专利名称：使用解旋酶测定多核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定多核苷酸序列的方法。
背景技术：
人们对多核苷酸的序列测定有相当大的兴趣。可在WO-A-99/05315中找到一种有效的序列测定方法的简概及描述。
发明概述本发明基于测定电磁辐射可用来检测解旋酶和/或者引发酶的构象和/或者质量变化，当解旋酶和/或者引发酶利用NTP水解产生的能量，将双链DNA(dsDNA)解旋为单链DNA(ssDNA)时，这些蛋白质内可发生构象和/或者质量变化。
根据本发明，测定多核苷酸序列的方法包括以下步骤(i)在适于解旋酶活性的条件下，将靶多核苷酸与解旋酶/引发酶、NTP源反应(即利用NTP水解产生的能量使DNA解旋)；以及(ii)通过测定辐射，检测经解旋酶的作用特定碱基或者碱基对的分离和/或者邻近。
使用解旋酶来测定多核苷酸序列为本方法的成功提供了一些有利条件。首先，减少了多核苷酸分子内存在的二级结构问题，因为解旋酶在其天然环境下，遇到并排除这些结构。其次，解旋酶可在室温下，直接测定双链DNA的序列。解旋酶的这种能力提供了可简化靶多核苷酸操作的有利条件，并提供了对长多核苷酸摸板测序的可能性。
通过使用一些技术，可将辐射应用于样本。这些技术包括表面敏感检测技术(其中例如将解旋酶与固相支持物结合)，在固相光学表面上光反应的变化用于指示表面上的结合相互作用。在本发明的一个优选的实施方案中，所用技术为损耗波光谱学，特别是表面胞质共振(surfaceplasmon resonance，SPR)波谱学。
发明描述在本发明的一个实施方案中，解旋酶获得的以NTP方式提供的能量是在严格控制之下的。就是说解旋酶沿着被测序之DNA链的移动是通过直接控制其结合位点区解旋酶分子可获得的能源分子的浓度而调节的。这样使得酶活性可调节，以促进对辐射的测定，从而识别解旋酶或者解旋酶复合体邻近区的一个碱基或者碱基对。
另外，由于解旋酶构象的变化可使它进行水解反应和/或沿着多核苷酸移动，可通过控制解旋酶经历构象变化的能力，完成对DNA解旋和测序进展的控制。通过设计(使用当今技术水平的基因操作技术)解旋酶，使该分子含有可使该分子将辐射转变或者转换为构象变化的化学/部分基团，可以实现上述目的。以可确保每一个核苷酸检出的方式对解旋酶活性进行选择性控制。因此本方法是在实时基础上进行的，以获得快速的序列分析。以同样的名称，在同一天提交的共同未决的PCT申请描述了控制的优选方法，其中内容在此处引用作为参考。
本方法测定多核苷酸序列时，涉及到对解旋酶与靶多核苷酸之间构象/动力学相互作用的分析。通过监测如果反应进行时电磁或者其它辐射的改变或吸收来测定构象/动力学的相互作用。
此处用到的术语“多核苷酸”可以广义解释，包括DNA与RNA，还包括经修饰的DNA与RNA，以及其它的杂合核酸样分子，例如肽核酸(PNA)。
此处用到的术语“解旋酶”可以广义解释，它从属于使用或者不使用来自NTP水解的能量将双链多核苷酸解旋为单链多核苷酸的遍在蛋白质(Dean等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(1992)26714129-14137；Bramhill等人，细胞(Cell)(1988)54915-918；Schions等人，细胞(1988)52385-395)。
二十多年前，发现了第一个解旋酶并对其进行了分类(Abdel-Monem等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)(1976)65411-449 & 65；431-440)。来自原核、真核和病毒系统的新解旋酶不断被发现，并对其特征进行了描述。所有这些分子体系均在本发明的范围之内。
本发明使用的解旋酶可为任何已知类型的解旋酶。可以是任何DNA依赖的DNA解旋酶，例如大肠杆菌(E.coli)DnaB解旋酶(Xiong等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)(1996)2597-14)。如果靶多核苷酸是RNA分子，那么解旋酶可以是RNA依赖的解旋酶或者是可以对两种形式的多核苷酸作用的解旋酶。也可以用消化酶，例如外切酶或者拓扑异构酶。
在本发明的一个优选的实施方案中，解旋酶为噬菌体T7 gp4解旋酶(Egelman等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，(1995)923869-3873)。在本发明的一个更优选的实施方案中，解旋酶或者为大肠杆菌RuvB解旋酶(Stasiak等人，美国国家科学院院报，(1994)917618-7622)、大肠杆菌DnaB解旋酶(Xiong等人，分子生物学杂志(1996)2597-14)，或者为猿病毒40大T解旋酶(Dean等人，生物化学杂志(1992)26714129-14137)。
至今为止表征的大量解旋酶在其活性形式下显示出为寡聚体，或者可认为情况就是如此。
目前，解旋酶是根据其一级结构分类的(Gorbalenya等人，结构生物学最新观点(Current.Opin.Struct.Biol)(1993)3419-429)，但是也可基于寡聚体的状态或者多核苷酸解旋的极性分组(Lohman等人，生物化学年鉴(Annu.Rev.Biochem.)(1996)65169-214 & Bird等人，结构生物学最新观点(1998)814-18)。大量假定的解旋酶通过与原核生物、真核生物和病毒具序列同源性而得以鉴定(Gorbalenya等人，结构生物学最新观点(1993)3419-429)。虽然许多解旋酶发挥作用的形式似乎为六聚体或者二聚体(Lohman等人，生物化学年鉴(1996)65169-214)，也有一些为单体形式，例如PcrA解旋酶(Bird等人，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)(1998)262686-2693)和NS3解旋酶(Porter等人，生物化学杂志，(1998)27318906-18914)。其它解旋酶，如Rep解旋酶，也可以单体形式存在(Bird等人，核酸研究，(1998)262686-2693)。
在本发明的一个优选的实施方案中，使用了来自中度嗜热的嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的PcrA解旋酶，旨在利用单体系统的操作稳定性。PcrA解旋酶是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Petit等人，分子微生物学(Mol.Microbiol.)(1998)29261-274)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(Lordanescu等人，普通分子遗传学(Mol.Gen.Genet.)(1993)241185-192)的必须酶，它参与了修复和滚环复制(Petit等人，分子微生物学，(1998)29261-274)& Soultanas等人，核酸研究(1999)256350-355)。PcrA与大肠杆菌UvrD和Rep具有较高的同源性。
本方法一般应用电磁辐射而进行，使用的是表面胞质共振技术或者核磁共振技术。但是，也可考虑其它测定辐射变化的技术，例如全内反射荧光(TIRF)波谱学、衰减全反射(ATR)波谱学、破坏全反射(FTR)波谱学、布鲁斯特角度反射计、散射全内反射(STIR)或者损耗波椭圆光度法。
除了这些需要电磁辐射的技术外，也考虑了其它技术，特别是光化学技术(如化学发光)和包括共振系统的重量分析技术(如表面声波(SAW)技术和石英晶体微平衡(QCM)技术)。
表面胞质共振(SPR)波谱学是一个优选的方法，它通过检测溶液的体相与损耗波区折射率的差异来测定溶液的特性。入射的单色光以特定角度被对面的固相光学(传感器芯片)表面反射至待研究的样本中。光在样本中可延伸一小段距离，它受到表面相互作用的影响。
目前合适的传感器芯片是本领域公知的，它们一般包括光学透明物质(如玻璃)和薄的反射膜(如银或者金)。可阅览EP-A-0648328中对SPR波谱学的一篇综述。
核磁共振(NMR)波谱学是另一个优选的方法，它测定化合物的磁特性。在所应用的磁场与射频辐射的联合作用下，化合物的核按能量定向。当施加于核的能量等于自旋状态间的能量差时(差指的是所应用场的方向与正向平行或反平行之间的差)可产生共知的共振。一般可通过射频接受器检测从一种自旋状态到另一种自旋状态所吸收的能量和接下来能量的释放。
本发明的一个重要但并不必需的方面是将解旋酶/复合体固定在固相支持物上。固定解旋酶对本方法的成功提供了一些重要的有利条件。首先，大大降低了与测定可溶分子能量吸收相关的随机“噪音”。其次，降低了来自任一不直接参与与解旋酶相互作用的底物(例如NTP源)的噪音，因为解旋酶可被维持在一个与测定场有关的特异限定的区域内。如果用于测定辐射变化的技术需要测定荧光时(如TIRF)，随着新生链的延长，背景荧光会增加，这样固定解旋酶就尤其适用。同样，如果用SPR波谱学，解旋酶的反应维持在损耗波区内，不管多核苷酸的大小如何，均可进行准确的测定。最后，由于靶多核苷酸或寡核苷酸均非不可逆地附着在固相表面，再生表面相对较容易，同一被固定的解旋酶或者解旋酶复合体可用来进行进一步的测序反应。
可用本领域公知的标准程序进行固定。特别是用标准的氨基偶联步骤固定，将配体结合的氨基附着至例如葡聚糖或N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的表面。在本发明的一个优选的实施方案中，解旋酶固定在可测定折射系数改变的SPR传感器芯片表面。EP-A-0589867和Lofas等人，生物传感器和生物电学(Biosens.Bioelectron.)(1995)10813-822，给出了将生物分子固定在光学传感器的实施例。
在本发明的另一个实施方案中，DNA分子可附着在珠上。例如将DNA一个末端生物素化，附着至链亲和素包被的聚苯乙烯球(Chu等人，美国光学协会(Optical Society of America)，华盛顿，(1990)8202)，并约束在流动小池内的光学捕捉器中(Ashkin等人，光学通讯(Opt.Lett.)(1986)11；288)。当解旋酶(在外部控制下)沿着被测序的多核苷酸移动时，多核苷酸经光学捕捉器(也称为光学镊子)中的空间移动，因此解旋酶保持于检测区内。本系统也可反向发挥作用，将结合的解旋酶约束在光学捕捉器中。
本发明进一步优选的实施方案是检测单酶/酶系统的使用和检测，用标记监测构象变化。例如，使用单标记的聚合酶可为本方法/实施方案的成功提供一些重要条件。首先，大大减小非聚合酶分子(例如外切酶)在单一多核苷酸片段环境下的间歇持续合成能力问题。其次，避免了在流动流体中，检测单标记分子(即核苷酸)的问题，并避免了它固有的噪音问题。消除了核苷酸与模板多核苷酸相关表面或者模板多核苷酸内部的表面不受控制的结合问题。使用任何本领域公知的测定/监测单分子构象动力学、分子间相互作用、酶活性、反应动力学、分子运动自由度、活性改变和改变化学电稳定环境的技术均认为在本发明的范围内。这些技术包括，但不限于，荧光能量传递(FRET)(Ha等人，(1996)美国国家科学院院报96893)、荧光长期显微术(FLIM)、单分子极化/各向异性测定法和原子能显微术(AFM)测定法。
下列实施例对本发明进行了阐述。
实施例下列分析是在改进的BIAcore2000系统(BIAcore AB，Uppsala，瑞典)进行的，以传感器芯片CM5(研究级，BIAcore AB)作为光学传感器表面。仪器还配有整和的m-射流盒(IFC)，使单样本注射可在四个小池中分析。
制备PcrA解旋酶根据Bird等人，核酸研究(1998)262686-2693，利用肝素-琼脂糖凝胶的疏水相互作用层析，在低盐浓度下进行解旋酶纯化，制备PcrA解旋酶。通过凝胶过滤，去除痕量的蛋白质污染物。在所计算的消光系数为0.76 OD mg-1mL-1cm-1的280nm处如Dillingham等人，生物化学(Biochemistry)(2000)39205-212所描述，用分光光度法测定PcrA的浓度。
解旋酶的固定根据Jonsson等人，(生物技术(Biotechniques)(1991)；11；620-627)，将解旋酶固定在传感器芯片上。简而言之，用Hepes缓冲液(10mMHepes、150mM NaCl、0.05％表面活性剂P20(BIAcore AB，Uppsala，瑞典)，pH7.4)平衡传感器芯片环境。等体积混合N-羟基琥珀酰亚胺(溶于水，浓度为0.1M)与N-乙基-N’(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(溶于水，浓度为0.1M)，然后横贯芯片表面(CM5)注射，使羧甲基化的葡聚糖活化。PcrA解旋酶(160μl)与10mM乙酸钠(100μl，pH5)混合后，横贯注射至已活化的表面。最后，将传感器芯片表面残留的N-羟基琥珀酰亚胺酯与乙醇胺(35μl，溶于水，浓度为1M，pH8.5)反应，并洗去未与表面结合的解旋酶。固定步骤是在25℃，Hepes缓冲液连续流动(5μl/min)的条件下进行的。
寡核苷酸使用WO-A-99/05315中定义的SEQ ID No.1和SEQ ID No.2作为靶寡核苷酸和引物寡核苷酸。在杂交条件下这两个多核苷酸反应，形成靶-引物复合体。
经处理的DNA重悬于含有0.5mM 1-(硝基苯基)乙基-笼化ATP(在5’位置笼化)的缓冲液中(20mM Tris-HCl，pH7.5、8mM MgCl2、4％(V/V)甘油、5mM二硫苏糖醇(DTT)、40mg牛血清白蛋白)。该NPE-笼化ATP不可被水解，是ATP的光活化类似物。
然后，以流速5μl/min将经处理的DNA及NPE-笼化的底物溶液注射至传感器芯片表面的PcrA解旋酶上，通过形成PcrA/DNA/NPE-ATP复合体与解旋酶结合。
为了防止模板从解旋酶/芯片表面解离，含0.5mM ADP的Hepes缓冲液应维持在小片表面连续流动。
DNA的序列测定使用WO-A-99/05315中描述的方法进行DNA的序列测定，所用的仪器设备如
图1所示，但只用一个调焦装置(5)将单色光脉冲至小室中。
实验开始时，将温度为25℃，流速为30μl/min的含0.5mM ADP的Hepes缓冲液维持横贯小片表面，以10Hz的速率记录并收集数据。波长为260nm的单色光通过调焦装置(5)进行脉冲，以去除解旋酶反应位点处ATP分子的封闭基团，使解旋酶可将ATP水解为ADP，所释放的能量可进一步用于从多核苷酸去除一个碱基对。用SPR装置的p-偏振光检测与碱基运动相关的构象变化，其中的SPR装置可调制波长以产生SPR光谱。由于解旋酶不能获得可供水解的ATP作为能源，不能发生进一步的运动/解旋。
然后，将温度为25℃的含0.5mM NPE-笼化ATP的Hepes缓冲液以30μl/min的流速瞬时导入射流小池(6)，这样，在芯片表面，它可与固定化的解旋酶形成新的ATP-底物复合体。接下来，再将含0.5mM ADP的Hepes缓冲液导入流动小池，然后，将复合体上结合的ATP去笼化，底物dsDNA再次以单碱基对方式解旋，然后对单碱基进行测定。
附图给出了序列测定实验的结果，它以反应点(RU)对时间(T；sec)作图。该图显示了被掺入新生链的每一个核苷酸的检测结果。结果给出的是与靶多核苷酸互补的序列。
权利要求
1.一种测定多核苷酸序列的方法，包括以下步骤(i)在适于酶活性的条件下，使靶多核苷酸与解旋酶/引发酶反应；(ii)通过测定辐射，检测酶与靶上的核苷酸之间的相互作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其中辐射是电磁辐射。
3.根据权利要求1或者权利要求2所述的方法，其中步骤(ii)包括表面胞质共振的使用。
4.根据权利要求1或者权利要求2所述的方法，其中步骤(ii)包括核磁共振的使用。
5.根据上述权利要求中任意一项所述的方法，其中酶固定在固相支持物上。
6.一种传感器芯片，其包括固定在其上的解旋酶/引发酶。
全文摘要
一种测定多核苷酸序列的方法,包括以下步骤:(i)在适于酶活性的条件下,靶多核苷酸与解旋酶/引发酶(可以是固定化的)反应;(ii)通过测定辐射,检测酶与靶上的核苷酸之间的相互作用。
文档编号G01N33/483GK1345379SQ0080584
公开日2002年4月17日 申请日期2000年4月6日 优先权日1999年4月6日
发明者D·H·丹斯哈姆 申请人:医疗生物系统有限公司