专利名称：一种修饰量子点的新型多肽配体的制作方法
技术领域：
本发明涉及纳米生物技术领域，具体涉及ー种修饰量子点的新型多肽配体。
背景技术：
量子点(QDs)是ー种零维半导体纳米晶体，近似球形，直径f 12nm，可分散于水或者有机溶剂中形成胶体，由于QDs的尺寸接近甚至小于相应半导体相材料的激子(电子-空穴对)Bohr半径，受激发时产生的电子和空穴被限制在狭小的三维空间，因而表现出量子效应，与传统的有机染料相比，QDs具有更优异的光谱性质，如激发光谱宽且连续分布，而发射光谱呈对称分布且宽度窄，颜色可调，并且光化学稳定性高，不易光解(Marcel BJ, MarioM, Peter G, et al. Science 1998，281，2013-2016)。这些优越的性能使 QDs 在体内细胞成像和生物特定标记等方面都得到了广泛应用，它正在并将日益成为分子细胞成像研究中非常重要的一种探针工具。因此，具有高性能的水溶性量子点的合成受到了密切关注。目前，在生物标记中应用最广泛的是金属有机溶剂法合成的脂溶性CdSe/ZnS量子点。因此，必须将脂溶性的QDs转化成水溶性的QDs才能进行生物标记。而将脂溶性的QDs转化成水溶性的QDs最常用的方法是先用巯基小分子(如巯基こ酸、巯基丙酸、谷胱甘肽、巯基丁ニ酸等)取代脂溶性QDs表面的配体，然后通过偶联剂与生物分子偶联；另ー种常用的QDs标记生物分子的方法是与含有组氨酸标签的多肽或蛋白結合。QDs表面的Zn原子和多组氨酸残基的金属亲和协调作用，含有组氨酸残基的蛋白质和多肽能够直接接到QDs表面的Zn原子，这种方法具有很好的稳定性，已逐渐成为生物标记中ー种常用的方法。Sapsford 等(Sapsford K. E. , Pons T. , Medintz I. L. , et al. J. Phys. Chem.C2007, 111，11528-11538)系统地研究了含组氨酸多肽与QDs之间的相互作用及结合常数等，6个组氨酸序列与QDs的结合速率是约100秒，KtT1约为InM ;但其结果证实组氨酸超过6个的线性多肽序列并不能提高结合速率，这可能是因为长链中的组氨酸不能全部与QDs结合；同时6个组氨酸序列与QDs的结合不是非常稳定，进入生物体内有可能被其他生物分子取代。因此，我们考虑改变组氨酸的结构，设计ー种新型的多肽配体，使更多的组氨酸与QDs结合，以此提高结合速率及稳定性，从而大大提高QDs在生物标记领域中的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有多肽配体与QDs结合速度慢、稳定性差等问题，限制其在生物领域中的普及使用，为解决上述技术问题，本发明提供ー种与QDs结合速度快，而且稳定性好的新型多肽配体。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种修饰量子点的新型多肽配体，其特征在干包括用于结合量子点的组氨酸序列(I)、提供多肽刚性结构的序列(2)、功能序列(3)和带负电荷的序列(4)，各序列之间以肽键相结合。所述的组氨酸序列(I)由Lys侧链修饰为4个组氨酸标签(H6)序列；所述的刚性结构的序列为9个Ρι·ο序列；所述的功能序列(3)使得量子点与多肽连接后具有生物功能，如酶切序列LVPRGS或者具有靶向性的多肽分子等；所述的带负电荷的序列(4)使量子点保持稳定，通常为2 4个带负电的氨基酸组成，如DD、DDD、DDDD、EE、EEE、EEEE或D与E的任意组合。本发明所述的量子点为含有Zn的量子点，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。采用上述的技术方案后，本发明取得的有益效果是，本发明提供的修饰量子点的新型多肽配体，合成方法简单，可重复性高，与量子点结合速度快，稳定性高，解决了现有量子点多肽配体稳定性不足而导致其在生物体内的不稳定，进一步拓展了量子点一多肽复合物作为纳米荧光探针在生物中的应用。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图I是修饰QDs的新型多肽配体(H24)的结构示意图；图中I是结合QDs的组氨酸序列、2是提供多肽刚性结构的序列、3是功能序列、4是带负电荷的序列。图2是用荧光分光光度计检测H24-Cy5与QDs结合的速率图，检测波长612nm(量子点荧光发射波长为612nm)。其中a是对照实验H6_Cy5与QDs混合后检测QDs荧光强度变化，b是H24-Cy5与QDs混合后检测QDs荧光强度变化。([QD] = [p^)tide]=16nM)图3是用毛细管电泳检测H24_Cy5与QDs结合的稳定性。电泳条件25mM硼酸缓冲液(pH 9. 3)，电压为 18kV。H24-Cy5:QD=20:l, [QD] = O. 5 μ Μ。其中 a 是对照试验，没有加取代分子。b是H24-Cy5与QDs混合后加入取代小分子(40倍的GP9G2H6和40倍的H6-GFP)。检测波长，实线为612nm检测QDs，虚线为661nm检测Cy5。
具体实施例方式实施例本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。实施例I本发明所述的方法采用常规的固相Fmoc法，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸。I、基本材料(I)树脂与连接分子固相Fmoc法选择的树脂为RinkAinide-ChemMatrixR W
月旨。这种树脂具有非常好的溶胀性，可以使肽链之间更好地进行缩合反应，且有足够的网络空间满足不断增长的肽链。采用HBTU和HOBt作为连接分子，将多肽分子固定到树脂上。(2)单体合成所用单体为经化学修饰的α -氨基酸。2、反应步骤第一步，将第一个氨基酸共价连接到树脂上加入适当的缩合剂如HBTU和HOBt，使被保护氨基酸羧基端与树脂形成共脂以完成氨基酸的固定；第二步，去保护
采用碱性溶剂20%哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基。第三步，激活和交联采用活化剂HBTU和HOBt活化下一个氨基上的羧基，与树脂上的氨基交联，形成用键。第四步，重复第二步和第三步，反复循环添加单体氨基酸，直到合成完成。3、合成后处理( 1)洗脱和脱保护用脱保护剂三氟乙酸(TFA)将肽链从树枝上洗脱下来，并脱闻
保护基。(2 ) HPLC分析纯化，冻干保存。通过上述方法，合成多肽序列H24_G2P9GLVPRGSK (Cy5) DDD (H24_Cy5)，如下
权利要求
1.一种修饰量子点的新型多肽配体，其特征在于该多肽配体包括用于结合量子点的组氨酸序列(I)、提供多肽刚性结构的序列(2)、功能序列(3)和带负电荷的序列(4)，各序列之间以肽键相结合。
2.根据权利要求I所述的一种修饰量子点的新型多肽配体，其特征在于所述的组氨酸序列(I)由赖氨酸侧链修饰为4个组氨酸标签H6序列。
3.根据权利要求I所述的一种修饰量子点的新型多肽配体，其特征在于所述的提供多肽刚性结构的序列(2)为9个脯氨酸序列。
4.根据权利要求I所述的一种修饰量子点的新型多肽配体，其特征在于所述的功能序列(3)为酶切序列LVPRGS或者具有靶向性的多肽序列。
5.根据权利要求I所述的一种修饰量子点的新型多肽配体，其特征在于所述的带负电荷的序列(4)为2 4个带负电的氨基酸组成，如DD、DDD、DDDD、EE、EEE、EEEE或D与E的任意组合。
6.根据权利要求I所述的一种修饰量子点的新型多肽配体，其特征在于所述的量子点为含有 Zn 的量子点，如 CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe 或者 CdTe/ZnSe。
全文摘要
本发明公开了一种修饰量子点的新型多肽配体(H24)，属于纳米生物技术领域。本发明中的新型多肽配体包括用于结合量子点的组氨酸序列(1)、提供多肽刚性结构的序列(2)、功能序列(3)和带负电荷的序列(4)，各序列之间以肽键相结合。该配体合成方法简单，其N端通过4个组氨酸标签序列与量子点结合，大大提高了配体与量子点的结合速率及稳定性，可以作为纳米荧光探针广泛应用于生物标记。
文档编号C09K11/06GK102911259SQ20121035536
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者王建浩, 邱琳, 蒋鹏举, 王车礼, 夏江 申请人:常州大学