一种磁、发光双功能纳米核壳结构羟基磷灰石颗粒的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种磁、发光双功能纳米核壳结构羟基磷灰石颗粒的制备方法，属于纳米功能材料制备【技术领域】。本发明通过控制共沉淀条件，在磁性羟基磷灰石纳米粒子表面继续生长纯羟基磷灰石，实现磁性粒子的羟基磷灰石薄层包覆，从而抑制淬灭稀土离子发光的磁性离子(如Fe3+)的溶出。具有羟基磷灰石包覆层的磁性羟基磷灰石纳米粒子表面再继续生长稀土掺杂的羟基磷灰石，从而获得具有核壳结构的磁、发光羟基磷灰石纳米颗粒。本发明提供的核壳型磁、发光羟基磷灰石纳米颗粒具有良好的磁性能、发光性能和生物相容性，进而兼具靶向定位和跟踪标记的功能，在细胞内外物质的检测、核酸的杂交与测序、疾病早期诊断、基因药物的输运以及磁热治疗等生物医学领域有良好的应用前景。
【专利说明】一种磁、发光双功能纳米核壳结构羟基磷灰石颗粒的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米功能材料制备【技术领域】,特别涉及一种磁、发光双功能纳米核壳结构羟基磷灰石颗粒的制各方法。
【背景技术】
[0002]发光标记法在细胞内外物质的检测、核酸的杂交与测序、疾病早期诊断与治疗、药物研发等生物学和医学研究领域里发挥了越来越重要的作用。发光标记法最常用的标记物为有机突光标记物。有机突光标记物具有一些难以克服的缺陷，如多数突光试剂存在荧光信号不稳定以及毒副作用等。因此，研究开发新的、高灵敏的无机纳米发光标记物倍受关注。稀土掺杂无机纳米晶发光标记物和发光量子点标记物是当前国际上研究报道最多的标记物，有些已进入临床应用阶段。稀土掺杂无机纳米晶在制备和使用中对生物体毒性较量子点标记物低，具有量子点无法比拟的优势。在众多的稀土掺杂无机纳米晶发光标记物中，稀土掺杂羟基磷灰石是最有应用前景的体系之一。羟基磷灰石是人体和动物体内骨骼和牙齿的主要无机组成成分，具有良好的生物兼容性和生物活性。羟基磷灰石本身在可见光激发下并无明显的荧光发射产生，不能成为发光标记物。镧系元素的离子Ln3+半径接近Ca2+，生物活性也与之类似，而且它们具有较好的荧光特性。已有很多研究表明，Ca2+可以比较容易地被Ln3+所取代。发光最强的Ln3+(Eu3+;Ce3+，Tb3+)掺杂HAP所获得的发光纳米晶不但具有优异的发光特点，而且具有良好的生物活性和生物相容性，可以在生物体内长期稳定存在，便于长期观察和研究。国内外有关稀土掺杂羟基磷灰石纳米晶应用在生物标记领域的研究报道越来越多。Doat等制备了类似于人体骨组织中磷灰石无机相的Eu3+(2~3% )掺杂磷灰石，被用作生物标记探针研究纳米粒子在人膜腺细胞内的分布情况【Doat A, PelleF, Gardant N, et al.Synthesis of luminescentbioapatite nanopartieles for Utilization as a biological probe.J Solid StateChem, 2004, 177(4-5):1179-1187.】。浙江大学李玲等先用共沉淀的方法合成粒度为20nm左右HAP纳米晶，之后在纳米晶表面沉`淀掺杂稀土离子Tb3+，形成HAP发光纳米标记粒子并用该粒子成功标记兔脊髓干细胞【Li L, Liu Y, Tao J, et al.Surface Modificationof Hydroxyapatite Nanocrystallite by a Small Amount of Terbium Provides aBiocompatible Fluorescent Probe.J Phys Chem C, 2008，112 (32),12219-12224.】。
[0003]磁性纳米粒子具有超顺磁性，在磁靶向药物输送、磁共振成像、磁热治疗和细胞分离等领域具有广阔的应用前景。羟基磷灰石具有优良的生物相容性和生物活性，制备磁性羟基磷灰石用于生物医学领域逐渐受到人们的青睐。目前，有两种方式赋予羟基磷灰石磁性能:⑴具有磁性的离子(Fe3+、Co2+、Mn2+、La3+等)取代羟基磷灰石晶格中的Ca2+掺杂；⑵磁性核(Fe304、Y -Fe2O3和MFe2O4, M为N1、Co、Mn、Zn等)表面包覆羟基磷灰石。Tampieri等人以FeCl2.4H20和FeCl3.6H20为Fe源取代Ca制备了磁性羟基磷灰石，Fe 存在于羟基憐灰石晶格中【Anna Tampieri, Teresa D’Alessandro, Monica Sandri, etal.1ntrinsic magnetism and hyperthermia in bioactive Fe-doped Hydroxyapatite.Acta biomaterial, 8 (2012) 843-851.】。另外，Liu等采用均匀沉淀法合成粒径25nm左右的羟基磷灰石包覆Fe3O4复合粒子，重点考察煅烧温度对合成的羟基磷灰石包覆Fe3O4复合粒子的磁性能和光催化性能的影响【Youcai Liu, Hong Zhong, Lifeng Li, et al.Temperaturedependence of magnetic property and photocatalytic activity of Fe3O4/Hydroxyapatite nanoparticles.Materials Research Bulletin,45 (2010)2036-2039】。袁程远等采用共沉淀法制备出Y-Fe2O3AiAP并负载氧化钥对其催化性能进行了研究[Yuan Chengyuan, Zhang Yan, Chen Jing.Molybdenum oxide supported on hydroxyapatite-encapsulated y-Fe2O3:anovel magnetically recyclable catalyst for olefinepoxidation.Chin.J.Catal., 32(2011) 1166-1172】。
[0004]发光标记因其易于检测和灵敏度高的特点受到人们的青睐，但发光标记试验过程中标记粒子只能起单纯的标识作用，人们难于控制标记粒子的去向，难于富集和分离标记粒子，更难于通过标记粒子对被标记物施加作用，成为发光标记粒子的功能缺陷。磁性纳米材料应用于生物医药领域，借助外加磁场，容易达到操纵、控制和分离的效果，但是通常还需要其他技术配合，如激光检测和荧光标记等，以提供简单直观地检测和示踪手段。磁、发光相结合方法成为最理想的标记实验方法。因此，开发一种既具有磁性又具有发光性能的生物相容性好的复合羟基磷灰石纳米粒子成为当前的研究热点。如Ashokan等以沉淀法合成了 Gd3+和Eu3+掺杂磁性发光双功能的HAP纳米颗粒，并进行了磁、发光性能以及细胞标记方面的研究【A.Ashokan, D.Menon, S.Nair, et al.A molecularreceptor targeted, hydrooxyappatite nanocrystal based muli—modal contrastagent.Biomaterials, 31 (2010) 2606-2616】。Chen 等采用微波化学法也制备出 Gd3+和Eu3+掺杂磁性发光双功能的HAP纳米颗粒【F.Chen, P.Huang, Y.J.Zhu, et al.Thephotoluminescence, drug delivery and imaging properties of multifunctional Eu3+/Gd3+dual-doped hydroxyapatite nanorods.Biomaterials, 32 (2011) 9031-9039】。中国发明专利(申请公布号CN1 02020258A) “一种磁性荧光羟基磷灰石纳米复合结构的制备方法”公开了一种以磁性纳米粒子(Fe3O4或Y-Fe2O3)为核，表面包覆一层发光羟基磷灰石的方法制备磁和发光双功能颗粒。目前尚未见以Fe3+和Co2+掺杂的羟基磷灰石为磁性核，通过控制磁性核的生长，表面包覆稀土掺杂羟基磷灰石发光壳层的核壳结构纳米复合磁、发光双功能颗粒的研究报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种磁、发光双功能纳米核壳结构羟基磷灰石颗粒的制备方法。本发明通过控制共沉淀条件，在磁性羟基磷灰石纳米粒子表面继续生长纯羟基磷灰石，实现磁性粒子的羟基磷灰石薄层包覆，从而抑制淬灭稀土离子发光的磁性离子(如Fe3+)的溶出。具有羟基磷灰石包覆层的磁性羟基磷灰石纳米粒子表面再继续生长稀土掺杂的羟基磷灰石，从而获得具有核壳结构的磁、发光羟基磷灰石纳米颗粒。本发明提供的核壳型磁、发光羟基磷灰石纳米颗粒具有良好的磁性能、发光性能和生物相容性，进而兼具靶向定位和跟踪标记的功能，在细胞内外物质的检测、核酸的杂交与测序、疾病早期诊断、基因药物的输运以及磁热治疗等生物医学领域有良好的应用前景。[0006]本方法步骤:
[0007]A:磁性羟基磷灰石(M1MiAP)的水热法制备
[0008](I)取一定量的高分子模板剂和磷酸盐置于蒸馏水中，磁力搅拌至混合均匀，得溶液A。
[0009](2)按磁性金属离子Mn+/ (Ca2++Mn+)的摩尔比=0.05~0.4，取一定量的磁性金属盐和钙盐置于蒸馏水中，磁力搅拌至混合均匀，得溶液B。
[0010](3)将溶液B缓慢滴加到溶液A中，控制反应溶液中Ca2+和Mn+总摩尔数与PO/—摩尔数之比为1.67，反应溶液中(Ca2++Mn+)的浓度为0.2~2.0mol/L，用碱溶液调节其pH值至10~11，搅拌0.5~2h后将悬浮液倒入反应釜中，在120°C~180°C反应3~20h。
[0011](4)将所得沉淀离心分离，用蒸馏水和无水乙醇各洗涤数次，得羟基磷灰石磁性核(M11+-HAP)。
[0012]B:M11+-HAP表面包覆薄层羟基磷灰石
[0013](5)取一定量Mn+_HAP磁性核和磷酸盐超声分散到有机醇-水溶液中，获得悬浮液C0
[0014](6)按反应溶液中Ca2+与P043_摩尔比为1.67，称取一定量的钙盐加入到有机醇-水溶液中，磁力搅拌，使溶液混合均匀，获得溶液D。
[0015](7)将溶液D缓慢滴加到悬浮液C中，再用碱溶液调节其pH值至9~10，控制反应溶液中Ca2+的浓度为0.01~`0.lmol/L，在20~75°C下中速搅拌反应2h。
[0016](8)将所得沉淀离心分离，用蒸馏水和无水乙醇各洗涤数次后在80°C下干燥16~24h，然后在200~50(TC条件下煅烧I~3h，获得表面包覆薄层羟基磷灰石的磁性羟基磷灰石(Μη+-ΗΑΡ@ΗΑΡ)纳米颗粒。
[0017]C:M11+-HAPiHAP表面包覆发光羟基磷灰石
[0018](9)取适量Μη+_ΗΑΡ@ΗΑΡ粉体、磷酸盐和分散剂超声分散到有机醇-水溶液中，获得悬浮液E。
[0019](10)按稀土离子Ln3+/(Ca2++Ln3+)的摩尔比=2~11 %，取一定量稀土盐溶液和钙盐加入有机醇-水溶液中，磁力搅拌，使溶液混合均匀，获得溶液F。
[0020](11)将溶液F缓慢滴加到悬浮液E中，控制反应溶液中Ca2+和Ln3+总摩尔数与PO/-之比为1.67，再用碱溶液调节其pH值至9~10，在20~75°C下中速搅拌反应2h。
[0021](12)将所得沉淀离心分离，用蒸馏水和无水乙醇各洗涤数次，在80°C下真空干燥16~24h，获得核壳结构磁、发光羟基磷灰石(Mn+-HAP@HAP@Ln3+-HAP)。
[0022]本发明优点:
[0023]1、本发明所制备的核壳结构羟基磷灰石颗粒结构稳定，兼具磁性能和发光性能，而且生物相容性良好。
[0024]2、本发明通过在磁性羟基磷灰石纳米粒子表面包覆一层羟基磷灰石来抑制淬灭稀土离子发光的金属离子(如Fe3+)的溶出，从而提高磁、发光双功能纳米核壳结构羟基磷灰石颗粒的发光性能。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为本发明实施例1所得样品的X射线衍射图谱；[0026]图2为本发明实施例1制各的磁、发光羟基磷灰石纳米颗粒的TEM图；
[0027]图3为本发明实施例1制备的磁、发光羟基磷灰石纳米颗粒的激发(a)和发射(b)光谱图；
[0028]图4为本发明实施例1所得样品的磁化曲线图。
[0029]图5为本发明实施例2制备的磁、发光羟基磷灰石纳米颗粒的TEM图；
[0030]图6为本发明实施例2制备的磁、发光羟基磷灰石纳米颗粒的激发(a)和发射(b)光谱图；
[0031]图7为本发明实施例3制备的磁、发光羟基磷灰石纳米颗粒的激发(a)和发射(b)光谱图。
【具体实施方式】
[0032]实施例1:
[0033]A =Fe3+和Co2+掺杂的羟基磷灰石磁性核(Fe3+/C02+-HAP)的水热法制备
[0034](I)取0.420g十六烷基溴化铵(CTAB)和12mmol磷酸氢二铵((NH4)2HPO4)溶于24mL蒸馏水中，磁力搅拌至混合均匀，得溶液A。
[0035](2)取4mLlmol/L硝酸铁和硝酸钴的混合液(Fe3+:Co2+=2:1)和16mmolCa (NO3) 2.4H20置于36mL蒸馏水中，磁力搅拌至混合均匀，得溶液B。
[0036](3)以2mL/min的滴加速度将溶液B加入到溶液A中，用2mol/LNa0H溶液调节其pH值至10，搅拌0.5h后将悬浮液倒入聚四氟乙烯为衬底的反应釜中，在140°C反应8h。
[0037](4)将所得沉淀过滤，用蒸馏水和无水乙醇各洗涤2次，制得羟基磷灰石磁性核(Fe3VCo2+-HAP)。
[0038]B =Fe3VCo2+-HAP表面包覆薄层羟基磷灰石
[0039](5)将 0.2g Fe3VCo2+-HAP 磁性核和 1.2mmol (NH4) 2ΗΡ04 超声分散到 50mL 无水乙醇-水溶液中(蒸馏水和无水乙醇体积比为1:1)，获得悬浮液C。
[0040](6)按反应溶液中Ca2+与P043_摩尔比为1.67，取2mmol Ca(NO3)2.4H20加入到50mL无水乙醇-水溶液中，磁力搅拌，使溶液混合均匀，获得溶液D。
[0041 ] (7)以2mL/min的滴加速度将溶液D滴加到悬浮液C中，再用2mol/L NaOH溶液调节其PH值至10，在40°C下中速搅拌反应2h。
[0042](8)将所得沉淀离心分离，用蒸馏水和无水乙醇各洗涤2次后在80°C下干燥24h，然后在30(TC条件下煅烧2h，获得表面包覆薄层羟基磷灰石的磁性羟基磷灰石(Fe3+/Co2+-HAPiHAP)纳米颗粒。
[0043]C =Fe3VCo2+-HAPiHAP表面包覆发光羟基磷灰石
[0044](9)将 0.1g Fe3VCo2+-HAPiHAP 粉体、12mmol (NH4) 2ΗΡ04 和 0.5g 三聚磷酸钠超声分散到50mL无水乙醇-水溶液，获得悬浮液E。
[0045](10)按 Tb3+ 占(Ca2++Tb3+)的摩尔分数为 5%，取 ImL0.lmol/L 的 Tb (NO3) 3 溶液和 1.9mmolCa(NO3)2.4Η20加入到49mL无水乙醇-水溶液中，磁力搅拌，使溶液混合均匀，获得溶液F。(11)以2mL/min的滴加速度将溶液F滴加到悬浮液E中，控制反应溶液中Ca2+和Tb3+总摩尔数与PO/—摩尔数之比为1.67，再用2mol/L NaOH溶液调节其pH值至10，在40°C下中速搅拌反应2h。[0046](12)将所得沉淀离心分离，用蒸馏水和无水乙醇各洗涤2次，在80°C下干燥24h，获得核壳结构磁、发光羟基磷灰石(Fe37Co2+-HAP@HAP@Tb3+-HAP)。
[0047]从图1可以看出，实例I合成产物的衍射峰与羟基磷灰石标准卡片(JCPDS09-0432)相一致。图2TEM照片可以看出合成的磁、发光羟基磷灰石颗粒具有核壳结构，粒径为20~60nm。图3和图4可以看出核壳结构羟基磷灰石激发波长为447nm时,在544nm处呈现绿色荧光，且具有超顺磁性。
[0048]实施例2:
[0049]A =Fe3+和Co2+掺杂的羟基磷灰石磁性核(Fe3+/C02+-HAP)的水热法制备
[0050](1)取0.420g十六烷基溴化铵(CTAB)和12mmol磷酸氢二铵((NH4)2HPO4)溶于24mL蒸馏水中，磁力搅拌至混合均匀，得溶液A。
[0051](2)取4mLlmol/L硝酸铁和硝酸钴的混合液(Fe3+:Co2+=2:1)和16mmolCa (NO3) 2.4H20置于36mL蒸馏水中，磁力搅拌至混合均匀，得溶液B。
[0052](3)以2mL/min的滴加速度将溶液B加入到溶液A中，用2mol/L NaOH溶液调节其pH值至10，搅拌0.5h后将悬浮液倒入聚四氟乙烯为衬底的反应釜中，在140°C反应8h。
[0053](4)将所得沉淀过滤，用蒸馏水和无水乙醇各洗涤2次，得羟基磷灰石磁性核(Fe3VCo2+-HAP)。
[0054]B =Fe3VCo2+-HAP表面包覆薄层羟基磷灰石
[0055](5)将 0.1g Fe3+/Co2+-HAP 磁性核和 0.6mmol (NH4)2HPO4 超声分散到 50mL 无水乙醇-水溶液中(蒸馏水和无水乙醇体积比为1:1)，获得悬浮液C。
[0056](6)按反应溶液中Ca2+与PO:摩尔比为1.67，取lmmol Ca(NO3)2.4H20加入到50mL无水乙醇-水溶液中，磁力搅拌，使溶液混合均匀，获得溶液D。
[0057](7)以2mL/min的滴加速度将溶液D滴加到悬浮液C中，再用2mol/L NaOH溶液调节其PH值至9.5，在20°C下中速搅拌反应2h。
[0058](8)将所得沉淀离心分离，用蒸馏水和无水乙醇各洗涤2次后在80°C下干燥24h，然后在30(TC条件下煅烧2h，获得表面包覆薄层羟基磷灰石的磁性羟基磷灰石(Fe3+/Co2+-HAPiHAP)纳米颗粒。
[0059]C =Fe3VCo2+-HAPiHAP表面包覆发光羟基磷灰石
[0060](9)将 0.1g Fe3VCo2+-HAPiHAP 粉体、12mmol (NH4) 2ΗΡ04 和 0.5g 三聚磷酸钠超声分散到50mL无水乙醇-水溶液，获得悬浮液E。
[0061](10)按 Tb3+ 占(Ca2++Tb3+)的摩尔分数为 5%，取 ImL0.lmol/L 的 Tb (NO3) 3 溶液和1.9mmolCa(N03)2.4H20加入到49mL无水乙醇-水溶液中，磁力搅拌，使溶液混合均匀，获得溶液F。(11)以2mL/min的滴加速度将溶液F滴加到悬浮液E中，控制反应溶液中Ca2+和Tb3+总摩尔数与PO/—摩尔数之比为1.67，再用2mol/L NaOH溶液调节其pH值至9.5，在20°C下中速搅拌反应2h。
[0062](12)将所得沉淀离心分离，用蒸馏水和无水乙醇各洗涤2次，在80°C下干燥24h，获得核壳结构磁、发光羟基磷灰石(Fe37Co2+-HAP@HAP@Tb3+-HAP)。
[0063]图5和图6可以看出实施例2条件下制备出了具有核壳结构的磁、发光羟基磷灰石颗粒，激发波长为447nm时，在544nm处呈现绿色荧光。
[0064]实施例3:[0065]参照实施例1的制备步骤，不同的是步骤(10)中Tb3+占(Ca2++Tb3+)的摩尔分数为8%。由图7可见，与实施例1相比，实`施例3增大Tb3+掺量544nm荧光强度明显增强。
【权利要求】
1.一种磁、发光双功能纳米核壳结构羟基磷灰石颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤:A:磁性羟基磷灰石(Mn+-HAP)的水热法制备 (1)取一定量的高分子模板剂和磷酸盐置于蒸馏水中，磁力搅拌至混合均匀，得溶液A0 (2)按磁性金属离子^7化&2++1^的摩尔比=0.05~0.4，取一定量的磁性金属盐和钙盐置于蒸馏水中，磁力搅拌至混合均匀，得溶液B。 (3)将溶液B缓慢滴加到溶液A中，控制反应溶液中Ca2+和Mn+总摩尔数与PO/—摩尔数之比为1.67，应溶液中(Ca2++Mn+)的浓度为0.2~2.0mol/L，用碱溶液调节其pH值至10~11，搅拌0.5~2h后将悬浮液倒入反应釜中，在120°C~180°C反应3~20h。 (4)将所得沉淀离心分离，用蒸馏水和无水乙醇各洗涤数次，得羟基磷灰石磁性核(M11+-HAP)。 B:Mn+-HAP表面包覆薄层羟基磷灰石 (5)取一定量Mn+-HAP磁性核和磷酸盐超声分散到有机醇-水溶液中，获得悬浮液C。 (6)按反应溶液中Ca2+与P043_摩尔比为1.67，称取一定量的钙盐加入到有机醇-水溶液中，磁力搅拌，使溶液混合均匀，获得溶液D。 (7)将溶液D缓慢滴加到悬浮液C中，再用碱溶液调节其pH值至9~10，控制反应溶液中Ca2+的浓度 为0.01~0.lmol/L，在20~75°C下中速搅拌反应2h。 (8)将所得沉淀离心分离，用蒸馏水和无水乙醇各洗涤数次后在80°C下干燥16~24h，然后在200~50(TC条件下煅烧I~3h，获得表面包覆薄层羟基磷灰石的磁性羟基磷灰石(Mn+-HAP (iHAP)纳米颗粒。 C:Mn+-HAPiHAP表面包覆发光羟基磷灰石 (9)取适量Μη+-ΗΑΡ@ΗΑΡ粉体、磷酸盐和分散剂超声分散到有机醇-水溶液中，获得悬浮液Ε。 (10)按稀土离子Ln3+/(Ca2++Ln3+)的摩尔比=2~11%，取一定量稀土盐溶液和钙盐加入有机醇-水溶液中，磁力搅拌，使溶液混合均匀，获得溶液F。 (11)将溶液F缓慢滴加到悬浮液E中，控制反应溶液中Ca2+和Ln3+总摩尔数与P043_摩尔数之比为1.67，再用碱溶液调节其pH值至9~10，在20~75°C下中速搅拌反应2h。 (12)将所得沉淀离心分离，用蒸馏水和无水乙醇各洗涤数次，在80°C下真空干燥16~24h，获得核壳结构磁、发光羟基磷灰石(Mn+-HAP@HAP@Ln3+-HAP)。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的高分子模板剂为十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯醇、聚乙二醇。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的磁性金属M为Fe，Co和Mn，磁性金属盐为金属硝酸盐和金属氯化物。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤⑴(5)(9)中所述的磷酸盐为磷酸氢二铵、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤⑵(6)(10)中所述钙盐为硝酸钙、氯化钙和氢氧化钙。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(10)中所述稀土离子Ln3+为Tb3+，Eu3+，Yb3+，Er3+，Pr3+。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(5)(6) (9) (10)中所述有机醇为甲醇、乙醇，乙二醇,丙醇,丁醇。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)(7) (11)中所述碱溶液为氢氧化钠、 氨水、氢氧化钾。
【文档编号】C09K11/02GK103820102SQ201410027105
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月18日 优先权日:2014年1月18日
【发明者】刘志刚, 王俏, 杨立荣, 姚少威, 于守武, 白瑞英, 封孝信 申请人:河北联合大学