制备甘露糖偶联近红外量子点的方法与流程

本发明涉及细胞示踪技术领域，尤其涉及一种制备甘露糖偶联近红外量子点的方法。

背景技术：

免疫细胞示踪标记在生物医学研究中非常有意义，甘露糖受体蛋白广泛表达于多种免疫细胞，甘露糖偶联的量子点是一种非常好的免疫细胞荧光标记材料。

作为一种用于生物荧光标记的纳米粒子，量子点的光学稳定性大大优于有机荧光染料或荧光蛋白，在连续光激发下可以保持稳定的发光亮度和高量子效率。量子点具有宽的吸收光谱及窄的荧光发射光谱，可以通过改变其尺寸或组成调节其发光光谱。单波长可以同时激发具有不同发光谱带的量子点，使得多路复用技术(multiplexing)成为可能。其生物稳定性、生物相容性及其与生物体系的相互作用可以通过改变表面性质来调节。这些特点使得量子点纳米粒子在生物荧光标记的应用上具有有机荧光分子或荧光蛋白无法实现的优点。有望在将来成为新一代的生物荧光标记材料并用于包括细胞标记及示踪、蛋白质印迹(westernblot)、流式细胞计、酶联免疫吸附、基因芯片、分子成像等生物应用。

目前全世界在制备量子点的方式上常见的有：

1.通过有机金属合成。但含镉的量子点具有较大的毒性，且使用该种方式合成得到的量子点具有疏水性，需要与水溶性分子的相互作用转化为亲水的纳米粒子才能用于生物应用。

2.糖修饰的量子点。其通常采用的方法是，功能化的糖分子通过螯合作用包覆于量子点表面，或生物素(biotin)偶联的糖分子与链霉亲和素(streptavdin)偶联的量子点结合，或通过疏水相互作用的功能化。但这些方法得到的产物或者稳定性差，或者步骤复杂，重复性差，不宜工业化。

因此，针对以上缺陷，需要对现有技术进行改进。

技术实现要素：

针对以上缺陷，本发明提供一种制备甘露糖偶联近红外量子点的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一步，制备酰亚胺功能化甘露糖。

首先，将2-溴代甘露糖乙酯及硫脲溶于无水丙酮，氩气保护下加热至丙酮回流，反应20分钟；冷却反应物至室温得到白色结晶；过滤反应液收集晶体，得到产物2-硫代异脲基甘露糖乙酯溴化氢。

其次，将2-硫代异脲基甘露糖乙酯溴化氢，氯乙氰溶于丙酮和水的混合溶液；在反应液中加入碳酸钾及亚硫酸钠，室温下反应30分钟后加入冰水，搅拌2小时；收集沉淀水洗；粗产物硅胶柱层析分离提纯，得到产物2-硫代乙氰基甘露糖乙酯。

最后，将2-硫代乙氰基甘露糖乙酯溶于无水甲醇，向反应液中加入甲醇钠溶液，氩气保护下室温反应20小时，得到酰亚胺功能化甘露糖。

第二步，制备胺基功能化近红外量子点。

首先，制备疏水的氨基近红外铜铟硒/硫化锌量子点：

将氯化亚铜、氯化铟、硒脲、十八烯及三辛基膦的混合物超声30分钟，加入油胺及十二烷基硫醇，反应液经过无水无氧操作后加热至50-60摄氏度，搅拌10小时后得到无色透明的反应液；

将反应液冷却至室温后加热至200摄氏度，可见反应溶液的颜色从无色逐渐变为黄色，红色最终为黑褐色，反应温度至200度后立即终止反应并降温；

向反应混合物中加入甲醇/丙酮混合溶剂，沉降的纳米粒子经过高速离心分离后溶于无水氯仿中，用0.22微米的尼龙滤头过滤；

铜铟硒量子点的氯仿溶液与十八烯、油胺置于反应瓶中，真空条件下除去氯仿，得到疏水的氨基近红外铜铟硒/硫化锌量子点。

其次，制备二乙基黄原酸锌反应液：

将二乙基黄原酸锌与油酸锌溶于十八烯、三辛基膦及二辛基胺的混合溶液得到锌溶液并分成两部分，先将一部分的锌溶液加入铜铟硒量子点溶液中加热至190度，反应后再将另一部分剩余的锌溶液加入反应溶液中继续反应；

将反应混合物冷却至室温，加入丙酮/甲醇（1/3体积比）沉降纳米粒子。离心分离后的纳米粒子溶于氯仿中并过滤，得到的溶液用于配体交换。

再次，合成多齿胺基聚合物配体：

使聚丙烯酸与cdi在有机溶剂存在下反应，加入boc保护的氨基peg，再加入n,n-二甲基乙二胺和硫辛胺的氯仿溶液进一步反应，得到的产物用饱和氯化钠水溶液洗三次后收集有机相，分离提纯得到聚合物配体前体物，使所得聚合物配体前体物与1，3-丙环酰内酯反应，和分离提纯得到多齿胺基聚合物配体。

最后，将疏水的氨基近红外铜铟硒/硫化锌量子点溶于氯仿溶液中，与多齿胺基聚合物配体的水溶液混合，混合物在45度剧烈搅拌半小时后冷却静置，在有机相中加入乙酸乙酯/正己烷混合溶剂沉淀量子点，干燥有机溶剂后加入1毫升去离子水溶解纳米粒子过滤，通过分子量选择滤膜离心分离提纯，除去未反应的配体及其他杂质，得到亲水的胺基功能化近红外量子点。

第三步，酰亚胺功能化甘露糖与胺基功能化近红外量子点的偶联。

将胺基功能化近红外量子点的硼酸缓冲溶液中加入酰亚胺功能化甘露糖的水溶液，混合均匀后室温反应20小时，反应液经过离心透析分离提纯后4度保存。

本发明所述的一种制备甘露糖偶联近红外量子点的方法的有益效果为：

1.能够将量子点转化为水溶、稳定、低特异性的纳米粒子，同时引入反应官能团利于进一步的生物修饰，合成的铜-铟-硒近红外量子点具有毒性小、发光亮度好、尺寸小、发光光谱可调等优点，非常适于生物荧光标记的应用；

2.通过胺基修饰的量子点与酰亚胺功能化的甘露糖之间的反应合成甘露糖功能化的荧光量子点，具有可控性好、产品稳定性高、合成路线相对简易的特点；

3.该技术也可同样适用于其他糖分子与纳米粒子的偶联。

下述实施例更详尽地说明了本发明。除非另有说明，本说明书及专利申请范围中所记载的分数或百分数均按重量计。

附图说明

下面根据附图对本发明作进一步详细说明：

图1为量子点的透射电子显微镜分析结果；

图2为紫外吸收和荧光发射光谱；

图3为甘露醇偶联量子点荧光标记免疫细胞的共聚焦荧光显微镜图片；

图4为酰亚胺功能化甘露糖与胺基功能化近红外量子点的偶联反应示意图；

图5是甘露醇偶联近红外量子点荧光标记免疫细胞(raw254细胞)示意图。

具体实施方式

第一步，制备酰亚胺功能化甘露糖。

首先，将2-溴代甘露糖乙酯（2克，4.8毫摩尔）及硫脲（0.37克，4.8毫摩尔）溶于无水丙酮（5毫升），氩气保护下加热至丙酮回流，反应20分钟；冷却反应物至室温得到白色结晶；过滤反应液收集晶体，得到产物2-硫代异脲基甘露糖乙酯溴化氢（1.332克，反应收率：56%）。

其次，将2-硫代异脲基甘露糖乙酯溴化氢（1克，2毫摩尔），氯乙氰（1毫升，8毫摩尔）溶于丙酮（2.5毫升）和水（2.5毫升）的混合溶液；在反应液中加入碳酸钾（0.3克，2.2毫摩尔）及亚硫酸钠（0.425克，4毫克），室温下反应30分钟后加入冰水（2毫升），搅拌2小时；收集沉淀水洗；粗产物硅胶柱层析分离提纯，得到产物2-硫代乙氰基甘露糖乙酯（0.78克，反应收率：94%）。

观察核磁共振氢谱：

(300mhz,cdcl3,ppm):δ5.46-5.45(d,1h),5.27-5.20(t,1h),5.11-5.06(d,1h),4.71-4.68(d,1h),4.20-4.08(m,2h),4.03-3.98(t,1h),3.66-3.60(d,1h),3.37-3.31(d,1h),2.16(s,3h),2.08(s,3h),2.05(s,3h),1.98(s,3h)。

最后，将2-硫代乙氰基甘露糖乙酯（0.3克，0.74毫摩尔）溶于无水甲醇（8毫升），向反应液中加入0.1m的甲醇钠溶液（1毫升），氩气保护下室温反应20小时，得到酰亚胺功能化甘露糖，酰亚胺功能化甘露糖溶于水直接用于偶联反应。

第二步，制备胺基功能化近红外量子点。

首先，制备疏水的氨基近红外铜铟硒/硫化锌量子点：

将氯化亚铜（10毫克），氯化铟（22毫克）以及25毫克的硒脲置于25毫升的三颈反应瓶中，加入2.5毫升十八烯，1毫升三辛基膦；

混合物超声30分钟后加入1毫升油胺及0.5毫升十二烷基硫醇，反应液经过无水无氧操作后加热至50-60摄氏度，搅拌10小时后得到无色透明的反应液；

将反应液冷却至室温后加热至200摄氏度，可见反应溶液的颜色从无色逐渐变为黄色，红色最终为黑褐色，反应温度至200度后立即终止反应并降温；

向反应混合物中加入甲醇/丙酮混合溶剂，沉降的纳米粒子经过高速离心分离（10，000rpm）后溶于无水氯仿中，用0.22微米的尼龙滤头过滤；

铜铟硒量子点的氯仿溶液（5毫升）与2毫升十八烯，0.5毫升油胺置于反应瓶中，真空条件下除去氯仿，得到疏水的氨基近红外铜铟硒/硫化锌量子点。

其次，制备二乙基黄原酸锌反应液：

将30毫克二乙基黄原酸锌与250毫克油酸锌溶于1毫升十八烯、1.5毫升三辛基膦及0.5毫升二辛基胺的混合溶液得到锌溶液并分成两部分；先将一部分的锌溶液0.5毫升加入铜铟硒量子点溶液中并加热至190摄氏度，反应后再将另一部分剩余的锌溶液缓慢滴加至反应溶液中继续反应；

将反应混合物冷却至室温，加入丙酮/甲醇(1/3体积比)沉降纳米粒子，离心分离后的纳米粒子溶于10毫升氯仿中，用0.2微米的滤头过滤，得到的溶液用于配体交换。

再次，合成多齿胺基聚合物配体：

将聚丙烯酸溶于无水四氢呋喃中，向该溶液加入cdi，室温下反应过夜；

在0-4度搅拌下向该溶液加入n,n-二甲基乙二胺及硫辛胺的氯仿溶液，反应12小时；

得到的产物用饱和氯化钠水溶液洗三次后收集有机相，干燥过滤后蒸干有机溶剂，得到的聚合物溶于四氢呋喃中经体积排除色谱分离，除去小分子量杂质；

提纯后的聚合物配体前体物溶于无水氯仿中与1，3-丙环酰内酯在65度反应过夜，得到黄色聚合物沉淀；

过滤反应液收集产物以氯仿洗去未反应物；

产物干燥后溶于水及乙醇的混合溶液，加入硼氢化钠反应还原硫辛酸基团，得到最终的聚合物配体，蒸去溶剂后溶于去离子水中得到无色透明溶液；

此时，合成的聚合物配体并不带有氨基，若需合成带氨基的多齿聚合物配体，区别是在将聚丙烯酸与cdi在有机溶剂（无水四氢呋喃）反应的过程中，加入boc保护的氨基peg（摩尔比例10-25%），最终反应结束后聚合物配体的水/乙醇溶液中加入1摩尔/升的盐酸溶液室温下反应两小时去保护，然后加入氢氧化钠的溶液将反应液中和至中性。

最后，将氨基近红外铜铟硒/硫化锌量子点（6纳摩）溶于氯仿（3毫升）的溶液中，与多齿胺基聚合物配体（50毫克）的水溶液（1毫升）混合，混合物在45度剧烈搅拌半小时后冷却静置，在有机相中加入乙酸乙酯/正己烷混合溶剂沉淀量子点，干燥有机溶剂后加入1毫升去离子水溶解纳米粒子，过滤（0.2微米滤头），通过分子量选择滤膜离心分离提纯，除去未反应的配体及其他杂质，得到亲水的胺基功能化近红外量子点，4度条件下保存。

第三步，酰亚胺功能化甘露糖与胺基功能化近红外量子点的偶联。

将浓度为0.06微摩尔/毫升的胺基功能化近红外量子点(6纳摩)的硼酸缓冲溶液(200微升，ph8.6)中加入浓度为6微摩尔/毫升的酰亚胺功能化甘露糖的水溶液(274微克，0.6微摩尔，200微升)，二者重量比为1：1，混合均匀后室温反应20小时，反应液经过离心(6000转/分)透析的方法(mwcofilter,amicon,30kda)分离提纯后4度保存。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能够理解和应用本案技术，熟悉本领域技术的人员显然可轻易对这些实例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其它实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本案不限于以上实施例，本领域的技术人员根据本案的揭示，对于本案做出的改进和修改都应该在本案的保护范围内。