专利名称：高效液相色谱法中分离磷脂的流动相的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高效液相色谱法分离磷脂时使用的流动相，属于有机 化学分析技术领域。
技术背景用高效液相色谱法分离磷脂的方法包括等度洗脱法和梯度洗脱法。一般用高效液相色谱仪和紫外检测器联用(HPLC-UV)来检测磷脂，高效液相 色谱仪给色谱柱提供流速稳定和压力较高的流动相，使样品在色谱柱进行 分离，然后用紫外检测器来检测被分离的磷脂。如果检测时流动相各溶剂 比例恒定，则是等度洗脱法，如果仪器按照需求自动混合不同的溶剂，则 是梯度洗脱法。梯度洗脱法溶剂的配比随时间而变化，每次分离都需要重新平衡，所以分析时间长、操作复杂、工作量大；而等度洗脱法操作简单、 省时、重现性好、不存在重新平衡的问题，所以被广泛使用。但是等度洗 脱法的条件难以摸索，流动相各溶剂的配比较难确定。另外，由于磷脂的最大吸收波长在205nm左右，而许多试剂在波长 205nm左右也有强烈的吸收，容易干扰磷脂的检测，导致紫外检测器灵敏 度降低。因此，等度洗脱法主要使用以下流动相由乙腈-甲醇-磷酸/硫酸 组成的流动相，和由正己烷(或三氯甲烷/二氯甲烷)-异丙醇-氨水组成的 流动相，以及其它类似的流动相。其中，乙腈-甲醇-磷酸/硫酸组成的流动 相中的磷酸/硫酸会产生沉淀，使高效液相色谱仪中高压泵的柱塞和密封垫 摩擦产生划痕而造成系统漏液。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效液相色谱法中分离磷脂的流动相，解决 现有技术等度洗脱法中高效液相色谱仪使用时流动相的配比和沉淀问题。本发明所提出的高效液相色谱法中分离磷脂的流动相，其组成按体积百分比包括甲醇10%~50%,乙腈50%~85%，氟代有机酸0. 5% ~ 3%，水 0. 5~ 3%。所述流动相组成的合适体积百分比为甲醇10%~25%，乙腈75%~ 85%,氟代有机酸1%~2.5%,水1%~3%。所述流动相组成的较佳体积百分 比为甲醇19~20%,乙腈77~78°/。，氟代有机酸1~2%，水1. 5 ~ 2. 5%。 所述氟代有机酸包括三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟 己酸、十三氟庚酸、十五氟辛酸的任一种。本发明所提出流动相的作用原理随着蒸发光散射检测器的发展，在 205nm处有强烈吸收的一些试剂也可以进行应用，本发明结合高效液相色 谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD )发现多种酸可以代替磷酸/硫酸等添加 剂应用到磷脂的检测，而且与仪器的兼容性非常好，所以高效液相色谱仪 对流动相的吸收波长已无要求，但是对高效液相色谱仪有腐蚀沉淀损害作 用的含磷酸/硫酸的流动相仍被广泛使用。通过试验和分析，现有流动相中 的磷酸/硫酸等无机添加剂在有机流动相中的溶解度有限，未溶解的磷酸/ 硫酸以沉淀形式存在于流动相，最终沉淀在泵系统中，造成柱塞杆和密封 圈的摩擦损害。而由于三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸、十一 氟己酸、十三氟庚酸、十五氟辛酸等氟代有机酸的结构类似、性质相近， 用其替换磷酸/硫酸等无机酸，完全可以避免沉淀的产生，且不会对泵循环 系统造成伤害，与仪器的兼容性非常好，可长期使用。为了减少有机酸对 色谱柱造成损害，须在流动相中加入一定比例的水以提高流动相的pH值。本发明所提出的流动相具有以下优点1、本发明流动相经长期使用，对高效液相色谱仪的泵系统未有任何损 害。所述的氟代有机酸在任意比例的乙腈-甲醇-水中能以任意比例完全互 溶，不产生任何沉淀，不会对泵系统造成损害，常年使用情况良好。2、 本发明的流动相可以在蒸发光散射检测器中用于检测被分离的磷 脂，与紫外检测器相比，灵敏度高；而且从试剂应用角度讲，本发明流动 相的应用基本不受任何限制。3、 使用本发明流动相检测得到的基线稳定，易于定量分析；而使用紫 外检测器基线容易飘移，造成定量的不准确性。4、 本发明与梯度方法相比，使用单泵即可实现分离检测；而梯度方法 需要多泵或者多元混合器才能实现。5、 本发明流动相采用合适配比时，除了可以对磷脂进行有效分离，还 能分离出其他流动相无法分离的未知物质。6、 本发明流动相中加有一定比例的水，可提高流动相的pH值，减少 有机酸对色谱柱造成的损害。7、 当本发明流动相应用于等度洗脱时，搡作简单、省时、重现性好、 容易重复。附图及其说明附图l是釆用现有技术甲醇乙腈85%磷酸(64.7% : 34.9% : 0.4%) 的流动相对红细胞膜样品中萃取的磷脂进行分离检测所得到的HPLC-UV色 谱图；其能分离出四种主要磷脂(PS、 PE、 PC、 SM)和一种未知物(*)， 但长期使用会损害液相系统高压泵，导致泵漏液。附图2为采用本发明甲醇乙腈三氟乙酸水(29.5% : 68.8% :0.7% : 1W的流动相对红细胞膜样品中萃取的磷脂进行分离检测所得到的HPLC-UV色谱图；能将主要磷脂(PS、 PE、 PC、 SM)基本实现基线分离。附图3为釆用本发明甲醇乙腈五氟丙酸水(29.5% : 68.8% : 0.7%: 1%)的流动相对红细胞膜样品中萃取的磷脂进行分离检测所得到的HPLC-UV色谱图;能将主要磷脂(PS、 PE、 PC、 SM)基本实现基线分离。
附图4为釆用本发明甲醇乙腈七氟丁酸水(49.1% : 49.1% : 1.1%: 0.7%)的流动相对红细胞膜样品中萃取的磷脂进行分离检测所得的HPLC-ELSD色谱图；所得到的基线更稳定，能将主要磷脂(PS、 PE、 PC、 SM)实现基线分离。附图5为釆用本发明甲醇乙腈三氟乙酸水(32.7% : 65.5% : 1.1%: 0.7%)的流动相对红细胞膜样品中萃取的磷脂进行分离检测所得的HPLC-ELSD色谱图；其将主要磷脂(PS、 PE、 PC、 SM)完全基线分离。附图6为釆用本发明甲醇乙腈五氟丙酸水(32.7% : 65.5% : 1.1% : o. 7%)的流动相对红细胞膜样品中萃取的磷脂进行分离检测所得的HPLC-ELSD色谱图；可将主要磷脂(PS、 PE、 PC、 SM)完全基线分离。附图7为釆用本发明甲醇乙腈三氟乙酸水(19.4% : 77.4% : 1.9% : l. 3%)的流动相对红细胞膜样品中萃取的磷脂进行分离检测所得的HPLC-ELSD色谱图；可将主要磷脂(PS、 PE、 PC、 SM)和一种未知物(*)完全基线分离。附图8为采用本发明甲醇乙腈五氟丙酸水(19.4% : 77.4% : 1.9% : 1.3%)的流动相对红细胞膜样品中萃取的磷脂进行分离检测所得的HPLC-ELSD色谱图；可完全将主要磷脂(PS、 PE、 PC、 SM)和一种未知物 (*)完全基线分离。附图9为采用本发明甲醇乙腈三氟乙酸水(16.2% : 80.9% :0.6% : 2. 3%)的流动相对红细胞膜样品中萃取的磷脂进行分离检测所得的 HPLC-ELSD色谱图；可以将更多的主要磷脂(PI、 PS、 PE、 PC、 SM)和未知物(*)实现分离，但SM峰形拖尾严重。附
图10为釆用本发明甲醇乙腈九氟戊酸水(16.2% : 80.9% :0.6% : 2. 3%)的流动相对红细胞膜样品中萃取的磷脂进行分离检测所得的 HPLC-ELSD色谱图；可以将更多的主要磷脂(PI、 PS、 PE、 PC、 SM)和未 知物(*)实现分离，但SM峰形拖尾严重。图中横坐标是保留时间(分钟)；纵坐标是响应值电压(伏)； 图中的SF为溶剂前沿(solvent front); *是未经鉴定的物质，目前 只能知道是一种脂；PI是磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol); PS是磷 脂酰丝胺酸(phosphatidylserine); PE是磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl-ethanolamine ); PC是磷脂酰胆碱(phosphatidylcholin ); SM是鞘磷脂 (Sphingomyelin),以上色谱图都是从红细胞膜或是组织中提取出来并釆 用本发明流动相及色谱柱分离检测得到的结果，说明能将这些细胞膜或者 组织中的磷脂有效分离。
具体实施方式
以下结合附图对本发明流动相各组分配比的具体实施及其效果进行说 明，并对采用本发明流动相分离检测时具体的色谱条件说明。高效液相色谱仪包括系统控制器、紫外检测器、高效液相泵系统、脱气 系统和柱温箱。色谱柱为反相分析柱C18 (250隱x4. 6 mm I.D.),蒸发光 散射检测器飘移管温度80°C，氮气流速2L/分钟；流动相流速1. 0 ml/分钟。分离检测实验最初用HPLC-UV分离检测磷脂，样品为从猪红细胞膜中萃取的磷脂，流动相的体积比为甲醇乙腈85%磷酸(64.7% : 34.9% :0.4%),检测结果见附图l,但发现高效液相色谱仪的泵漏液。为了避免泵漏液，将流动相改为甲醇乙腈三氟乙酸水(29.5% :68.8% : 0.7% : 1%),检测结果见附图2，虽能将各磷脂基本基线分离，但 是基线有一定飘移。由于使用uv检测器，因此三氟乙酸的调整受到限制，三氟乙酸越高，基线噪音越大，灵敏度越低。而采用五氟丙酸也会产生同样的问题，流动相改为甲醇乙腈五氟 丙酸水(29.5% : 68.8% : 0.7% : 1%),检测结果见附图3。以下实验使用HPLC-ELSD，釆用从猪红细胞膜样品中萃取的磷脂，此
时流动相的体积比为甲醇乙腈七氟丁酸水(49.1% : 49.1% : 1.1% : 0.7%)，检测结果见附图4，各主要磷脂基本被基线分离，而且基线稳定。改变流动相组分比例，流动相为甲醇乙腈三氟乙酸水(32.7% : 65.5% : 1.1% : o. 7%),检测结果见附图5，各主要磷脂被完全基线分离， 而且基线稳定，同时发现有一未知峰有一定保留。将流动相中三氟乙酸改为五氟丙酸，流动相为甲醇乙腈五氟丙 酸水(317% : 65.5% : 1.1% : o. 7%)，检测结果见附图6，各主要磷脂仍 被基线分离，并且未知峰有更好的保留。进一步调整流动相各组分比例，流动相体积比为甲醇乙腈三氟乙 酸水(19.4% : 77.4% : l. 9% : l. 3%),检测结果见附图7，各主要磷脂和 未知峰都被基线分离，并且各磷脂的灵敏度都高。将流动相中三氟乙酸改为五氟丙酸，流动相为甲醇乙腈五氟丙 酸水(19.4% : 77.4% : l. 9% : 1.3°/。)，检测结果见附图8，各主要磷脂和 未知峰同样都被基线分离，并且各磷脂的灵敏度都高。继续降低流动相中甲醇比例，流动相为甲醇乙腈三氟乙酸水 (16.2%: 80.9%: 0.6%: 2.3%),检测结果见附图9，由图中看出，在以上实验中有几种没有保留的物质被保留，并且基本基线分离，但SM峰的拖尾较为严重。将流动相中三氟乙酸改为九氟戊酸，流动相为甲醇乙腈九氟戊 酸水(16.2% : 80.9% : o. 6% : 2.3%)，检测结果见附图10,同样有几种没有保留的物质被保留，并且基本基线分离，但SM峰的拖尾较为严重。
权利要求
1、一种高效液相色谱法中分离磷脂的流动相，其特征在于，流动相的组成按体积百分比包括甲醇10％～50％，乙腈50％～85％，氟代有机酸0.5％～3％，水0.5～3％。
2、 根据权利要求l所述的流动相，其特征在于，所述流动相组成的体 积百分比为甲醇10%~25%，乙腈75%~85%,氟代有机酸1% ~ 2. 5%,水 1%~ 3%。
3、 根据权利要求1所述的流动相，其特征在于，所述流动相组成的体 积百分比为甲醇19~20%,乙腈77~78%，氟代有机酸1 ~ 2%，水1. 5 ~ 2. 5%。
4、 根据权利要求1所述的流动相，其特征在于，所述的氟代有机酸包 括三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、十五氟辛酸的任一种。
全文摘要
一种高效液相色谱法中分离磷脂的流动相，本发明流动相的组成包括甲醇10％～50％，乙腈50％～85％，氟代有机酸0.5％～3％，水0.5～3％。本发明流动相经长期使用，不产生任何沉淀，不会对泵系统造成损害，对液相色谱仪的泵系统未有任何损害；可以在蒸发光散射检测器中用于检测被分离的磷脂，与紫外检测器相比，检测得到的基线稳定，易于定量分析，灵敏度高，其流动相的应用不受任何限制；与梯度方法相比，使用单泵即可实现分离检测；在流动相采用合适配比时，除了可以对磷脂进行有效分离，还能分离出其他流动相无法分离的未知物质。当本发明流动相应用于等度洗脱时，操作简单、省时、重现性好、容易重复。
文档编号B01D15/08GK101156995SQ20071001849
公开日2008年4月9日 申请日期2007年8月16日 优先权日2007年8月16日
发明者严坤平, 宁 但, 超 陈 申请人:陕西北美基因股份有限公司