咯与一分子酸酐进行缩合，其中一分子的取代吡咯为具有取 代基1^ 和R3的吡咯，另一分子的取代吡咯为具有取代基和R7的吡咯，有机二元酸酐选自丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐或邻苯二甲酸酐；有机溶剂选自二氯甲烷、四氢呋 喃或乙腈，所述取代吡咯在所述有机溶剂中的摩尔浓度为0. 1_20%，而且取代吡咯与酸酐 的原料投料摩尔比为0.5-10 1，反应温度控制在15-120°C，反应得到产物二吡咯甲川结 构化合物；(2)将得到的二吡咯甲川结构化合物再与三氟化硼化合物发生反应，并加入有机胺中 和剂，脱掉氟化氢后形成通式I化合物，然后提纯；所述三氟化硼化合物选自气态三氟化 硼、三氟化硼的乙醚络合物、或其他能够在常温溶液状态下释放出三氟化硼的化合物；反应 温度为-10°C -IOO0C ；三氟化硼化合物的加入量是使二吡咯甲川结构化合物与三氟化硼 化合物的摩尔比为1 0.1-10。
6.一种权利要求1所述的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料的用途，它用于合成标记蛋 白质或DNA的生物分子探针。
7.—种权利要求1所述的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料的用途，它用于生物荧光分 析或生物分子标记。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述的生物分子标记是蛋白质标记、DNA标记、多肽 标记、抗原或抗体标记、或抗抗体标记。
9.如权利要求7所述的用途，其中所述的荧光分析是荧光免疫分析、荧光显微镜分析、 或荧光比色分析。
全文摘要
本发明涉及一类氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料，该荧光染料具有通式I式中R1、R2、R3、R5、R6、R7各自为H或C1-8烷基；R8为结构式X、Y、Z或P的基团；M为H、Na、K、N(R9R10R11R12)或N-琥珀酰亚胺基，其中R9、R10、R11、R12各自为H、C1-8烷基、或带有取代基-OH、醚键、或羧基的C1-8烷基。该染料由取代吡咯直接与酸酐反应而合成，具有良好的光物理特性、稳定性和细胞穿透能力和细胞内的溶解能力，尤其适用于生物荧光分析和生物标记。
文档编号C09K11/06GK102061103SQ20091026256
公开日2011年5月18日 申请日期2009年12月25日 优先权日2009年11月11日
发明者孙世国, 张剑洲, 彭孝军, 樊江莉, 王东川, 王丽 申请人:大连理工大学, 珠海纳思达企业管理有限公司