一种磁微粒化学发光免疫分析试剂用羧基磁珠的制备方法与流程

本发明涉及一种磁微粒化学发光免疫分析试剂用羧基磁珠的制备方法。

背景技术：

磁性微球是一类直径在纳米或微米级的球形复合材料。磁性微球的核心有四氧化三铁或三氧化二铁等超顺磁性材料构成，外围包覆聚苯乙烯或葡聚糖等高分子材料。核心物质具有超顺磁性，使磁珠可以在外加磁场作用下向磁场方向移动达到分离的目的；外围高分子材料可以通过物理或化学的方法活化产生氨基(NH2-)、羧基(COOH-)或环氧基(—CH(O))等基团，可以与蛋白等生物活性分子偶联。偶联后的磁珠广泛应用于生物标记、生物分子的分离、蛋白的纯化、抗体纯化、分子诊断等领域。现有方法制备的羧基磁珠，其磁场响应性不好，磁性微球的制备原料价格昂贵、设备复杂、不易于实现控制、工艺重复性差、产品质量不稳定、不易于大批量生产；制备过程不便于在免疫磁珠的把控磁珠的活化率和偶联率，增加磁珠交联的风险，不能够保证磁珠交联的批次稳定性。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种磁微粒化学发光免疫分析试剂用羧基磁珠的制备方法，其制得的羧基磁珠磁场响应性均一，磁性微球的制备原料价廉易得、设备简单、易于实现控制、工艺重复性好、产品质量稳定、操作安全可靠、易于大批量生产；便于在免疫磁珠的制备中能更好的把控磁珠的活化率和偶联率，降低磁珠交联的风险，保证磁珠交联的批次稳定性。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明一种磁微粒化学发光免疫分析试剂用羧基磁珠的制备方法，其包括以下步骤：

S1、制备Fe3O4纳米磁性微球：采可溶性三价铁离子盐为原料，溶在乙二醇溶液中，于150～300℃下进行溶剂热反应，制备Fe3O4纳米磁性微球；

S2、二氧化硅磁性微球的制备：将步骤S1制得的Fe3O4纳米磁性微球，采用正硅酸四乙酯在氨水的参与下合成核壳式二氧化硅磁性微球；

S3、磁性微球的氨基化：将步骤S2制得的二氧化硅磁性微球以3-氨丙基三乙氧基硅烷为硅烷偶联剂在40-70℃乙醇-水体系下反应修饰氨基；

S4、羧基磁珠制备：氨基磁性微球在N，N-二甲基酰胺溶剂中与双羧基化合物丁二酸酐反应修饰羧基，修饰后的羧基微球在乙酸酐乙腈溶液中反应以封闭掉未反应的氨基，即得到羧基磁珠。

进一步地，所述的步骤S1具体为：将可溶性三价铁离子盐及乙酸钠加入到乙二醇溶液中，搅拌均匀；然后将该混合溶液倒入密闭容器中，在150～300℃条件下反应4-24h；冷却后通过磁场分离，将所得的产物洗净，制得Fe3O4纳米磁性微球。

进一步地，所述的步骤S2具体为：将步骤S 1制得的Fe3O4纳米磁性微球分散于乙醇、蒸馏水、浓氨水的混合溶液中；在搅拌状态下向反应液中逐滴加入正硅酸四乙酯，10-30℃条件下反应4-24h；对产物进行磁性分离，将所得的产物洗净。

进一步地，所述的步骤S3具体为：将步骤S2制得的二氧化硅磁性微球分散于乙醇、水体系中；加入3-氨丙基三乙氧基硅烷；40-70℃水浴机械搅拌反应4-24h；冷却后通过磁场分离，将所得的产物洗净，制得表面修饰氨基的氨基化磁性微球。

进一步地，所述的步骤S4具体为：将步骤S3制得的氨基化磁性微球分散到N，N-二甲基酰胺中，加入丁二酸酐；40-70℃水浴机械搅拌反应4-24h；冷却后通过磁场分离，将所得的产物用乙醇洗净，分散到乙腈、乙酸酐体系中10-30℃条件下反应3-6h，封闭掉未反应的氨基；对产物进行磁性分离，将所得的产物洗净，即得到羧基磁珠。修饰后的羧基微球在乙酸酐乙腈溶液中反应以封闭掉未反应的氨基。在后期免疫磁珠的制备中能更好的把控磁珠的活化率和偶联率，降低磁珠交联的风险，保证磁珠交联的批次稳定性。

进一步地，还包括：步骤S5、对制备好的羧基磁珠进行筛选，不同磁场条件下对制备好的羧基磁珠进行筛选，以筛选出更适用于化学发光免疫分析使用的磁场响应均一的羧基磁珠；其实现步骤为：

S51、将制备所得的羧基磁珠在高磁场的磁板上进行沉降5-10min，去除掉悬浊液中磁吸附较弱的磁珠；

S52、将S51中沉降所得的磁珠重新悬浮后在弱磁场的磁板上进行沉降5-10min，去除掉沉淀中磁吸附较强的磁珠。

用于化学发光免疫分析试剂的羧基磁珠对磁珠粒径的大小，磁珠粒径的均匀度，磁场响应性，分散性，表面羧基的含量都有更高的要求。本发明以可溶性三价铁离子盐为原料，溶在乙二醇溶液中，于150～300℃下进行溶剂热反应，形成具有超顺磁性的Fe₃O₄纳米磁性微球。采用正硅酸四乙酯在氨水的参与下合成核壳式二氧化硅磁性微球。以3-氨丙基三乙氧基硅烷(KH-550)为硅烷偶联剂，在40-70℃乙醇-水体系下反应修饰氨基。氨基磁性微球在40-70℃DMF溶剂中与双羧基化合物(丁二酸酐)反应修饰羧基。修饰后的羧基微球在乙酸酐乙腈溶液中反应以封闭掉未反应的氨基。最终所得的羧基磁珠在不同磁场条件条件下进行磁珠磁场响应性的筛选以获得磁珠粒径的均匀、磁场响应性均一、分散性好满足磁微粒化学发光免疫分析试剂使用要求的优质羧基磁珠。该方法原料价廉易得、设备简单、易于实现控制、工艺重复性好、产品质量稳定、操作安全可靠、方便大批量生产。本方法制备的羧基磁珠在活性物质(抗体、蛋白、链霉亲和素等)包被后应用于磁微粒化学发光免疫分析试剂，测试结果重复性好，准确度高。

本发明所达到的有益效果是：

(1)本发明合成过程中采用高温水热反应制备，制备步骤相对简单，减少洗涤以及反应过程中微球的损失，制备的微球粒径均匀，球形规整，尺寸均一，磁性分布均一，磁场响应性均一。

(2)本发明磁性微球的羧基修饰后采用乙腈、乙酸酐体系对未反应的氨基进行封闭，保证了磁微粒本身的活性基团只有羧基基团一种，使化学发光免疫检测应用的免疫磁珠的制备能更好的把控磁珠的活化率和偶联率，降低磁珠自身交联的风险，为磁珠交联的批次稳定性提供了保证。

(3)本发明在不同磁场条件下对制备好的羧基磁球进行磁场响应性的筛选，保证了制备所得的羧基磁珠有更一致的磁场响应性，从而保证了化学发光免疫分析试剂中测试数值的一致性和更好的重复性，也大大降低了由于少量磁微粒自身团聚造成的非特异性反应。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是羧基磁性微球放大图；

图2是羧基磁性微球交联抗体后有磁场沉降结果图；

图3是羧基磁性微球交联抗体后无磁场沉降结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

一、磁微粒化学发光免疫分析试剂用羧基磁珠的制备方法，其包括以下步骤：

(1)配制金属离子溶液150ml，(FeCl3·6H2O)和醋酸钠(NaAc)以1:8的摩尔比混合成金属离子溶液其中铁离子的浓度为0.01mol/L，机械搅拌至完全溶解；

(2)于150～300℃下进行溶剂热反应4-24h；

(3)用乙醇和水分别清洗磁性微球3次；

(4)60℃烘干4h得具有超顺磁性四氧化三铁磁性微球1.1g，磁性微球的粒径为300-500nm；

(5)将制备所得的超顺磁性四氧化三铁磁性微球取0.9g于0.1M的HCL中超声分散30-60min；

(6)将分散好的磁性微球用纯净水反复洗涤至中性；

(7)洗涤好的磁性微球分散于480ml由乙醇，蒸馏水，氨水(体积比为80：20：1)组成的混合溶液中；

(8)向上述溶液中加入0.81g正硅酸四乙酯(四氧化三铁与正硅酸四乙酯的摩尔比为10：3)10-30℃机械搅拌反应4-24h；

(9)用乙醇和水分别清洗磁性磁性微球3次；

(10)将制备所得的二氧化硅包覆的微球分散于乙醇、水体系中；逐滴加入3ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)；

(11)40-70℃水浴机械搅拌反应4-24h；

(12)冷却后通过磁场分离，将所得的产物洗净，制得表面修饰氨基的氨基化磁性微球(氨基磁性微球)；

(13)将氨基磁性微球分散到N，N-二甲基酰胺(DMF)中，使其分散均匀；

(14)按照氨基磁性微球与丁二酸酐1:0.8的摩尔比加入丁二酸酐，40-70℃水浴机械搅拌反应4-24h；

(15)冷却后通过磁场分离，将所得的产物清洗干净；

(16)将制备所得的羧基微球分散到乙腈、乙酸酐体系中反应3-6h，封闭掉未反应的氨基。对产物进行磁性分离，将所得的产物洗净获得羧基磁性微球，如图1所示。

二、羧基磁性微球磁场响应性筛选包括以下步骤：

(1)将制备所得羧基磁性微球充分混匀后在高磁场(400-600mT)的磁板上进行沉降3-5min，弃除掉悬浊液中磁场响应性较弱的羧基磁性微球。

(2)将(1)中沉降所得的磁性微球重新悬浮后在弱磁场(100-150mT)的磁板上进行沉降2-3min，弃除掉沉淀中磁响应性较强的磁性微球。将悬浊液中的磁性微球单独清洗处理，40℃烘干4h后称量得到磁性微球的量。

三、将制备所得的磁场响应均一的羧基磁性微球采用EDC活化的方法与抗体交联，并使用封闭剂封闭掉未反应的基团。进行功能性测试，内容包括确定羧基微球的磁场响应性、测试重复性。其方法如下：

实验一：测试磁珠的磁场响应性的非磁场存在时的分散性，实验结果如图2和图3所示。

(1)用磁珠保存液将偶联后的磁珠(浓度20mg/ml)稀释为2mg/ml；

(2)用200ul的移液器分别取6份200ul 2mg/ml的磁珠加入到反应管中，300mT磁场强度下沉降，记录完全沉降时间。

(3)用200ul的移液器分别取6份200ul 2mg/ml的磁珠加入到反应管中，在无磁场条件下沉降，记录完全沉降时间。

实验二：在泌乳素(PRL)定量测定试剂盒(磁微粒化学发光法)的使用方法：

(1)使用泌乳素抗原(PRL)国际标准品(国际卫生组织WHO认证，英国国家生物制品检定所NIBSC生产，货号为98/580)稀释6个已知浓度：0，50，200，500，2000，5000uIU/ml，每点加入15μl；

(2)用碱性磷酸酶(ALP)标记的单克隆抗体作为指示剂，稀释到已知的工作浓度0.8ug/ml；

(3)用磁珠保存液将偶联后的磁珠(浓度20mg/ml)稀释为2mg/ml；

(4)在60ul酶标抗体溶液中加入30ul工作浓度为2mg/ml的磁珠，混匀后37℃温浴30分钟；

(5)在外加的磁场保护下，使用清洗浓缩液洗涤磁珠3次，每次300ul；

(6)加入200μl发光底物，用化学发光仪检测发光强度和0点进行20次重复测试确定测试的重复性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。