专利名称：用取代的花青染料进行荧光成像的制作方法
用取代的花青染料进行荧光成像本申请要求2009年4月17日提交的美国临时专利申请第61/170，579号，2009年 6月5日提交的美国临时专利申请第61/184，750号的优先权。这些申请的内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。
背景技术：
花青染料广泛用于标记配体或生物分子，用于各种应用，例如DNA测序。(参见例如，美国专利5，571，388，揭示了通过花青染料的方式来鉴定DNA链的示例性方法)。科学家偏爱在生物学应用中使用花青染料，除了其它原因之外，还因为这些染料中的许多在光谱的近红外(NIR)区域(600-1000nm)发荧光。这就使得花青染料不易受到生物分子自发荧光的干扰。花青染料的其它优点包括例如1)花青染料强吸收和发射荧光；幻许多花青染料在荧光显微镜下不会快速褪色；幻可制备花青染料衍生物作为有效的偶联试剂；4)许多结构和合成过程易于获得并且染料类别多样；和5)花青染料相对较小(通常分子量约为 1，000道尔顿)，因而它们不会以可能降低标记的生物分子到达其结合位点或执行其功能的能力的方式导致可察觉的空间干扰。虽然它们具有这些优点，许多已知的花青染料也存在许多缺点。一些已知的花青染料在存在生物试验中常用的某些试剂的情况下不稳定。这些试剂包括氢氧化铵、二硫苏糖醇(DTT)、伯胺和仲胺、以及过硫酸铵(APS)。而且，一些已知的花青染料缺乏诸如DNA测序、Western印迹、细胞内Western免疫荧光试验、体外和体内光学成像、显微镜检查和基因分型等生物应用所必需的热稳定性和光稳定性，而另一些染料不对称，使其难以以高纯度和产率的方式合成(参见美国专利6，747’ 159，其阐述了对称染料的一些优点)。出于这些原因，需要在标记生物分子以及体内成像进行诸如癌症等疾病的诊断和预后中使用的稳定和对称的花青染料。这些组合物和方法将有助于分析各种治疗的效果。 本发明满足了这些和其它需求。发明概述本发明提供了化合物、生物偶联物、标记方法以及非侵入性测定和检测靶分子的方法，因而解决了本领域中的问题。在一个实施方式中，本发明提供了式I的化合物
权利要求
1.式I的化合物
2.如权利要求1所述的化合物，其中，R3、R4、R5和R6各自独立地选自氢、烷基、烯基、 卤素、烷氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、酰氨基、磺酸根合、烷氧基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基和磺酸根合烷基。
3.如权利要求2所述的化合物，其中，Q是
4.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，R2a和R2b是甲基。
5.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，R9是-L-Y-Z。
6.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，R1是(CH2)30迟或(CH2),S03_;r是 1-20的整数。
7.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，r是2、3或4。
8.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中-L-Y-是(CH2)t;Z是羧基或活化酰基；t是1-10的整数。
9.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，RiRlt^R11和R12各自独立地选自氢、 烷基、卤素和磺酸根合。
10.如权利要求9所述的化合物，具有下式
11.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，Q是
12.如权利要求11所述的化合物，其具有下式
13.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，Q是
14.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，R2a和R2b是甲基。
15.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，R9是-L-Y-Z。
16.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，R1是(CH2)303或(CH2)rSO3^r^ 1-20的整数。
17.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，r是2、3或4。
18.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，两个R7与两个R7所键合的多烯的插入链段一起连接形成选自5-元环和6-元环的环，所述环额外地被0-3个R14所取代。
19.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，-L-Y-是(CH2)t;Z是羧基或活化酰基；t是1-10的整数。
20.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，R8，R10,R11和R12各自独立地选自 氢、烷基、卤素和磺酸根合。
21.如权利要求1所述的化合物，其具有下式Ia
22.如权利要求21所述的化合物，其中，Q是
23.如权利要求21或22所述的化合物，其中，R2a和R2b是甲基。
24.如权利要求21或22所述的化合物，其中，R9是-L-Y-Z。
25.如权利要求21-24中任一项所述的化合物，其中，R1是(CH2)30迟或(CH2)rSO3^；r 是1-20的整数。
26.如权利要求21-25中任一项所述的化合物，其中，r是2、3或4。
27.如权利要求21-25中任一项所述的化合物，其中，-L-Y-是(CH2)t；Z是羧基或活化酰基；t是1-10的整数。
28.如权利要求21-27中任一项所述的化合物，其中，R8Alt^R11和R12各自独立地选自 氢、烷基、卤素和磺酸根合。
29.如权利要求观所述的化合物，其具有下式
30.如权利要求观所述的化合物，其具有下式
31.如权利要求观所述的化合物，其中，Q是
32.如权利要求31所述的化合物，其具有下式
33.如权利要求31所述的化合物，其具有下式
34.如权利要求21所述的化合物，其中，Q是
35.如权利要求34所述的化合物，其中，R2a和R2b是甲基。
36.如权利要求34所述的化合物，其中，R9是-L-Y-Z。
37.如权利要求34-36中任一项所述的化合物，其中，R1是(CH2)rSO3H或(CH2)rSO3^；r 是1-20的整数。
38.如权利要求34-36中任一项所述的化合物，其中，r是2、3或4.
39.如权利要求34-36中任一项所述的化合物，其中，两个R7与两个R7所键合的多烯的插入链段一起连接形成选自5-元环和6-元环的环，所述环额外地被0-3个R14所取代。
40.如权利要求34-37中任一项所述的化合物，其中，-L-Y-是(CH2)t；Z是羧基或活化酰基；t是1-10的整数。
41.如权利要求34-40中任一项所述的化合物，其中，R8Alt^R11和R12各自独立地选自 氢、烷基、卤素和磺酸根合。
42.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物在约 550-1000nm的波长范围内发荧光。
43.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物在约600-850nm 的波长范围内发荧光。
44.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物在约600-725nm 的波长范围内发荧光。
45.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物在约725-850nm 的波长范围内发荧光。
46.式II的生物偶联物化合物
47.如权利要求46所述的化合物，其中，R3，R4，R5和R6各自独立地选自氢、烷基、烯基、 卤素、烷氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、酰氨基、磺酸根合、烷氧基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基和磺酸根合烷基.
48.如权利要求46-47中任一项所述的化合物，其中，Ql是
49.如权利要求46-48中任一项所述的化合物，其中，1^和1^是甲基。
50.如权利要求46-48中任一项所述的化合物，其中，R9是-L-Y-Z。
51.如权利要求46-50中任一项所述的化合物，其中，R1是(CH2)rSO3H或(CH2)rSOf；r 是1-20的整数。
52.如权利要求46-51所述的化合物，其中，r是2、3或4。
53.如权利要求46-51所述的化合物，其中，-L-Y-是(CH2)t；Z是羧基或活化酰基；t是 1-10的整数。
54.如权利要求46-53中任一项所述的化合物，其中，I^RicU11和R12各自独立地选自 氢、烷基、卤素和磺酸根合。
55.如权利要求46-54中任一项所述的化合物，其中，Ql是
56.如权利要求46-47中任一项所述的化合物，其中，Ql是
57.如权利要求46-56中任一项所述的化合物，其中，铲和俨是甲基。
58.如权利要求46-56中任一项所述的化合物，其中，R9是_L_Y_Z。
59.如权利要求46-58中任一项所述的化合物，其中，R1是(CH2)rSO3H或(CH2)rSOf；r 是1-20的整数。
60.如权利要求46-58中任一项所述的化合物，其中，r是2、3或4。
61.如权利要求46-58中任一项所述的化合物，其中，两个R7与两个R7所键合的多烯的插入链段一起连接形成选自5-元环和6-元环的环，所述环额外地被0-3个R14所取代。
62.如权利要求46-59中任一项所述的化合物，其中，-L-Y-是(CH2)t；Z是羧基或活化酰基；t是1-10的整数。
63.如权利要求46-62中任一项所述的化合物，其中，I^RicU11和R12各自独立地选自 氢、烷基、卤素和磺酸根合。
64.如权利要求46所述的化合物，其具有下式Ia:
65.如权利要求64所述的化合物，其中，Ql是
66.如权利要求64-65中任一项所述的化合物，其中，1^和1^是甲基。
67.如权利要求64-65中任一项所述的化合物，其中，R9是_L_Y_Z。
68.如权利要求64-67中任一项所述的化合物，其中，R1是(CH2),SO3H或(CH2),S03_；r 是1-20的整数。
69.如权利要求64-68中任一项所述的化合物，其中，r是2、3或4，。
70.如权利要求64-68中任一项所述的化合物，其中，-L-Y-是(CH2)t；Z是羧基或活化酰基；t是1-10的整数。
71.如权利要求64-70中任一项所述的化合物，其中，I^RicU11和R12各自独立地选自 氢、烷基、卤素和磺酸根合。
72.如权利要求64-71中任一项所述的化合物，其中，是
73.如权利要求64所述的化合物，其中，QL是
74.如权利要求64-73中任一项所述的化合物，其中，1^和1^是甲基。
75.如权利要求64-73中任一项所述的化合物，其中，R9是_L_Y_Z。
76.如权利要求64-75中任一项所述的化合物，其中，R1是(CH2)rSO3H或(CH2)rSO3^；r 是1-20的整数。
77.如权利要求64-76中任一项所述的化合物，其中，r是2、3或4。
78.如权利要求64-76中任一项所述的化合物，其中，两个R7与两个R7所键合的多烯的插入链段一起连接形成选自5元环和6元环的环，所述环额外地被0-3个R14所取代。
79.如权利要求64-76中任一项所述的化合物，其中，-L-Y-是(CH2)t；Z是羧基或活化酰基；t是1-10的整数。
80.如权利要求64-79中任一项所述的化合物，其中，I^RicU11和R12各自独立地选自 氢、烷基、卤素和磺酸根合。
81.如权利要求46-80中任一项所述的化合物，其中，所述化合物在约550-1000nm的波长范围内发荧光。
82.如权利要求46-81中任一项所述的化合物，其中，所述化合物在约600-850nm的波长范围内发荧光。
83.如权利要求46-82中任一项所述的化合物，其中，所述化合物在约600-725nm的波长范围内发荧光。
84.如权利要求46-82中任一项所述的化合物，其中，所述化合物在约725-850nm的波长范围内发荧光。
85.如权利要求46-80中任一项所述的化合物，其中，所述生物分子选自葡糖胺、甘油醛、赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、 艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖以及它们的衍生物。
86.如权利要求85所述的化合物，其中，所述生物分子选自2-脱氧-D-葡萄糖、2-脱氧-L-葡萄糖和外消旋2-脱氧葡萄糖。
87.如权利要求46-86中任一项所述的化合物，其中，所述生物分子选自促生长素抑制素、内皮他汀、糖、核酸、核苷酸、三磷酸核苷酸、多磷酸核苷酸、寡糖、适体、脂质体、PEG、 促血管生成素、血管他汀、血管紧张素II、α 2-抗血纤维蛋白溶素、膜联蛋白V、β-环糊精十四硫酸酯、内皮糖蛋白、内皮唾液酸蛋白、内皮他汀、表皮生长因子、纤维蛋白、纤维蛋白肽β、成纤维细胞生长因子、FGF-3、碱性纤连蛋白、烟曲霉素、肝素、肝细胞生长因子、透明质烷、反胰岛激素样生长因子、干扰素-α、β抑制剂、IL抑制剂、层粘连蛋白、白血病抑制因子、利诺胺、金属蛋白酶、金属蛋白酶抑制剂、抗体、抗体片段、无环RGD肽、环状RGD肽、 胎盘生长因子、胎盘多育曲菌素-相关蛋白、血纤蛋白溶解酶原、血纤蛋白溶解酶原激活因子、血纤蛋白溶解酶原激活因子抑制剂-1、血小板活化因子拮抗剂、血小板衍生生长因子、 血小板衍生生长因子受体、血小板衍生生长因子受体、血小板衍生的内皮细胞生长因子、 PTN蛋白、多育曲菌素、多育曲菌素-相关蛋白、选择蛋白、SPARC、蛇毒、P物质、苏拉明、金属蛋白酶的组织抑制剂、沙利度胺、凝血酶、凝血酶-受体-激活性十四肽、转化生长因子-α、 β、转化生长因子受体、肿瘤生长因子-α、肿瘤坏死因子、玻连蛋白和钙黄绿素。
88.—种标记生物分子的方法，所述方法包括使权利要求1-45中任一项所述的化合物与生物分子反应。
89.如权利要求88所述的标记生物分子的方法，其中，所述生物分子选自无环终止子三磷酸酯、抗体、抗原、卵白素、糖、脱氧核酸、酶辅因子、酶底物、DNA片段、RNA片段、半抗原、激素、核酸、核苷酸、核苷酸三磷酸酯、核苷酸多聚磷酸酯、寡糖、肽、ΡΝΑ、多糖、蛋白质和抗生物素蛋白链菌素。
90.一种标记生物分子的方法，所述方法包括使权利要求1-45中任一项所述的化合物与生物分子反应；所述生物分子选自促生长素抑制素、内皮他汀、糖、寡糖、适体、脂质体、PEG、促血管生成素、血管他汀、血管紧张素II、α 2-抗血纤维蛋白溶素、膜联蛋白V、β-环糊精十四硫酸酯、内皮糖蛋白(endoglin)、内皮唾液酸蛋白、内皮他汀、表皮生长因子、纤维蛋白、纤维蛋白肽β、成纤维细胞生长因子、FGF-3、碱性纤连蛋白、烟曲霉素、肝素、肝细胞生长因子、透明质烷、反胰岛激素样生长因子、干扰素-α、β抑制剂、IL抑制剂、层粘连蛋白、白血病抑制因子、利诺胺、金属蛋白酶、金属蛋白酶抑制剂、抗体、抗体片段、无环RGD肽、环状RGD肽、 胎盘生长因子、胎盘多育曲菌素-相关蛋白、血纤蛋白溶解酶原、血纤蛋白溶解酶原激活因子、血纤蛋白溶解酶原激活因子抑制剂-1、血小板活化因子拮抗剂、血小板衍生生长因子、 血小板衍生生长因子受体、血小板衍生生长因子受体、血小板衍生的内皮细胞生长因子、 PTN蛋白(pleiotropin)、多育曲菌素、多育曲菌素_相关蛋白、选择蛋白、SPARC、蛇毒、P物质、苏拉明、金属蛋白酶的组织抑制剂、沙利度胺、凝血酶、凝血酶-受体-激活性十四肽、转化生长因子-α、β、转化生长因子受体、肿瘤生长因子-α、肿瘤坏死因子、玻连蛋白和钙黄绿素。
91.如权利要求90所述的方法，其中，所述生物分子选自葡糖胺、甘油醛、赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖以及它们的衍生物。
92.如权利要求91所述的方法，其中，所述生物分子选自2-脱氧-D-葡萄糖，2-脱氧-L-葡萄糖和外消旋2-脱氧葡萄糖。
93.一种成像方法，所述方法包括将权利要求1-87中任一项所述的化合物给予组织或生物体。
全文摘要
揭示了可用于在近红外光谱范围内非侵入性成像的化合物和方法。提供了式(I)的花青化合物其中，Q是选自以下的聚次甲基桥键(a)和(b)的一部分也提供了式I化合物的生物偶联物，用该化合物标记生物分子的方法以及成像方法。
文档编号C09B23/08GK102459469SQ201080026485
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月16日 优先权日2009年4月17日
发明者D·R·德雷耶, X·徐 申请人:利康股份有限公司