一种检测金黄色葡萄球菌的dna传感器及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种检测金黄色葡萄球菌的DNA传感器及其制备与应用，属于致病菌 快速检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在，空气、水体、灰尘及人和动物的排泄物中都 可W找到。金黄色葡萄球菌是一种重要的致病微生物，它能产生较多的毒素和酶等毒力因 子，且毒力强，由金黄色葡萄球菌感染可引起多种疾病，包括食物中毒、假膜性肠炎、烫伤皮 肤综合症、毒素休克综合症、化脈性炎症和败血症等，给人类造成了极大的威胁和损失，引 起了人们的广泛关注。近年来，美国疾病控制中屯、报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第 二位，仅次于大肠杆菌，金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性的卫生难题，在美国由金黄色葡 萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大达45%，我国每年 发生的此类中毒事件也非常多。
[0003] 目前，金黄色葡萄球菌的检测方法大致包括传统的细菌培养方法及生化鉴定、免 疫学方法、巧光定量PCR法、巧光原位杂交法（FISH,Fluorescent in Situ hybridization) W及基因巧片法等，该些检测方法均有各自的优势但同时也存在不同层次上的不足，比如 FI甜法能够直接运用到复杂样品的检测中，且无需提取样品的DNA，直接保留了样品DNA的 完整性；但样品中某些菌体本身的自体巧光，巧光探针信号的衰减，固定的微生物细胞过少 等因素均可能导致实验产生假阴性结果；基因巧片法是近年来迅速发展起来的核酸检测技 术，其快速、方便简单等优势成为该技术的亮点，但由于该技术需要昂贵的先进检测设备和 运行成本，使其难W推广应用。
【发明内容】
[0004] 针对W上问题，本发明提供了一种电化学碳纳米管/金纳米粒子复合膜DNA传感 器，利用碳纳米管具有增强电化学电子传递速率，降低阻抗的功能，金纳米粒子具有生物固 定的作用，制备电化学DNA传感器，可有效提高检测的灵敏度。本发明通过合成金黄色葡萄 球菌特异性基因序列作为探针ssDNA，与互补目标ssDNA片段形成杂交体系，W亚甲基藍作 为杂交指示剂的的检测技术，初步建立了对金黄色葡萄球菌检测的一种通用性好、高灵敏 度和精确度的检验方法及其检测条件。
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种DNA生物传感器。
[0006] 所述DNA生物传感器的制备方法；是将含壳聚糖的碳纳米管、纳米金依次修饰到 清洁的金电极表面，然后将含琉基的探针ssDNA滴加到修饰后的电极上，解育，再用6-琉基 己醇封闭，即制得基于电化学碳纳米管/金纳米粒子自组装DNA传感器。
[0007] 所述探针ssDNA，在本发明的一种实施方式中，其序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。 该序列是金黄色葡萄球菌的特异性基因序列，使用该序列制备的DNA传感器对金黄色葡萄 球菌的检测具有通用性好、高灵敏度和精确度的优点。
[000引所述方法，在本发明的一种实施方式中，是；（1)碳纳米管修饰金电极：将4~ 6 y L的每mL含有0. 5~2mg碳纳米管的碳纳米管溶液滴加到清洁的2mm金电极表面，解育 30~40min ; (2)纳米金修饰金电极；将氯金酸溶于硝酸钟溶液中，配制成纳米金溶液，将上 一步得到的碳纳米管修饰金电极浸入纳米金溶液中进行电锻沉积，即制备得到修饰好的电 极；（3)探针ssDNA滴加；将4~6 y L的探针ssDNA滴加到修饰好的电极表面，解育30~ 40min ; (4)封闭；滴加6~8 y L浓度为0. 5~2mM的6-琉基己醇，解育40-60min，即得到 自组装电化学DNA传感器。
[0009] 所述清洁的金电极，是指经如下处理的金电极：将金电极（〇= 2mm)置于 Piranha溶液中浸泡15min，依次用0. 3 ]im，0. 05 ym的AI2O3抛光粉将电极表面抛成镜面， 再用1 ;1(体积比）的硝酸、无水己醇、超纯水超声清洗5min，氮气吹干，4°C备用。
[0010] 所述电锻沉积，在本发明的一种实施方式中，是采用控制电位电解库伦法进行电 锻沉积，具体条件；电解电位为-0. 2V，电解时间为300s。
[0011] 所述解育，在本发明的一种实施方式中，是在35~40°C下进行。
[0012] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，是（1)将5mg碳纳米管溶于5mL 1 %的壳 聚糖中，超声分散化，得到碳纳米管溶液，滴加加1到抛光的金电极表面，37°C解育30min， 得到碳纳米管修饰的金电极；（2)将1% (v/v)的氯金酸溶于0.1M的硝酸钟中，配制成氯金 酸浓度为3. 3mM的纳米金溶液，将解育好碳纳米管修饰的金电极浸入纳米金溶液，并控制 电位电解库伦法进行电锻沉积，电解电位为-0. 2V，电解时间为300s，制得纳米材料修饰的 金电极；0)滴加1. 〇x1〇-6M的探针ssDNA，37°C下解育30min ; (4)然后滴加8ul浓度为ImM 的6-琉基己醇，在室温下解育50min封闭，即制备得到自组装电化学DM传感器。放入4°C 冰箱待用。
[001引本发明还提供一种所述DNA生物传感器的应用方法，包括W下步骤；（1)滴加不同 浓度的互补ssDNA到制备好的传感器上，解育、清洗，然后用亚甲基藍溶液浸泡，再采用微 分脉冲伏安法值PV)测定还原电流变化，得到不同浓度的互补ssDNA与电流值变化大小的 标准曲线；似将待测样品滴加到制备好的传感器上，解育、清洗，然后用亚甲基藍溶液浸 泡，再测定电流值变化大小，根据上一步得到的标准曲线计算样品中目标ssDNA的浓度。该 方法可W确定待测样品中目标ssDNA有无及质量。
[0014] 所述步骤2中的待测样品，可W是将待测食品或其他材料加水震荡得到细胞悬 液，然后提取菌体的DNA，直接WDNA样品作为待测样品，或者进行PCR后将扩增产物作为待 检样品。PCR扩增的片段比DNA片段小，相对来说特异性更好。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，PCR所用引物如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示，用 于扩增金黄色葡萄球菌，扩增产物中包含与探针ssDNA互补的片段。
[0016] 所述亚甲基藍溶液浸泡，在本发明的一种实施方式中，具体是在1. 0xl(T5~ 7x1〇-5M浓度的亚甲基藍溶液中浸泡2min~16min，然后清洗氮气吹干。
[0017] 所述应用方法中，在本发明的一种实施方式中，标准曲线是；取出制备好的DNA传 感器，依次滴加5 y L不同浓度的互补ssDNA，37°C下解育30min杂交后，在亚甲基藍溶液中 浸泡12min，清洗氮气吹干，在PBS中采用微分脉冲伏安法考察还原电流的变化，W此作为 检测结果。可W用于金黄色葡萄球菌检测的标准曲线制作。
[0018] 所述互补ssDNA浓度，在本发明的一种实施方式中，为1.0xl〇-is~1.0x10-9M时， 所呈现的线性比例最好，若溶液浓度过高或过低都会是线性偏离，造成检测结果出现误差。
[0019] 所述亚甲基藍溶液中浸泡，在本发明的一种实施方式中，是使用5. 0X1(T5M的亚 甲基藍溶液浸泡12min。
[0020] 所述标准曲线，在本发明的一种实施方式中，为AI(yA) = 11. 72381og[c/ (M) ]+215. 9663,相关系数分别为R2= 0. 9945,最低检测限为3. 3X 10 -i6mol/L。
[0021] 所述DM传感器的应用，在本发明的一种实施方式中，是制备待测样品的细胞悬 浮液，然后在修饰好的DNA传感器表面上滴加细胞悬浮液，培养解育，W达到细胞固定的目 的，然后在5. 0X 1(T5M亚甲基藍溶液中浸泡12min，在PBS中DPV扫描得出结果。
[002引所述DPV扫描中，扫描溶液PBS的抑=7. 4,浓度为0. 01M，扫描电压范围-0. 7~ 0. 2V0
[002引所述应用，在本发明的一种实施方式中，包括：取出已修饰完成的DNA传感电极， 采用循环伏安法和交流阻抗法在2. 5mM的铁氯化钟溶液中考察工作电极界面的变化，并对 电极表进行表征。
[0024] 本发明的方法具有下述有益效果：
[0025] (1)电化学碳纳米管/金纳米粒子复合膜结构改善了纳米金离子的分散性，有效 的阻止了金的聚合，从而使其分散的更为均匀。通过控制电位电解库伦法进行电锻沉积，使 氯金酸在电极表面被还原成一粒粒的金颗粒，分散地铺在电极上，从而使传感器表面铺满 金颗粒，有助于探针均匀地吸附在电极表面。
[0026] (2)碳纳米管具有降低阻抗的功能，从而增强电化学电子传递速率。电化学碳 纳米管/金纳米粒子复合膜结构有效的促进了电子的转移，进而有效的提高材料本身 的传导性，大大降低了检测限。用于金黄色葡萄球菌检测，对互补ssDNA浓度检测限为 3. 3Xl〇-i6m〇l/L。
[0027] (3)自组装DM传感器能够结合多种材料的优点，充分发挥DM杂交、指示剂亚甲 基藍传感的灵敏性，极大的降低检测限。亚甲基藍（MB)是具有芳香杂环结构的化合物，它 可W嵌插在DNA双链中，并在-0. 25V的电位下出现还原峰，却不能与单链DNA很好的结合， 因此可W选择性地识别单、双链DNA。
[002引 （4)自组装DNA传感器用于检测金黄色葡萄球菌，具有通用性好、检测快、高灵敏 度和重现性好的优点。
【附图说明】
[0029] 图1表示纳米金在电极表面上的透射电镜图；
[0030] 图2表示循环伏安法和交流阻抗法分析表征图；其中a ;裸金电极；b ;碳纳米管/ 金电极；C ;纳米金/碳纳米管/金电极；d ;探针/纳米金/碳纳米管/金电极；e ;6-琉基 己醇/探针/纳米金/碳纳米管/金电极；f ;目标DNA/6-琉基己醇/探针/纳米金/碳纳 米管/金电极；
[0031] 图3表示不同亚甲基藍浓度和浸泡时间的优化图，其中A图为浓度，B图为时间； [003引图4表示不同浓度互补ssDNA标准品的电流值标准曲线；
[0033] 图5表示传感器的特异性，其中a ;完全不互补序列；b 碱基不互补序列；C ;单 碱基不互补序列；d ;目标互补序列；
[0034] 图6表示梯度稀释的金黄色葡萄球菌的SDS-PAGE凝胶电泳图与电化学DM传感 器图，其中a~f即浓度为1〇6~10 iCFU ml/i的金黄色葡萄球菌。
【具体实施方式】
[0035] 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举W下实施例详细说明，其目的仅 在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
[0036] 实施例1DNA传感器的制备方法
[0037] 将5mg碳纳米管溶于5mL 1%的壳聚糖中，超声分散化，得到0.001(m/v)浓度的 碳纳米管溶液，滴加5 y L到清洁的金电极表面，37°C解育30min，将1 % (