专利名称:一种功能性碳点及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及功能性纳米荧光材料，具体地说是一种荧光碳点及其制备和应用。
背景技术：
纳米荧光材料因其独特的物理化学性质，如发光强度高、荧光性能稳定等特点，近年来受到了越来越多的关注。其应用焦点目前主要集中在生物技术领域：
，如生物大分子的单分子原位检测、荧光显微镜检测、免疫组织化学、细胞化学、以及生物成像等。在以上生物技术应用中，以纳米级粒子为中心的荧光标记技术成为实现上述功能的一种重要的技术手段。目前纳米荧光材料主要有I)半导体荧光量子点:如ZnS-CdSe (文献1:Warren C.ff.Chanand Nie Shuming, Science, 1998, 281, 2016),量子点的发明，开创了纳米突光微粒作为标记物应用的新领域，其发射峰的位置表现出明显的纳米尺寸效应，即发射峰随着粒子的增大而红移。然而，半导体荧光量子点含有毒性较大的金属元素、发光不稳定、易闪烁，其细胞和体内应用的毒副作用已经受到重视。2)聚苯乙烯纳米荧光材料(文献2:Harri
Tero Soukka, Timo Lovgren, Clin.Chem.,2001,47,561) 此类纳米荧光材料采用有机高分子为基质材料，在有机溶剂中高分子材料易溶胀而导致微粒内荧光分子泄漏。3)无机二氧化娃突光纳米材料(文献 3:Santra Swadeshmukul, Zhang Peng, Wang Kemin, TapecRovelyn, and Tan Weihong, Anal.Chem., 2001, 73,4988 ;文献 4:谭蔚视，王柯敏，肖丹，核壳型纳米颗粒，中国专利，
公开日2002年4月3日，公开号CN1342515A)。这一类荧光纳米材料以二氧化硅为外壳制备了大小均匀的纳米荧光微粒。其优势是荧光染料的光稳定性显著提高，易于生物分子标记，但是其在水溶液中易凝聚，荧光的发射光谱受所包裹的荧光染料种类限制。4)碳点(文献 5:Sun Ya-Ping, Zhou Bing, Lin Yi, et al J.Am.Chem.Soc,2006，128,7756)，2006年Sun研究组报道了表面修饰的碳纳米微粒具有光致发光的特点，这一结果激起人们对荧光碳纳米材料的研究兴趣，近来越来越多的研究者报道了碳点的制备方法及其应用。碳纳米微粒的荧光具有非常特殊的性质，在一定的激发范围内，其发射光谱可以随着激发光谱的红移而 红移，而且还发现其具有上转换荧光的特性。由于碳是生物本身固有的元素之一，碳点具有优越生物相容性、低毒性等特点，与有机染料相比，碳点具有较高光稳定性和抗光漂白性，可经受多次激发而不发生荧光淬灭、且水溶性好，在生物分子标记和活体成像等领域具有独特的优势。
目前已经报道的碳点制备技术及其存在的问题主要包括如下几个方面:(a)金刚石突光碳纳米材料(文献 6:Chang Y R, Lee H Y, Chen K, et al, Nat.，Nanotech.,2008,3，284-288)。米用高能量He+离子束辐照纳米金刚石微粒，使其表面产生空缺，从而产生发光中心。其缺点是制备设备昂贵、复杂，且在30nm以下金刚石中发生辐照掺杂，获得较高发光效率的难度很大。因为随着粒径的减小，氮原子含量降低，导致可能的发光中心的出现的概率降低，荧光性能减弱。(b)石墨结构的碳荧光纳米材料(文献7:Sun Ya-Ping, ZhouBing, Lin Yi, et.al.J.A m.Chem.Soc，2006，128，7756)，此类纳米荧光材料通常采用激光法和电化学法制备，其有上转换荧光发射的特性，荧光量子效率为1% _10%。缺点是:激光法高温高压制备纳米颗粒设备昂贵、条件难以控制，而且电化学法制备方法中采用的电解液性质对是否产生荧光有很大影响，所制得的碳荧光纳米材料荧光量子效较低。(C)非晶结构碳荧光纳米材料(文献 8:Liu H, Ye T，Mao C，Angew.Chem.1nt.EcL 2007，46，6473)，此类材料采用硝酸回流蜡烛灰制备，可以发出多色可见光。该方法获得的碳纳米材料通过原子力显微镜分析表明尺寸不到2nm，X射线衍射(XRD)测试表明纳米颗粒不具有晶体特征。缺点是:蜡烛不完全燃烧产生的烟灰难以大量富集，而且制得的产物荧光量子效率低。此外，最近Qiao等报道了以商业活性炭(煤质、木质、椰壳活性炭)为碳源合成的一类非晶碳荧光纳米材料，获得了粒径约为4.5nm水溶性好的碳纳米颗粒(文献9:Qiao Zhen-An, WangYifan, Gao Yang, et al.Chem.Commun.2010,46,8812),能发出多色可见光，具有良好的生物相容性。
碳点被认为是最为理想的荧光标记材料之一，而且其在纳米光催化、发光器件、生物传感器等也展现了巨大的潜在应用价值。已有的碳点制备技术仍然存在着不足，例如制备工艺复杂、设备昂贵、原料来源少、条件难以控制等等，小尺寸的非晶结构碳荧光纳米材料其效能还有待提高，发展碳荧光纳米材料新的制备技术具有重要的意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种原料来源广泛，价格低廉，制备条件简单的方法制备碳纳米荧光材料。并采用多种功能材料进行表面修饰，提高荧光量子效率、用于细胞成像。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下:
碳点的发光原理系因表面修饰、而造成的能级势阱产生了可见光发射，发光的强度和发光的效率取决于粒径的大小和表面修饰的功能材料。
其制备方法为:采用含碳化合物草木灰，置于1.5 5mol/L硝酸中，于110 140°C加热回流4 24小时进行化学氧化，一步法制备碳点，并在所制备的碳荧光微粒表面导入活性官能团的表面修饰技术。
微粒表面导入活性官能团的表面修饰技术方式为:
a.在制得的碳点表面修饰具有可供化学结合的-NH2 或-COOH活性基团，用于生物大分子或细胞标记
b.经过修饰后，提高碳点荧光量子效率
本发明的另一目的是功能性碳荧光微粒在应用于物理、化学以及生命科学领域应用；本发明的碳点具有与生物分子等结合的功能，未来有希望可以广泛地应用于荧光生物检测技术，如荧光显微镜成像、蛋白质的荧光标记，细胞内外物质的检测，免疫组织化学、核酸分子杂交中的应用等。
本发明具有如下优点:
(I)碳点及其修饰产物原料来源广泛，价格低廉，容易获得且制备方法简单。
(2)碳点及其修饰产物水溶性好，在水中不凝聚、不结块，有利于在生物分子标记应用。
(3)碳点及其修饰产物荧光稳定性高，本身是一种光比较稳定的物质，需要强光测定的场合，如荧光显微镜测定时，不会发生荧光漂白现象(发射光强度随光照时间增加而衰减的现象)，可很好的满足测定的需要。
(4)避免标记物大量使用时的“浓度消光”现象。许多荧光化合物当浓度较高时，就会发生浓度消光的问题。碳点的不存在浓度消光的问题(荧光素等有机荧光化合物在微摩尔浓度水平即发生浓度消光)。
(5)碳点经不同材料进行表面修饰后，修饰产物可以直接用于生物分子的标记。本发明以碳点为发光内核，经过表面化学修饰后，可以引入用于标记的官能团，成功地解决了对碳点用于生物标记的难题。
(6)本发明建立以碳点的修饰产物为标记物的荧光生物检测技术。碳点表面修饰产物的生物相容性好，毒性低(无毒性)作为标记物使用才刚刚起步，随着研究的不断深入，碳点必将在生物检测，如荧光显微镜成像、蛋白质的荧光标记，细胞内外物质的检测，免疫组织化学、核酸分子杂交等领域将会有巨大的应用价值。
图1是碳点的透射电子显微镜照片；
图2是碳点的紫外吸收光谱和荧光光谱；
图3是碳点的光稳定性实验；
图4pH值对碳点荧光强度的影响；
图5碳点及其修饰产物的红外光谱。a为壳聚糖修饰的碳点；b为α -多聚赖氨酸修饰的碳点；c为4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺(PEG-NH2)修饰的碳点；d为半胱氨酸修饰的碳点；e为碳点的红外光谱；
图6是壳聚糖修饰的碳点的紫外吸收光谱和荧光光谱；
图7是α -多聚赖氨酸修饰的碳点紫外吸收光谱和荧光光谱；
图8是4，7，10-三氧_1，13-十三烷二胺(PEG-NH2)修饰的碳点紫外吸收光谱和突光光谱；
图9是半胱氨酸修饰的碳点紫外吸收光谱和荧光光谱；
图10是碳点用于细胞成像图。A:中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)细胞明场照片；B:碳点标记细胞荧光成像照片(激发光源450 490nm) ；C:明场和荧光成像叠加照片。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
碳点的制备:
草木灰0.5g，加入含IOOmlL 5M硝酸的圆底烧瓶中，超声分散，在110°C下磁力搅拌回流20小时。反应完毕后，过滤得滤液，用Na2CO3将滤液中和至中性。用透析袋(Mw1000)在去离子水中透析24小时，期间3次换透析袋外的水除杂质。所得透析袋内的溶液过0.22 μ m滤膜，得碳点溶液于4°C冰箱保存
碳点的性质表征:
(I)碳点形态及大小尺寸
图1是碳点的透射电子显微镜照片，结果表明经过上述方法制备的碳点粒径大约在3 5纳米，碳纳米微粒分散良好，没有团聚 现象发生。[0037](2)碳点的荧光光谱特性
图2是碳点的紫外吸收光谱和荧光光谱，图中碳点在200 500纳米有吸收，其发射光谱随着激发波长的增长，发射峰的位置向长波方向移动且强度减弱，发射波长的变化范围从430nm到550nm。不同激发波长下的碳点的荧光量子产率见表I。
(3)碳点的光稳定性实验
碳点、罗丹明B及荧光素在水溶液中的光稳定性实验结果如图3所示，所用光源为60瓦白炽灯，样品距离白炽灯15cm，分别于碳点最大激发波长320nm、罗丹明B最大激发波长552nm、荧光素最大激发波长322nm测其发射荧光强度变化。经过白炽灯60分钟照射后，罗丹明B的荧光强度衰减到起始时的18%，荧光素的荧光强度衰减到起始时的11%，而碳点的荧光强度仅衰减到起始时的94%，说明碳点的光稳定性远远优于传统荧光染料罗丹明B及荧光素。
(4) pH值对碳点荧光强度的影响
用Na2CO3水溶液调节碳点至不同pH值，在320nm激发下，荧光强度随pH值的变化如图4所示。碳点发射荧光强度随pH值增加先减小，然后逐渐增强，在pH值为6-8范围内，碳点有良好的荧光强度。
(5)碳点傅立叶变换红外光谱(FTIR)表征
图5中e为碳点的红外光谱，3434cm-1左右由0_H的伸缩振动吸收峰和N-H的伸缩振动吸收峰重叠而成的一个宽峰，碳点也有乙酰氨基NH-C = O的伸缩振动吸收峰和-NO2不对称伸缩振动重叠峰于1654cm 1O 1398cm 1为-NO2对称伸缩振动
实施例2
壳聚糖修饰碳点
(I)壳聚糖修饰碳点方法
将上述实施例1制备好的碳点溶液倒入圆底烧瓶中，用Na2CO3将溶液中和至pH
4.2，过滤除去杂质，得滤液。加入Ig壳聚糖，超声分散，于110°C下磁力搅拌回流72小时。反应完毕后，过滤得溶液，用透析袋(MwIOOO)透析I天，期间换水3次除杂质。所得透析袋内的溶液过0.22 μ m滤器，得壳聚糖-碳点溶液于4°C冰箱保存。
(2)壳聚糖修饰碳点的性质表征
图6是壳聚糖修饰后碳点的紫外吸收光谱和荧光光谱，修饰后的碳点在200 500纳米范围内有吸收，其发射光谱随着激发波长的增长，发射峰的位置向长波方向移动且强度减弱，发射波长的变化范围从430nm到550nm。不同激发波长下的碳点的荧光量子产率见表I，在320nm，350nm, 380nm和400nm激发波长下，荧光量子收率分别为2.20 %，2.98 %，
2.65%和2.39%，相对于裸露的碳点，荧光量子收率分别提高2.76，3.68，3.68和4.98倍。
(3)壳聚糖修饰碳点FTIR表征
图5中a为壳聚糖修饰后的碳点的红外光谱，3439CHT1左右由和N-H的伸缩振动吸收峰重叠而成的一个宽峰。壳聚糖分子中有一定含量的乙酰氨基，所以有酰胺NH-C = O特征吸收峰于1654011'
实施例3
α -多聚赖氨酸修饰碳点
(I) α -多聚赖氨酸修饰碳点方法[0056]将上述实施例1制备好的碳点溶液倒入圆底烧瓶中，加入Ig α -多聚赖氨酸(Mw约10000)，超声分散，于110°c下磁力搅拌回流72小时。反应完毕后，过滤后得滤液，用透析带(MwIOOO)透析I天，期间换水3次除杂质。所得透析袋内的溶液过0.22 μ m滤器，得α -多聚赖氨酸修饰碳点，于4°C冰箱保存。
(2) α -多聚赖氨酸修饰碳点的性质表征
图7是α-多聚赖氨酸修饰碳点的紫外吸收光谱和荧光光谱。修饰后碳点的吸收和荧光发射光谱没有发生明显改变，修饰后的碳点在200 500纳米范围内有吸收，其发射光谱随着激发波长的增长，发射峰的位置向长波方向移动且强度减弱，发射波长的变化范围从430nm到550nm。不同激发波长下的碳点的荧光量子产率见表1，在320hm，350nm, 380nm和400nm激发波长下，荧光量子收率分别为1.83 %，2.26%，4.28 %和1.83 %，相对于裸露的碳点，荧光量子收率分别提高2.29，2.79，5.94和3.81倍。
(3) α -多聚赖氨酸修饰碳点的FTIR表征
图5中b为α -多聚赖氨酸修饰的碳点的红外光谱，3635CHT1和3181(^1的伯酰胺基N-H伸缩振动吸收峰，其强度可能高于O-H的伸缩振动吸收峰，故O-H没有明显的吸收峰。PLL修饰的碳点也有乙酰氨基NH-C = O特征吸收峰于1654CHT1。
实施例4
4,7,10-三氧-1，13-十三烷二胺(PEG-NH2)修饰碳点
(I)PEG-NH2修饰碳点方法
将上述实施例1制备好的碳点溶液倒入圆底烧瓶中，加入Iml短链PEG-NH2,超声分散，于110°c下磁力搅拌回流72小时。反应完毕后，过滤后得滤液，用透析袋(MwIOOO)透析I天，期间换水3次除杂质。所得透析袋内的溶液过0.22 μ m滤器，得PEG-NH2修饰的碳点，在4°C冰箱保存。
(2) PEG-NH2修饰碳点的性质表征
图8是PEG-NH2修饰碳点的紫外吸收光谱和荧光光谱。修饰后碳点的吸收和荧光发射光谱没有发生明显改变，修饰后的碳点在200 500纳米范围内有吸收，其发射光谱随着激发波长的增长，发射峰的位置向长波方向移动且强度减弱，发射波长的变化范围从430nm到550nm。不同激发波长下的碳点的荧光量子产率见表1，在320nm，350nm，380nm和400nm激发波长下，荧光量子收率分别为1.12%, 1.10%, 1.10%和1.70%，相对于裸露的碳点，荧光量子收率分别提高1.40，1.36，1.53和3.54倍。
(3) PEG-NH2修饰碳点的FTIR表征
图5中c为PEG-NH2修饰的碳点红外光谱，3583cm^和3401cm—1的伯酰胺基N-H伸缩振动吸收峰，强度可能高于O-H的伸缩振动吸收峰，故O-H没有明显的吸收峰。PEG-NH2修饰的碳点也有乙酰氨基NH-C = O的伸缩振动吸收峰和-NO2不对称伸缩振动重叠峰于1654cm 1J 1413cm 1为-NO2对称伸缩振动。
实施例5
半胱氨酸修饰碳点
(I)半胱氨酸修饰碳点方法
将上述实施例1制备好的碳点溶液倒入圆底烧瓶中，加入Ig半胱氨酸，超声分散，于110°C下磁力搅拌回流72小时。反应完毕后，过滤后得滤液，用透析袋(MwIOOO)透析I天，期间换水3次，除去杂质。所得透析袋内的溶液过0.22 μ m滤器，得半胱氨酸修饰碳点，于4°C冰箱保存。
(2)半胱氨酸修饰碳点的性质表征
图9是PEG-NH2修饰碳点的紫外吸收光谱和荧光光谱。修饰后碳点的吸收和荧光发射光谱没有发生明显改变，修饰后的碳点在200 500纳米范围内有吸收，其发射光谱随着激发波长的增长，发射峰的位置向长波方向移动且强度减弱，发射波长的变化范围从430nm到550nm。不同激发波长下的碳点的荧光量子产率见表1，在320nm，350nm，380nm和400nm激发波长下，荧光量子收率分别为2.39%, 1.83%, 1.70%和1.78%，相对于裸露的碳点，荧光量子收率分别提高4.98，3.81，3.54和3.71倍。
(3)半胱氨酸修饰碳点的FTIR表征
图5中d为半胱氨酸修饰的碳点的红外光谱，3498CHT1左右由O-H的伸缩振动吸收峰和N-H的伸缩振动吸收峰重叠而成的一个宽峰，1650cm-1为酰胺NH-C = O特征吸收峰。
实施例6
α-多聚赖氨酸修饰碳点用于细胞成像
中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary, CHO),经0.25%的胰酶消化后形成单细胞悬液，以IX IO5密度种入24孔版中，加入Iml 1640培养基过夜。将α -多聚赖氨酸修饰碳点，用PBS稀释至50mg/ml左右后，每孔500 μ L到24孔版中，在5% CO2中37°C孵育24小时，置于荧光显微镜下观察。明场下选择合适视野，以450-490nm激发波长激发，α -多聚赖氨酸修饰碳点用于细胞成像结果见图10。
表I碳点和不同材料修饰的碳点的荧光效率
权利要求
1.一种功能性突光碳点，其特征在于:米用含碳材料草木灰，置于1.5 5mol/L硝酸中，于110 140°C加热回流4 24小时进行化学氧化，每IOOml硝酸的草木灰用量0.5-lg，一步法制备碳点；反应完毕后，过滤，滤液中和至中性，滤液加入截留分子量500-1000透析袋中，将透析袋在去离子水中透析，然后透析袋内溶液在过0.22 μ m滤膜，透过滤膜的滤液即为碳点溶液，干燥得碳点。
2.—种权利要求
1所述功能性荧光碳点的制备方法，其特征在于:采用含碳材料草木灰，置于1.5 5mol/L硝酸中，于110 140°C加热回流4 24小时进行化学氧化，每IOOml硝酸的草木灰用量0.5-lg，一步法制备碳点；反应完毕后，过滤，滤液中和至中性，滤液加入截留分子量500-1000透析袋中，将透析袋在去离子水中透析，然后透析袋内溶液在过0.22 μ m滤膜，透过滤膜的滤液即为碳点溶液，干燥得碳点。
3.—种表面修饰的功能性突光碳点,其特征在于: 在草木灰的硝酸溶液的中加入表面修饰材料，每IOOml硝酸的草木灰用量0.5-lg，或在权利要求
1所述制备完成的碳点溶液中或在于浓度1.1-1.5mg/ml碳点的水溶液中加入表面修饰材料，于110 140°C加热回流4 24小时进行化学氧化，反应完毕后，过滤，滤液中和至中性，滤液加入截留分子量500-1000透析袋中，将透析袋在去离子水中透析，然后透析袋内溶液在过0.22 μ m滤膜，透过滤膜的滤液即为制备成的可以发出强荧光的并且具有生物结合功能荧光碳点溶液，干燥得表面修饰的功能性碳点； IOOm的反应液表面修饰材料的用量lg。
4.按照权利要求
3所述表面修饰的功能性荧光碳点，其特征在于: 所述表面修饰材料为分子量Mw为4w-30w的壳聚糖，或分子量Mw为10000-15000的α -多聚赖氨酸、或分子量Mw为3000-5000的ε -多聚赖氨酸,或4, 7,10-三氧-1,13-十三烷二胺，或半胱氨酸；在碳点表面修饰，使之生成功能性荧光碳点； 并采用上述材料进行表面修饰，可提高碳点荧光量子效率并可以用于生物标记。
5.—种权利要求
3所述表面修饰的功能性突光碳点的制备方法,其特征在于: 在草木灰的硝酸溶液的中加入表面修饰材料，每IOOml硝酸的草木灰用量0.5-lg，或在权利要求
1所述制备完成的碳点溶液中或在于浓度1.1-1.5mg/ml碳点的水溶液中加入表面修饰材料，于110 140°C加热回流4 24小时进行化学氧化，反应完毕后，过滤，滤液中和至中性，滤液加入截留分子量500-1000透析袋中，将透析袋在去离子水中透析，然后透析袋内溶液在过0.22 μ m滤膜，透过滤膜的滤液即为制备成的可以发出强荧光的并且具有生物结合功能荧光碳点溶液，干燥得表面修饰的功能性碳点；IOOml的反应液表面修饰材料的用量Ig; 所述表面修饰材料为分子量Mw为4w-30w的壳聚糖，或分子量Mw为10000-15000的α -多聚赖氨酸、或分子量Mw为3000-5000的ε -多聚赖氨酸,或4, 7,10-三氧-1,13-十三烷二胺，或半胱氨酸；在碳点表面修饰，使之生成功能性荧光碳点；并采用上述材料进行表面修饰，可提高碳点荧光量子效率并可以用于生物标记。
6.一种权利要求
1或3所述的功能性碳点在生物标记中的应用。
7.按照权利要求
6所述的应用，所述被功能性碳点标记的生物可为细胞、抗原、抗体或核酸。
8.—种权利要求
1或3所述的所述功能性碳点在塑料棚膜中的应用，其特征在于:作为塑料棚膜的助剂，可提高农用塑棚膜的光转化率，将太阳光中的紫外光转换成植物可以利用的蓝紫光、促进 植物的吸收利用。
专利摘要
本发明公开了一种功能性碳点(Carbon Dots，简称CDs)的制备及其修饰产物在生物检测技术中的应用方法，特征是将草木灰加入到1.5～5mol/L硝酸中，110～140℃加热回流4～24小时，然后对产物进行酸碱中和、纯化和表面修饰。本发明原料来源丰富、价廉易得、碳点制备方法简单、修饰容易；所得荧光碳纳米微粒水溶性好、发光稳定、有良好的生物相容性，可直接作为荧光标记物应用于细胞成像等生化分析领域。
文档编号C12Q1/02GKCN103160279SQ201110411510
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月12日
发明者马小军, 谭明乾, 张玲馨, 刘洋 申请人:中国科学院大连化学物理研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan