专利名称：一种荧光假单胞菌制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有降解尼古丁的荧光假单胞菌制剂及其应用，属微生物技术领域。
背景技术：
尼古丁(1-甲基-2-(3-吡啶基)吡咯烷)烟草中的重要植物碱，含量约为烟叶干重0. 17-4.93%。中国是最大的烟草生产国和世界上的消费国，约占全球30-35%。烟草对人体形成的满足感主要是因为尼古丁的作用。适当浓度的尼古丁保证了烟草的吸食特性。在香烟生产过程中，尼古丁的含量过高会增加烟气的刺激性，影响卷烟吸味，安全性也差。如何把烟草的尼古丁含量控制到人们所期望的范围，是烟草科技工作者和环境保护者研究的热点课题。另一方面，尼古丁可能污染环境和造成严重的生态问题。烟草生产过程的所有活动经常产生含有高浓度的尼古丁的固体或液体废弃物，而尼古丁是这些废弃物的主要有害成分。这些废物如不及时处理会给人们的生存和生活带来极大的危害。从烟草的利用和环境安全性的角度上，调整或降解尼古丁都是非常重要的。尼古丁的降解包括自然降解、化学降解和物理方法，这些使尼古丁降解或减少的方法中尼古丁的微生物降解引起了越来越多的关注。过去一段时间，越来越多的微生物被证明具有降解尼古丁的能力。例如，Arthrobacter nicotinoborans, A. globiformils，Nocardioides sp.，Achromobacter nicotinophagum， Rhodococcus sp. ， Ochrobactrum intermedium， Pseudomonas putida， Pseudomonas convexa,Ensifer sp等。据可查资料，没有荧光假单胞菌能够降解尼古丁的报告。荧光假单胞菌在植物病害的生物防治上、在有机废弃物的生物治理中有着广泛地应用。
微生物在尼古丁的降解过程中涉及到多个途径，且在每个途径中涉及到多个酶促反应，因此，应用生物酶降解尼古丁还未见报道，但国内外有许多应用微生物活体降解尼古丁的案例。1997年Civilini等报道了采用P. putida和A. oxidans pAOl处理尼古丁废弃物的渗洗液，结果表明P. putida的处理效果最好。Brown & Williamson烟草公司利用纤维单胞菌来降低烟草中的尼古丁和硝酸盐含量。结果显示，将经过处理的白肋烟和其它烟叶混合，与未经处理的白肋烟叶片相比，混合烟丝的硝酸盐含量从1. 63 %降至1. 04%，尼古丁从1. 79%降至1. 32%。将这些经过处理的混合烟丝制成卷烟后，烟气分析表明，硝酸盐、 氰化氢和尼古丁各降低了 38.8%、19.7%和15.3%。由此可见，通过微生物手段降低尼古丁含量和消除污染在生产中具有很高的实际应用价值，其意义不但能够提高烟叶资源的利用率，取得丰厚的经济效益，而且还能够改善生态环境，获得显著的社会效益，利用微生物降解尼古丁前景广阔。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够高效降解尼古丁、制备成本低的荧光假单胞菌制剂及其应用。
本发明是这样实现的
1、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) 1206 的获得
所用培养基富集培养基(EM)由以下成分构成d.eg-r1 K2HP04,0. 4g · Γ1 KH2PO4,0. Ig · Γ1 NaCl，0. 2g · Γ1 MgSO4 · 7H20, and 0. 05g · Γ1 CaC12，培养基 pH 调节到 7. 0，灭菌后培养基添加终浓度为Ig · Γ1的过滤除菌的尼古丁作为唯一的碳源和氮源；分离培养基(IM)由每升EM添加ImL微量元素溶液(2gL_1 MnSO4 · Η20，0· IgF1 CuSO4 · 5Η20， 0. 2grJ ZnSO4 · 7Η20，0· NaMoO4 · 2Η20)禾口 15g 琼脂组成。
荧光假单胞菌1206分离土壤样品采自云南省玉溪市植烟土壤。菌株分离以下富集培养选择性筛选的程序。土壤样品在富集培养基中30°C 200rpm摇床富集培养3天。富集培养的悬浮液采用稀释平板的方法分离能够在分离培养基生长的菌株。通过划线培养的方式获得单菌落，保存备用。其中有一菌落长势旺盛表现较好，定名为1206菌株。
2、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) 1206 的特性
对1206菌株进行生物学和生化试验，革兰氏阴性菌。杆状，0.8 LOymX 1.8 2.5μπι。不产生芽孢。极生鞭毛1 3根。好氧生长。NA培养基上菌落呈圆形、凸起、有粘液，在酵母膏-甘露醇-无机盐琼脂上3天后直径一般为2 3mm。最适生长温度为25 35°C，培养物产生可扩散的荧光色素；甲基红试验阳性；接触酶反应阳性；精氨酸双水解酶反应阳性；硝酸盐还原反应阳性；吲哚试验阳性；氧化酶反应阳性；水解明胶；水解酪素，水解卵磷脂，不水解淀粉；在41°C不生长，在4°C生长。能够利用如下物质作为唯一碳源丙酸盐、葡萄糖、海藻糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、β -苯丙氨酸、L-脯氨酸和DL-精氨酸。
3、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) 1206的鉴定和保藏
对该菌进行16SrDNA序列测定，GenBank注册号GU059580，1206菌株16S rDNA序列与假单胞菌属的菌株相似性达到99%。通过序列比对和生化特性将1206鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
本发明所述的荧光假单胞菌(1206)已于2009年6月四日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。保藏单位简称CGMCC，保藏编号为CGMCCN0. 3149，分类命名为荧光假单胞菌O^seudomonas fluorescens)，保藏单位地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮政编码100080。
4、荧光假单胞菌制剂制备
a.斜面培养培养基为营养琼脂培养基，28 30°C保温培养48h。
b.摇瓶种子培养将荧光假单胞菌1206斜面菌种接种到配方(体积百分比)为牛肉膏3%、蛋白胨0.5%、氯化钠0. 5%、其余为自来水、pH 7. 0-7. 2的摇瓶培养液中，在温度、摇瓶转速为150rpm的条件下培养18_24h，获得液体发酵种子。
c.液体发酵工艺将发酵种子接种到装有液体培养基配方(g/L)麦芽糖35、酵母膏 4. 03、硫酸铵 4. 72、K2HP040. 4、MgS04. 7H20 0. 075、FeS04. 7H20 0. 0005、CaC120. 015、 NaCl 0. 1，在发酵温度27 、接种量5 10%，发酵罐搅拌速度120 150rpm，通气量 5 10%，发酵时间为M 48h的条件下得到荧光假单胞菌制剂，放入容器中避光保存，1 星期内使用完毕；上述接种量和通气量的百分比为体积百分比。
本发明的荧光假单胞菌制剂作为降解烟草或烟草废弃物中的尼古丁的应用。
本发明的优点在于发酵周期短，制备成本低，具有良好的降解尼古丁功能，能用于调节烟叶中尼古丁含量和降低烟草废弃物中尼古丁含量，提高烟草的品质，提高烟叶资源的利用率和改善生态环境，经济效益和社会效益显著。
附图为1206在含有尼古丁的液体中的生长和尼古丁降解效果图。图中X，LB培养基中的OD6tltl ；·，LB-N培养基中的0D_ ；·, LB-N中尼古丁浓度。图中数值为三次重复， 竖线为标准偏差。
具体实施例方式
本发明实施例中培养基配方的比例均为g/L。
实施例1 :(用于含尼古丁液体)
制备荧光假单胞菌制剂
制剂生产菌株为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens) 1206，CGMCC NO. 3149 ；
a.发酵菌种培养将荧光假单胞菌1206斜面菌种接种到配方为牛肉膏3%、蛋白胨0. 5%、氯化钠0. 5%、其余为自来水、pH 7. 0或7. 2的培养液中，摇瓶转速为150rpm，在或^TC或30°C温度下培养18h，获得液体发酵种子。
b.发酵工艺将液体发酵种子接种到装有液体发酵体系的发酵罐中，培养基配方(g/L)麦芽糖 35、酵母膏 4. 03、硫酸铵 4. 72、K2HPO4O. 4、MgSO4. 7H20 0. 075、FeSO4. 7H20 0.0005、CaCl2O. 015、NaCl 0. 1。在发酵温度、接种量8%，消泡剂0. 08%，发酵罐搅拌速度120rpm或130rpm或150rpm，通气量5%或8%或10%，发酵时间为24h或3 或48h 的条件下得到荧光假单胞菌制剂，制剂的活菌含量为1. 3-8. 9X109个/ml。
本发明的尼古丁降解制剂的应用将降尼古丁降解制剂接种(接种量)到含有0. 尼古丁的LB (含有IOgr1蛋白胨，Sgr1酵母膏，Sgr1g NaCl)液体中，30°C 150rpm 药瓶培养，每隔2小时取样检测溶液的尼古丁含量(采用HPLC法)，和代表菌体数量的溶液0D600值。应用结果见附图，1206菌株培养24h后超过97%的尼古丁被降解。一个良好的相关性观察之间的细菌培养的OD值增加和减少了在LB-N(每升LB培养基添加Iml尼古丁)中尼古丁浓度。在最初的8个小时，尼古丁的降解缓慢，降解率从8小时18小时加速， 1206菌株在不同培养基中表现出不同的增长特性。1206菌株在LB-N培养基中生长不如在 LB培养基旺盛。由此说明，对菌株1206来说尼古丁可能是有毒的和抑制菌株增长略有下降。经过12小时的培养，菌株1206增长率随着尼古丁降解逐渐增加。
实施例2 (用于烟厂废水)
荧光假单胞菌制剂的制备同实施例1。
本发明的尼古丁降解制剂的应用将降尼古丁降解制剂接种(接种量)到含有尼古丁的烟厂废水中，30°C 150rpm摇瓶培养，4 后取样检测溶液的尼古丁含量。应用结果结果为的制剂用量在48小时后烟厂废水中尼古丁的降解率为89%，即在不添加任何其他物质的情况下，应用本发明的制剂可以使废水中的大部分尼古丁得以降解。
实施例3 (用于烤烟烟叶处理)
荧光假单胞菌制剂的制备基本同实施例1。
本发明的尼古丁降解制剂的应用采用半叶实验方法，将烟叶叶片从中脉剪开，一半用于本发明菌剂处理，将本发明的制剂用水稀释10倍，喷雾到烟叶上，另一半喷施清水作为对照。将处理和对照烟叶自然流失掉多余的溶液，然后装入烤房中，按常规的烘烤方法进行烘烤。烘烤后的烟叶进行尼古丁的检测，结果表明，应用本发明的尼古丁降解制剂处理较对照尼古丁含量降低对％。
权利要求
1.一种荧光假单胞菌制剂，由生产菌株经发酵种子培养、发酵罐发酵后得到，其特征在于该制剂由下列步骤得到a.选用的生产菌株为荧光假单胞菌O^seudomonasfluorescens) 1206， CGMCCN0. 3149 ；b.发酵种子培养将荧光假单胞菌1206斜面菌种接种到配方为牛肉膏3%、蛋白胨 0. 5%、氯化钠0. 5%、其余为蒸馏水、pH 7. 0-7. 2的摇瓶培养液中，在观 30°C温度、摇瓶转速为150rpm条件下培养18h，获得液体发酵种子；c.发酵罐发酵工艺将液体发酵种子接种到装有液体发酵体系的发酵罐中，培养基配方(g/L)麦芽糖 35、酵母膏 4. 03、硫酸铵 4. 72、K2HPO4O. 4、MgSO4. 7H20 0. 075、FeSO4. 7H20 0.0005、CaCl2O. 015、NaCl 0. 1 ；在发酵温度 27 29°C、接种量 5 10%，消泡剂 0. 08%， 发酵罐搅拌速度120 150rpm，通气量5 10%的条件下，发酵M 4 得到活菌含量为每毫升1. 3亿-8. 9亿的荧光假单胞菌制剂。
2.权利要求1所述荧光假单胞菌制剂，作为用于降解烟草废弃物中尼古丁的应用。
3.权利要求1所述荧光假单胞菌制剂，作为用于降低烟叶中尼古丁含量的应用。
全文摘要
本发明涉及一种荧光假单胞菌制剂，属微生物技术领域。该制剂由下列步骤得到a.选用的生产菌株为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)1206，CGMCC NO.3149；b.种子培养将荧光假单胞菌1206斜面菌种接种到配方为牛肉膏3％、蛋白胨0.5％、氯化钠0.5％、其余为蒸馏水、pH 7.0-7.2的培养液中，摇瓶转速为150rpm，在28～30℃温度下培养18h，获得液体发酵种子。c.发酵罐发酵将液体发酵种子接种到装有液体发酵体系的发酵罐中，培养基配方(g/L)麦芽糖35、酵母膏4.03、硫酸铵4.72、K2HPO40.4、MgSO4.7H2O 0.075、FeSO4.7H2O 0.0005、CaCl20.015、NaCl 0.1。在发酵温度27～29℃、接种量5～10％，发酵罐搅拌速度120～150rpm，通气量5～10％，发酵时间为24～48h。本发明具有发酵周期短，尼古丁降解率高，能提高烟草的品质，能用于降解烟草或烟草废弃物中的尼古丁。
文档编号C02F3/34GK102517226SQ20111033078
公开日2012年6月27日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者吴玉萍, 夏振远, 莫笑晗, 雷丽萍 申请人:云南省烟草农业科学研究院