璃微球上：
[0046] ①在活化的微球中加入适量的2. 5 %的戊二醛，然后用醋酸调节pH到4,室温浸泡 2. 5h ;用无菌水洗涤2~3次，除去未反应完得戊二醛，吸干水分；
[0047] ②用pH8. 0,0. 05M的碳酸盐缓冲液将醛基化的玻璃珠润洗3次；将⑶4、CXCR-4、 CCR-5和gpl20抗体的混合物和玻璃微球一起加入pH8. 0,0. 05M的碳酸盐缓冲液，37°C，摇 床上低速振荡3h，得到结合了配基的病毒吸附微球溶液。
[0048] 4)向病毒吸附微球溶液中添加氨基酸混合物，混合物为氨基酸为组氨酸：甘氨 酸：赖氨酸=1:6:0. 4,氨基酸添加重量与配基的重量比为1 :100,于恒温37°C水浴箱上静 置30分钟，再于恒温37°C水浴箱上微震荡下PBS (0.0 lM pH 8. 0)洗3次，洗去多余的氨基 酸，得到艾滋病毒亲和吸附剂3,然后室温晾干、备用。
[0049] 实施例4
[0050] 艾滋病毒亲和吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
[0051] 1)制备艾滋病毒亲和配基及作为载体的玻璃微球；
[0052] ①配基为：CD4、CXCR-4、CCR-5和gpl20抗体的1: 1: 1:1的混合物；
[0053] 上述配基如何制备为已公开的现有技术，本申请中不做赘述。
[0054] 2)活化壳聚糖微球表面基团：称取IOg壳聚糖交联微球于灭菌的烧杯中，加入 20mL -定浓度的环氧氯丙烷，用IM NaOH溶液调节溶剂pH 8~9,然后在一定的温度、转速 SOrpm下、反应相应的时间进行活化，活化结束后，除去未反应完的环氧氯丙烷，然后用丙 酮、乙醇、洗去残存的环氧氯丙烷，再用大量蒸馏水淋洗微球，抽干，得到壳聚糖活化微球。
[0055] 3)将配基通过化学交联的方法连接到上壳聚糖微球上：
[0056] 将含有⑶4、CXCR-4、CCR-5和gpl20抗体的溶液滴加到环氧活化后的壳聚糖微球 中，于37°C低速振荡反应4h。反应结束后，用0.0 lM pH7. 2~7. 4的磷酸盐缓冲液洗去未 反应完的配基，吸干水分，得到结合了配基的病毒吸附微球溶液。
[0057] 4)向病毒吸附微球溶液中添加氨基酸混合物，混合物为缬氨酸：组氨酸=1:2. 3， 氨基酸添加重量与配基的重量比为1 :1〇〇,于恒温37°C水浴箱上静置30分钟，再于恒温 37°C水浴箱上微震荡下PBS (0.0 lM pH 8.0)洗3次，洗去多余的氨基酸，得到艾滋病毒亲和 吸附剂4,然后室温晾干、备用。
[0058] 实施例5
[0059] 艾滋病毒亲和吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
[0060] 1)制备艾滋病毒亲和配基及作为载体的玻璃微球；
[0061] ①配基为：CD4、CXCR-4、CCR-5和gpl20抗体的1: 1: 1:1的混合物；
[0062] 上述配基如何制备为已公开的现有技术，本申请中不做赘述。
[0063] 2)活化琼脂糖微球表面基团：在2L的反应器中加入琼脂糖微球溶液600ml，2mol/ L的NaOH水溶液400ml，混匀，加入乙二醇双缩水甘油醚400ml后，置于恒温摇床中，在37°C 反应1小时。结束反应，将琼脂糖微球过滤，用大量蒸馏水冲洗至pH = 7,将活化好的凝胶 状琼脂糖微球储存在4°C备用。
[0064] 3)将配基通过化学交联的方法连接到上琼脂糖微球上：
[0065] 将琼脂糖微球凝胶200ml加入至0· 3mol/L的硼酸缓冲液600ml中，pH值控制在 8. 0~10. 0范围内，加入含有CD4、CXCR-4、CCR-5和gpl20抗体的溶液，在37°C反应12小 时，停止，洗去未反应完的配基，得到结合了配基的病毒吸附微球溶液。
[0066] 4)向病毒吸附微球溶液中添加苏氨酸和异亮氨酸的混合物，混合物为苏氨酸：异 亮氨酸：蛋氨酸=1:1:1，氨基酸添加重量与配基的重量比为3 :1000,静置2h，再用蒸馏水 冲洗，洗去多余的氨基酸，得到艾滋病毒亲和吸附剂5,保存在0. 2mol/L pH = 7. 4的磷酸缓 冲液中。
[0067] 对照例（未用氨基酸封闭）
[0068] 艾滋病毒亲和吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
[0069] 1)制备艾滋病毒亲和配基及作为载体的玻璃微球；
[0070] ①配基为：CD4、CXCR-4、CCR-5和gpl20抗体的1: 1: 1:1的混合物；
[0071] 上述配基如何制备为已公开的现有技术，本申请中不做赘述。
[0072] ②玻璃微球表面预处理：用65 %浓硝酸煮洗平均直径85 μ m玻璃微球10分钟，再 用蒸馏水洗（去离子水洗3次，蒸馏水洗2次，每次2分钟），放入37°C烘箱烘干。
[0073] 2)活化玻璃微球表面基团：取双蒸水、丙酮（分析纯）、硅烷化偶联剂（γ -氨基丙 基三乙氧基硅烷（APTES)按体积比15:280:6的比例配制成APTES活化溶液，再将玻璃微球 浸入其中2小时；用丙酮洗涤玻片5次（5min/次），再将微球表面烘干；
[0074] 3)将配基通过化学交联的方法连接到上玻璃微球上：
[0075] ①在活化的微球中加入适量的2. 5 %的戊二醛，然后用醋酸调节pH到4,室温浸泡 2. 5h ;用无菌水洗涤2~3次，除去未反应完得戊二醛，吸干水分；
[0076] ②用pH8. 0,0. 05M的碳酸盐缓冲液将醛基化的玻璃珠润洗3次；将⑶4、CXCR-4、 CCR-5和gpl20抗体的混合物和玻璃微球一起加入pH8. 0,0. 05M的碳酸盐缓冲液，37°C，摇 床上低速振荡3h，再将玻璃微球重置于5 μ g/ml牛血清白蛋白溶液中，室温孵育2h，轻轻振 荡混匀。结束后，分别用用PBS洗涤3次，得到艾滋病毒亲和吸附剂DNA (对照），然后室温 晾干、备用。
[0077] 试验例
[0078] 取上述实施例中得到的艾滋病毒亲和吸附剂1~6以及对照例，添加至生理盐水 中，然后置于恒温37°C水浴箱上，轻微震荡，分别于0. 511、111、211、411、811、1211、2411，检测其上 抗体蛋白或单链DNA分子的脱落情况，脱落的抗体蛋白和DNA均采用紫外法检测，然后将未 脱落的抗体蛋白或单链DNA分子重量和吸附剂上的原有结合的量进行对比，结果如下：
【主权项】
1. 一种艾滋病毒亲和吸附剂的制备方法，包括以下步骤： 1) 准备与艾滋病毒亲和的配基，及作为载体的微球； 2) 活化微球表面基团； 3) 利用交联剂使所述配基结合在微球上，得到病毒吸附微球； 4) 在溶液环境下，向病毒吸附微球中添加氨基酸，氨基酸添加重量与配基的重量比大 于2. 5 :1000,待氨基酸结合到病毒吸附微球上后，洗去多余的氨基酸，得到艾滋病毒亲和 吸附剂。
2. 根据权利要求1所述艾滋病毒亲和吸附剂的制备方法，其特征在于：所述氨基酸选 自赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、甘氨酸中 一种或几种的混合。
3. 根据权利要求1所述艾滋病毒亲和吸附剂的制备方法，其特征在于：所述配基为 ⑶4、CXCR-4、CCR-5和gpl20抗体的1: 1: 1:1的混合物，所述微球为玻璃微球，所述氨基酸 为组氨酸：甘氨酸：赖氨酸=1:6:0. 4的混合物。
4. 根据权利要求1或2或3所述艾滋病毒亲和吸附剂的制备方法，其特征在于：所述 步骤4)中，向病毒吸附微球中添加氨基酸后，使氨基酸结合到病毒吸附微球上的条件为， 于25~40°C的环境中，静置含有病毒吸附微球与氨基酸的溶液30分钟以上。
5. 根据权利要求1或2或3所述艾滋病毒亲和吸附剂的制备方法，其特征在于：所述 步骤4)中，洗去多余的氨基酸所采用的洗涤液为PBS。
【专利摘要】本发明公开了一种艾滋病毒亲和吸附剂的制备方法，该方法利用氨基酸处理已连接了配基的病毒吸附微球，使其上的配基结合更牢固，降低了艾滋病毒亲和吸附剂脱落的几率和速率，提高了艾滋病毒亲和吸附剂在应用时的安全性。
【IPC分类】B01J20-28, B01J20-30, B01J20-22
【公开号】CN104801278
【申请号】CN201510167619
【发明人】王业富, 韩振伟, 李卫, 刘婧
【申请人】武汉瑞法医疗器械有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年3月29日