专利名称：一种生物膜的制备检测方法
技术领域：
本发明涉及生物膜的制备检测方法，具体涉及一种陶粒生物膜的制备，以及检测 陶粒上生物膜微生物生长情况的方法。
背景技术：
生物预处理是对传统给水处理工艺的突破与革新，一般采用生物膜法，主要包括 生物接触氧化、生物滤池、生物转盘、生物流化床等。在目前的工业应用中，生物陶粒是生物 膜生长的主要载体之一。生物陶粒是以粘土为主要生产原料，在坯料中掺合一定成孔剂、粘 结剂，经配料、团粒、高温烧制、筛分等系列工艺加工而成的粒状材料。强度高、耐摩擦、物化 性能稳定、不向水体释放有毒有害物等特性。其主要成为偏铝酸盐，表观为近球形颗粒，表 面红褐色或深褐色、表面粗糙多微孔，适合于微生物在其表面生长、繁殖。由于具有较高的 比表面积，化学和热稳定性好，价格低廉，因此得到了广泛的应用。作为生物膜载体，生物陶粒比表面积大、机械强度高的物理特性，有利于微生物生 长繁殖，能为微生物提供稳定的栖息环境。附着生长在陶粒表面的生物膜能吸收水中的有 机物、氮磷等营养物质进行新陈代谢，达到净化水质的目的。生物陶粒的过滤机理与普通快 滤池有所不同，过滤作用主要基于机械截留作用、微生物新陈代谢产生的黏性物质起吸附 架桥作用和降低水中胶体颗粒的Zeta电位作用，使部分胶粒脱去形成较大颗粒而被去除。 在山西大同册田水库、滏阳河、官厅水库、绍兴青甸湖等地对受污染的水源水的生物预处理 试验研究结果表明，采用生物陶粒预处理可有效去除浊度、细菌、大量溶解性有机物、氨氮、 色度等污染物质，大大改善后续处理工艺对污染物的去除效果。在天津市自来水集团有限 公司进行的生物陶粒滤池处理水厂滤后水试验研究结果表明，生物陶粒滤池对滤后水中 CODMn的平均去除率为31. 0%，氨氮的平均去除率为67. 5%，对浊度也有很好的处理效果， 出水浊度均在0. 30 0. 40NTU范围内。生物陶粒表面形成的生物膜在水处理中起着重要作用，而目前对于生物膜的检测 往往只能根据经验判断，而没有明确的方法。本发明提供的生物膜形成和检测方法，能在生 物陶粒表面较快的形成生物膜，并能及时检测生物膜在陶粒表面的生长的情况，有利于后 续共组的及时开展。该方法也可应用于生物医学材料中生物膜的研究。本发明在水处理技 术和生物医学材料中有广泛的用途。
发明内容
为了改善目前生物陶粒表面挂膜效果不理想的状况，本发明提供了一种新的生物 膜制备方法，同时还提供了一种可及时反映生物膜中的微生物生长情况的检测方法，提高 生物膜生长的可控性，促进生物陶粒在水处理领域中的广泛应用。1、一种生物膜的制备检测方法，包括下述步骤(1)载体清洗灭菌用清水冲洗载体(陶粒)，然后置于超声波中清洗5-15min，在 121°C 灭菌 20-30min。
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(2)培养微生物在500mL的三角瓶中加入150_200mL的液体培养基，将对数期菌
种入到培养基中，在摇床中培养至对数生长期中期。(3)陶粒挂膜在超净台上将100_150g清洗灭菌后的陶粒加入到装有培养物的三 角瓶中，再将三角瓶放在摇床中，转速调为80-100rmp培养。(4)生物膜检测陶粒在培养基中培养4_6h后，开始进行生物膜的定期检测。检 测方法是取6-8颗中等大小的陶粒放入无菌试管，加入lmL无菌水，将试管放在固定好速率 的漩涡仪上振荡2-4min。用血球计数板对试管中的细菌进行计数，做相应曲线图，当试管中 细菌数目不增加或增长幅度很小时，可认为是生物膜达到最好的时期，即生物膜的培养稳 定期。该取样测试实验做三组重复，以确保其稳定。2、陶粒生物膜的制备方法，其特征在于用超声波清洗陶粒，清除陶粒所吸附的尘 土杂质，减少对微生物生长的干扰，同时增大陶粒的比表面积，便于更多的微生物进行附着 生长，提高微生物的生物量。3、陶粒生物膜的制备方法，其特征在于微生物培养至对数期中期时，菌体生长速 率快，生物活性很强，便于在陶粒上快速附着生长。4、根据所述陶粒生物膜的制备方法，微生物培养时摇床转速为160-180rmp，有利 于充足的溶氧供给，当培养物中加入陶粒培养时，摇床的转速降为80-100rmp，一方面时保 证溶氧，另一方面防止陶粒的振荡的机械剪切力影响菌体的生长。5、根据陶粒生物膜的检测方法，其特征在于生物膜的检测是实时监控，在陶粒生 物膜培养过程中，取6-8颗(根据具体情况固定陶粒数目)中等大小的陶粒放入无菌试 管，加入lmL无菌水，将试管放在固定好速率的漩涡仪上振荡2-4min(根据具体情况固定时 间)。用血球计数板对试管中的细菌进行计数，在固定的了陶粒数目和旋涡仪振荡的速率时 间后，对生物膜上的菌体数进行计数是一种及时又简便可靠的检测方法。
具体实施例方式通过以下实例的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不 应理解为本发明上述主题的范围仅局限于下述实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术 均属于本发明的范围。实施例1(1)陶粒清洗灭菌用清水冲洗陶粒，除去灰尘杂质，然后置于超声波中清洗 lOmin，在 121°C灭菌 20min。(2)培养微生物在500mL的三角瓶中加入200mL的液体培养基，将培养到对数期 的菌株P. aeruginosaEl接种到培养基中，在30°C、转速180rpm的恒温摇床中振荡培养，16h 左右菌株进入对数生长期中期，将三角瓶取出。(3)陶粒挂膜在超净台上将100g清洗灭菌后的陶粒加入(2)处理的三角瓶中， 再将三角瓶放回摇床中，培养条件为30°C、转速lOOrmp，让菌体附着在陶粒上生长。(4)生物膜检测陶粒在培养基中培养6h后，每隔1小时从三角摇瓶中取6颗中 等大小的陶粒放入装有lmL无菌水的无菌试管中，将试管放在固定好速率的漩涡仪上振荡 4min。用血球计数板对试管中的细菌进行计数，做三个重复取样实验。在加入陶粒培养10h 后，试管中的菌体数量维持在一个较高的水平不再提高，此时生物膜达到最好的时期，停止
4生物膜的培养，进入后续实验。实施例2(1)陶粒清洗灭菌用清水冲洗陶粒，去除灰尘杂质，然后置于超声波中清洗 lOmin，在 121°C灭菌 20min。(2)培养微生物在500mL的三角瓶中加入150_200mL的液体培养基，将培养到对 数期的硫酸盐还原细菌K4接种到培养基中，在32°C、转速180rpm的恒温摇床中振荡培养， 18h左右菌株进入对数生长期中期，将三角摇瓶取出。(3)陶粒挂膜在超净台上将100g清洗灭菌后的陶粒加入⑵处理的三角差中， 再将三角瓶放回摇床中，培养条件为32°C、转速lOOrmp，让菌体附着在陶粒上生长。(4)生物膜检测陶粒在培养基中培养8h后，每隔1小时从三角摇瓶中取6颗中 等大小的陶粒放入装有lmL无菌水的无菌试管中，将试管放在固定好速率的漩涡仪上振荡 4min。用血球计数板对试管中的细菌进行计数，做三个重复实验。在加入陶粒培养14h后， 试管中的菌体数量维持在一个较高的水平不再提高，此时生物膜达到最好的时期，停止生 物膜的培养，进入后续实验。实施例3(1)陶粒清洗灭菌用清水冲洗陶粒三次，去除灰尘杂质，然后置于超声波中清洗 lOmin，在 121°C灭菌 20min。(2)培养微生物在500mL的三角瓶中加入150_200mL的液体培养基，将培养到对 数期的菌株P. aeruginosa D2接种到培养基中，在30°C、转速180rpm的恒温摇床中振荡培 养，16h左右菌株进入对数生长期中期，将三角摇瓶取出。(3)陶粒挂膜在超净台上将100g清洗灭菌后的陶粒加入⑵处理的三角瓶中， 再将三角瓶放回摇床中，培养条件为30°C、转速lOOrmp，让菌体附着在陶粒上生长。(4)生物膜检测陶粒在培养基中培养8h后，每隔1小时从三角摇瓶中取6颗中 等大小的陶粒放入装有lmL无菌水的无菌试管中，将试管放在固定好速率的漩涡仪上振荡 4min。用血球计数板对试管中的细菌进行计数，做三个重复实验。在加入陶粒培养12h后， 试管中的菌体数量维持在一个较高的水平不再提高，此时生物膜达到最好的时期，停止生 物膜的培养，进入后续实验。
权利要求
一种生物膜的制备检测方法，包括下述步骤(1)载体清洗灭菌用清水冲洗陶粒，然后置于超声波中清洗5 15min，在121℃灭菌20 30min。(2)培养微生物在500mL的三角瓶中加入150 200mL的液体培养基，将对数期菌种入到培养基中，在摇床中培养至对数生长期中期。(3)载体挂膜在超净台上将一定量的载体灭菌后加入到装有培养物的三角瓶摇瓶中，再将三角瓶放在摇床中，转速调为80 100rmp培养。(4)生物膜检测载体在培养基中培养4 6h后，开始进行生物膜的定期检测。检测方法是取一定的载体放入无菌试管，加入1mL无菌水，将试管放在固定好速率的漩涡仪上振荡2 4min。用血球计数板对试管中的细菌进行计数，做相应曲线图，当试管中细菌数目不增加或增长幅度很小时，可认为是生物膜达到最好的时期，此时可停止生物膜的培养。
2.根据权利要求1所述尘物膜的制备方法，其特征在于用超声波清洗载体，清除载体 所吸附的尘土杂质，减少对微生物生长的干扰，同时增大载体的比表面积，便于更多的微生 物进行附着生长，提高微生物的生物量。
3.根据权利要求1所述生物膜的制备方法，其特征在于微生物培养至对数期中期时， 菌体生长速率快，活性很强，便于在载上快速生长。
4.根据权利要求1所述载体生物膜的制备方法，其特征在于微生物培养时摇床转 速为160-180rmp，有利于充足的溶氧供给，当培养物中加入载体培养时，摇床的转速降为 80-100rmp，一方面时保证溶氧，另一方面防止载体的振荡的机械剪切力影响菌体的生长。
5.根据权利要求1所述生物膜的检测方法，其特征在于生物膜的检测是实时监控，在 生物膜培养过程中，取固定重量(或体积)的载体放入无菌试管，加入lmL无菌水，将试管 放在固定好速率的漩涡仪上振荡2-4min (根据具体情况固定时间)。用血球计数板对试管 中的细菌进行计数，在固定的了载体的量和旋涡仪振荡的速率时间后，对生物膜上的菌体 数进行计数是一种及时又简便可靠的检测方法。
全文摘要
本发明涉及一种生物膜的制备检测方法。经过超声波清洗载体、微生物培养、载体挂膜和生物膜检测等步骤，在载体上能形成稳定的微生物生物膜。采用超声波清洗载体，能增大载体的比表面积，便于更多的微生物在其上进行附着生长，提高微生物的生物量。采用从微生物生长对数期的中期开始挂膜的方法，能缩短挂膜时间，有效提高挂膜效率。采用血球记数的方式能及时准确地监控生物膜上菌体的生长情况。该生物膜制备检测方法筛单快速，可广泛应用于环境水处理、生物医学材料等领域。
文档编号C02F3/10GK101974610SQ20101028036
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月14日 优先权日2010年9月14日
发明者刘学端, 曾晓希, 李文, 汤建新, 蒋佩 申请人:曾晓希