一种用于多种样品同步高通量加样系统的制作方法

本发明涉及一种加样系统，具体是关于一种用于多种样品同步高通量加样系统。

背景技术

在生命科学领域，随着分子生物学和测序技术的快速发展，高通量检测成为一个普遍的需求。在大量的研究中，研究人员需要对数以千万种的酶类、缓冲液、添加剂等液体试剂进行分配和转移操作。由于液体的体积越来越小，种类越来越多，且出现了一部分高黏度、难分配的液体试剂，这些均对微量液体的分配提出了更高的要求。

现阶段，大规模的实验高度依靠各色各样的机械化平台来实现自动且高通量的液体分配。虽然传统的384或者1536孔板配合机械手会获得较高的通量，但总存在其物理上的局限性。另外，这些昂贵的仪器会消耗较多的试剂，成本的大大增加使得许多实验室对其望而却步。显然，一种更高通量、更低成本的、低试剂消耗量的液体分配系统拥有很大的市场前景。

微加工技术可以加工出许多精细的微结构，这样做出的芯片体积小，可以大大节约试剂和成本。根据液体操控的方式不同，微流控平台可以被分为灌注流、液滴以及微阵列三种模式：

灌注流模式是一种建立在微流控芯片上的细胞筛选技术，该技术将一定浓度的试剂通入微流控管道形成的网络中，在连续的层流中进行受控扩散，在低雷诺数下，可以方便地形成浓度梯度。虽然灌注流模式的操作简便，但复杂的微流控管道系统大大限制了它的实际通量。液滴模式以油包水的乳胶液滴来实现高通量的分析，主要优点在于其无与伦比的高通量。然而，流动中的液体很难进行长时间的分析和进行多步操作的实验。相比于液滴模式，微阵列模式采用光刻的方式在二维的基板上制造数以千计的微柱或微岛，更容易进行长时间的观察、操控和分析。虽然微阵列芯片可以代替孔板技术，但是阵列体系下微小体积液体的操控则需要昂贵的机械设备。无论是接触式点样还是非接触式点样，随着液体的种类增多、用量增大，液体的分配时间会被大大延长。这是因为其中的分配部件大多需要被重复利用，因此在每次完成一种液体的分配之后，该部件需要被反复清洗，否则将有可能引入污染。通常来说，将1种液体分配到100个微柱上只需要几分钟时间，但将100种液体分配到100个微柱上则需要几个小时，其中大部分时间被用来进行清洗。对此，许多研究围绕着如何高通量地实现不同液体的同步分配而展开。这些方法在通量的提升上取得了一定的效果，但还是脱离不了精确且昂贵的机械设备的帮助。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种用于多种样品同步高通量加样系统，该加样系统能够将多种微量样品同步、高通量且精准地加入与之配套的芯片点阵中，过程中不会发生交叉污染。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种用于多种样品同步高通量加样系统，其特征在于，该加样系统包括：离心固定机构(1)，所述离心固定机构(1)上具有芯片槽；芯片(2)，所述芯片(2)定位和固定在所述离心固定机构(1)的芯片槽中；加样块(3)，所述加样块(3)上具有多个用于存储多种试剂的加样柱(5)，所述加样块(3)通过所述离心固定机构(1)定位和叠放在所述芯片(2)的正上方；加压机构(4)，所述加压机构(4)设置在所述加样块(3)上方，用于将压力均匀地施加在所述加样块(3)与芯片(2)的接触面上，保证二者在离心状态下完全贴紧。

在一个优选的实施例中，所述加压机构(4)包括：受压横梁(42)，所述受压横梁(42)支撑在所述离心固定机构(1)上；加压螺丝(41)，所述加压螺丝(41)螺纹旋接在所述受压横梁(42)上，并可沿所述受压横梁(42)上下移动；加压块(43)，所述加压块(43)连接在所述加压螺丝(42)的下端。

在一个优选的实施例中，所述受压横梁(42)呈拱形，所述受压横梁(42)的两下端分别一体设置有一倒t型滑块(44)；相应地，所述离心固定机构(1)呈u型，所述离心固定机构(1)的两上端分别开设有一与所述滑块(44)相配合的倒t型滑槽(11)，所述受压横梁(42)的所述滑块(44)能够滑进或滑出所述离心固定机构(1)的所述滑槽(11)，以使所述受压横梁(42)可拆卸地连接在所述离心固定机构(1)上。

在一个优选的实施例中，所述离心固定机构(1)的芯片槽内垫有缓冲板(6)，所述芯片(2)放置在所述缓冲板(6)上，所述缓冲板(6)采用具有支撑或者缓冲作用的材料制作而成。

在一个优选的实施例中，所述离心固定机构(1)一侧开设有用来观察所述芯片(2)是否对准以及加样完成情况的观察窗。

在一个优选的实施例中，所述加样块(3)上的所述加样柱(5)是任意个数、形状、大小和排布。

在一个优选的实施例中，所述加样块(3)上封有一层用来预防和减少试剂污染和蒸发的密封薄膜，所述密封薄膜为聚二甲基硅氧烷薄膜、橡胶薄膜、硅胶薄膜、封口膜或胶带。

在一个优选的实施例中，所述离心固定机构(1)采用金属制作而成，所述加样块(3)采用能够存储试剂的材料制作而成。

在一个优选的实施例中，当进行单细胞的快速分离时，所述加样块(3)采用敞口加样块，即在所述加样块(3)上方存在一个用于盛放细胞悬液的敞口，且各所述加样柱(5)呈镰刀状；同时，所述芯片(2)采用含有微坑结构的玻璃，所述芯片(2)上的微坑大小和分布与所述加样块(3)上的所述加样柱(5)一一对应。

在一个优选的实施例中，当进行药物实验时，所述加样块(3)采用凹槽加样块，即在所述加样块(3)顶部增设若干条垂直交叉的横梁和竖梁，从而在所述加样块(3)顶部形成若干个不完全导通的凹槽。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明的离心固定机构通过位置固定和压力固定保证加样块和芯片紧密贴合，防止离心情况下样本发生串扰或泄漏，离心过程中不会发生交叉污染。2、本发明通过对加样块的离心可以在几分钟内实现并行加样，将不同微柱内的液体同时分配到芯片上，大大缩短原来对每个微柱逐一分配液体所花费的时长。3、本发明可以实现高通量精准分配：根据所需分配的液体的种数选择不同微孔数目的加样块，或将液体加到加样块的部分加样柱中，即可高通量地完成精准加样；同时由于加样块各个微柱受到的离心力大致相同，因此离心到芯片上的液滴具有均一性。4、本发明适用于稀有样本的液体分配：由于每个加样柱只需加入数微升的液体，并可以多次使用，故每次分配到芯片上的液滴量极少，不会浪费稀有样本。5、本发明分配液滴的成本很低，无需借助昂贵的机械手，只需一台离心机即可完成液滴分配过程，具有使用的普适性、简易性和高稳定性的特点。综上所述，本发明适用于稀有样本的高通量精准分配，或是多种样品的同时定量分配，具有便捷、高效、高稳定性、低成本、可重复利用等优点。

附图说明

图1是本发明加样系统的结构示意图；

图2是利用本发明进行单细胞快速分离的整体工装图；

图3是本发明敞口加样块的结构示意图；

图4是利用本发明进行单细胞的快速分离后得到的单细胞图；

图5是本发明凹槽加样块的结构示意图；

图6是利用本发明进行doxorubicin对mcf-7细胞的药物实验结果图。

图中附图标记：

1为离心固定机构；11为滑槽；2为芯片；3为加样块；4为加压机构；41为加压螺丝；42为受压横梁；43为加压块；44为滑块；5为加样柱；6为缓冲板。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。

如图1所示，本发明提供的用于多种样品同步高通量加样系统包括离心固定机构1、芯片2、加样块3和加压机构4。离心固定机构1上具有与芯片2相配合的芯片槽，芯片2定位和固定在离心固定机构1的芯片槽中。加样块3上具有多个加样柱5，用于存储多种试剂。加样块3通过离心固定机构1定位和叠放在芯片2的正上方。加压机构4设置在加样块3上方，用于将压力均匀地施加在加样块3与芯片2的接触面上，保证二者在离心状态下完全贴紧。

在一个优选的实施例中，加压机构4包括加压螺丝41、受压横梁42和加压块43，受压横梁42支撑在离心固定机构1上，加压螺丝41螺纹旋接在受压横梁42上，并可沿受压横梁42上下移动，加压块43连接在加压螺丝42的下端。

在一个优选的实施例中，受压横梁42呈拱形，受压横梁42的两下端分别一体设置有一倒t型滑块44；相应地，离心固定机构1呈u型，离心固定机构1的两上端分别开设有一与滑块44相配合的倒t型滑槽11，这样受压横梁42的滑块44既可以从一侧插入离心固定机构1的滑槽11内，也可以将受压横梁42的滑块44从离心固定机构1的滑槽11内滑出，从而使受压横梁42可拆卸地连接在离心固定机构1上。

在一个优选的实施例中，离心固定机构1的芯片槽内垫有缓冲板6，芯片2放置在缓冲板6上，以防止压力将芯片2压碎。缓冲板6采用具有支撑或者缓冲作用的材料制作而成，优选有机玻璃。

在一个优选的实施例中，离心固定机构1一侧开设有观察窗，用来观察芯片2是否对准以及加样完成情况，观察窗可以是任意满足观察的大小和形状。

在一个优选的实施例中，加样块3上的加样柱5可以是任意个数、形状、大小和排布，加样柱5优选圆柱形的通孔，以阵列形式排列。

在一个优选的实施例中，加样块3上封有一层密封薄膜，用来预防和减少试剂污染和蒸发，密封薄膜优选为pdms(聚二甲基硅氧烷)薄膜、橡胶薄膜、硅胶薄膜、封口膜或胶带等。

在一个优选的实施例中，离心固定机构1采用金属制作而成，优选铝材料。

在一个优选的实施例中，加样块3采用能够存储试剂的材料制作而成，优选pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)。

下面通过三个应用实例具体说明本发明的效果。

1、单细胞的快速分离

如图2、图3所示，当进行单细胞的快速分离时，加样块3采用敞口加样块，即在加样块3上方存在一个用于盛放细胞悬液的敞口，且各加样柱5之间不是平的，而是呈镰刀状，这样确保敞口处不存在“死体积”，使得单细胞不会残存在敞口部分，保证了单细胞的完全转移。同时，芯片2采用含有微坑结构的玻璃，芯片2上的微坑大小和分布与加样块3上的加样柱5一一对应，其具体操作流程如下：

1)将带有微坑的芯片2放入离心固定机构1的芯片槽中，由于芯片2和芯片槽在尺寸上已经确定，故可保证芯片2上的所有微坑与加样块2上的所有加样柱5一一对准；

2)将处理过后的敞口加样块3放入离心固定机构1中，并将稀释成一定浓度的细胞悬液载入加样块3的敞口部分；

3)旋紧加压螺丝41使加压块43盖住加样块3敞口部分，实现液体的封闭，并使得加压块43、加样块3、芯片2与离心固定机构1紧密贴合，至此完成加样系统的组装；

4)将组装完毕后的加样系统放入离心机内，配平并设置特定的离心转速和时间，进行离心；

5)离心完毕后旋松加压螺丝41，依次取下加压块43和加样块3，取出芯片2，即可得到一张含有单细胞阵列的高通量芯片。图4为芯片2中的一个微坑，其中的小圆球既分离得到的单细胞。

2、药物实验

如图5所示，当进行药物实验时，加样块3采用凹槽加样块，即在加样块3顶部增设若干条垂直交叉的横梁和竖梁，从而在加样块3顶部形成若干个不完全导通的凹槽，该设计使得手动加样十分简便快捷，液体加入凹槽后在离心过程中，先进入加样柱5，再经过加样柱5离心到芯片2的对应点；同时，凹槽结构可以一次性完成重复试剂的添加，大大减小了实验人员的操作负担，其具体操作流程如下：

1)对加样块3的上下表面进行疏水处理，保证各加样柱5之间附有一层疏水材料；

2)使用枪头间可变间距的移液装置从384孔板中将不同浓度的药物等体积地加入加样块3的对应加样柱5，由于加样柱5具有较强的毛细作用力，且加样块3的上下表面都是超疏水的，因此注入的液体不会流动出来；

3)旋紧加压螺丝41使加压块43、加样块3、芯片2与离心固定机构1紧密贴合，至此完成加样系统的组装；

4)将组装完毕后的加样系统放入离心机内，配平并设置特定的离心转速和时间，进行离心；

5)离心完毕后旋松加压螺丝41，依次取下加压块43和加样块3，取出芯片2，即可得到一张具有药物浓度梯度的载药芯片。将该载药芯片与对应的细胞芯片进行显微下的对准，即可实现药物的定点定浓度添加。

从图6中可以看到，当没有药物处理时，微坑中细胞的存活率达到93％以上；当doxorubicin浓度从0.2μm增加至2μm、5μm以及9μm时，细胞的存活率从92.6％降低至84.9％、46.6％、30.4％，符合预期。

3、芯片的定点修饰

本发明还可以高效实现单张芯片不同位点的差异化修饰，只需将上述药物实验中的药物换成不同的修饰试剂，重复上述操作即可。在离心的过程中修饰试剂与芯片的对应点发生特定的化学反应，即可实现芯片的定点修饰。这样的修饰方法简便高效，可以在很短时间内得到大量的具有不同修饰的芯片。

上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。