专利名称：荧光定量pcr分析系统的制作方法
技术领域：
本发明是生物、医学领域用于定量分析聚合酶链反应(PCR)原始靶基因浓度的装置。
在本发明作出前，还没有全自动定量检测聚合酶链反应原始靶基因的仪器。传统的方法是先将靶基因置于由微机自动控制电路控制加热和制冷的热循环装置，完成PCR要求的变性、复性和延伸，使靶基因被扩增数百万倍。然后再将扩增产物进行凝胶电泳来判断是否具有欲检测的靶基因。由于PCR扩增的效率很高，极少量的靶基因和大量的靶基因被同时扩增最终达到饱和，在电泳检测时的结果是一样的，因此这种方法只能获得特定基因是否存在的定性结果，而无法对其数量或浓度定量检测，另外这种方法由于在操作过程中需要将检测样本转移，因此容易受环境的污染而造成结果的不准确(假阳性和假阴性)。同时还存在操作过程复杂，检测时间长等缺点。
本发明的目的是提供一种能自动、快速完成对靶基因的定量检测，并在整个检测过程中不受环境污染的荧光定量PCR分析系统。
本发明的技术解决方案是利用控制电路在控制热循环装置对靶基因扩增的同时对被测反应物的荧光信号强度进行检测，由于荧光信号强度与靶基因的浓度是成比例关系的，因此检测荧光强度就能知道特定基因的数量或浓度(单位容积内的数量)。
整个装置包括置于箱体内的热循环装置，荧光检测装置、控制电路和置于箱体外的计算机，所说的热循环装置包括具有一排插孔的变温金属模块、与变温金属模块紧贴的热电制冷器，设在热电制冷器旁的散热器、风扇和插放在插孔中的试管，试管上盖有带加热器的热盖，在热盖、散热器和变温金属模块中分别设有温度传感器；荧光检测装置包括位于变温金属模块下方的与金属模块上的一排插孔平行，并由步进电机带动来回移动的同步带，固定在同步带上的壳体，壳体上设有位置传感器，壳体顶端有孔，自顶端孔而下依次设有透镜，与轴线呈45°倾角的二向分色镜，与轴线垂直的横杆及光电倍增管，横杆贯穿于壳体相对两壁，该横杆随壳体来回移动，其二端与箱体上的定位板撞击作水平滑动，在横杆上设有若干不同波长的滤光片，在壳体内位于横杆上方设有激发光源、滤光片、透镜，光源发出的光经滤光片、透镜水平照射到二向分色镜上；
控制电路包括通过接口与外设计算机相连的微处理器，分别将来自变温金属模块温度传感器和光电倍增管的输出信号转换成数字信号输给微处理器的A/D转换器，输入端与微处理器相连，输出与热电制冷器电连接的用于使电压换向的固态换向桥，输入端与温度传感器相连，输出与热盖上加热器和风扇相连的温度控制电路以及开关电源，开关电源与微处理器相连，其输出电压分别输给固态换向桥，温度控制电路及步进电机驱动器，微处理器输出的驱动信号输入步进电机驱动器，位置传感器的输出信号输入微处理器。
以下结合附图对本发明作进一步详细描述
图1是本发明的荧光定量PCR分析系统的示意图；图2是热循环装置示意图；图3是图1的A-A剖视图；图4是控制电路构成框图；图5是控制电路的固态换向桥一种具体电路实例；图6是控制电路中的开关电源的具体电路实例；图7是温度控制电路的具体电路实例。
参照图1，本发明的荧光定量PCR分析系统包括置于箱体V内的热循环装置I，荧光检测装置II、控制电路III和置于箱体外的计算机IV，其荧光检测装置位于热循环装置的下方。热循环装置和荧光检测装置的结构见图2、图3所示。
所说的热循环装置I包括具有一排插孔21的变温金属模块4、与变温金属模块4紧贴的热电制冷器3，设在热电制冷器3旁的散热器2、风扇1和插放在插孔21中的用于盛放反应物的试管5，在试管5的上方盖有防止试管内反应物蒸发的带加热器的热盖6，在热盖6、散热器2中分别设有温度传感器7，在变温金属模块4中设有温度传感器8；使用时，用若干个试管盛放已知浓度的标准反应物，在其余试管中盛放被测反应物，并在反应物中加入荧光剂。
荧光检测装置II包括位于变温金属模块4下方的与金属模块上的一排插孔21平行，并由步进电机17带动来回移动的同步带16，固定在同步带16上的壳体22，壳体上设有位置传感器36，壳体顶端有孔19，自顶端孔而下依次设有透镜13，与轴线呈45°倾角的二向分色镜12，与轴线垂直的横杆20及光电倍增管15，横杆20贯穿于壳体相对两壁，该横杆随壳体来回移动，其二端与箱体上的定位板18撞击作水平滑动，在横杆上设有若干不同波长的滤光片14，在壳体内位于横杆上方设有激发光源9、滤光片10、透镜11。通常，使用LED激发光源，激发光源9发出的激发光通过滤光片10过滤成特定波长的单色光，再由透镜11聚焦成平行光照射到二向分色镜12上，特定波长的单色光经二向分色镜反射通过透镜13聚焦在试管5的底部，使试管内的反应物发出特定波长的荧光，荧光通过透镜13照射在二向分色镜12上，波长大于一定值的荧光穿过二向分色镜12，经滤光片14过滤成特定波长的单色光，被光电倍增管15接收变成电信号输给控制电路。步进电机17正反向转动带动同步带16直线运动，从而使固定在同步带上的具有光学检测器件的壳体来回移动，对各个试管的荧光逐一检测，同时通过定位板18撞击横杆20切换滤光片14，用于过滤不同波长的荧光。
热循环装置及荧光检测装置由控制电路控制进行工作和信息传递。
控制电路见图4所示，它包括通过接口24与外设计算机IV相连的微处理器25，分别将来自温度传感器8和光电倍增管15的输出信号转换成数字信号输给微处理器25的A/D转换器26、27，输入端与微处理器相连，输出与热电制冷器3电连接的用于使电压换向的固态换向桥28，输入端与温度传感器7相连，输出与热盖上加热器和风扇1相连的温度控制电路30以及开关电源29，开关电源29与微处理器25相连，其输出电压分别输给固态换向桥28、温度控制电路30及步进电机驱动器34，微处理器输出的驱动信号输入步进电机驱动器34，位置传感器36的输出信号输入微处理器。
工作时，计算机IV传出的指令信号经微处理器25转换成控制信号，微处理器的控制信号一方面输给固态换向桥28，由其对来自开关电源29的电压进行换向和调节，供热电制冷器3加热或制冷或恒温，控制PCR扩增的温度要求，另一方面输给步进电机驱动器34，控制步进电机实现往复式直线步进，依次完成对全部(包括标准反应物和被测反应物)试管反应物在不同波长下的荧光强度检测。同时，热循环装置中的温度传感器8输出的温度信号和荧光检测装置中的光电倍增管15输出的电信号分别由A/D转换器26、27转换成数字信号，以及位置传感器36输出的位置信号均经微处理器传输给计算机，经过计算机软件处理后，一方面发出控制指令输给微处理器转换成控制信号，另一方面将扩增过程中输入的被测反应物和标准反应物的荧光强度作比较，处理成直观易懂的曲线或图表在显示器显示，实现对靶基因的定量检测。控制电路中的温度控制电路30接收温度传感器7输出的温度信号，其输出接通热盖加热器，风扇，以使热盖及周围温度始终控制在所需范围。
图5是控制电路的固态换向桥一种具体电路实例；
此例中，固态换向桥是由二片IR2110集成块和MOSFET管Q1～Q4构成，图中TE+、TE-端与热电制冷器相连，COOL、HEAT、PWM端是来自于微处理器的CPU接口信号，该电路实现了无触点的电子换向。
图6是控制电路中的开关电源的具体电路实例。
此例中，交流电源经TVS管保护，经整流滤波及熔断器后，进入隔离的直流/直流变换器模块PH300F，在HV+、HV-端输出安全特性较高的直流电压。直流电压提供给固态换向桥用于热电制冷器的驱动，也提供给步进电机驱动电压，同时给温度控制电路提供了12VDC，用于热盖、散热器的温度控制。PH300F中的CNT与SG间与微处理器的电源控制接口相连。
图7是温度控制电路的具体电路实例。
热盖上温度传感器的温度信号从SEN6、OUT6端接入，并与由电阻R7、R8决定的温度设置点在集成电路U5(TLC2202)中进行放大比较，驱动Q5的开关状态，对接于HOTL10端的热盖加热膜实现自动控温。同理，散热器上温度传感器的温度信号从SEN7、OUT7端接入，并与由电阻R12决定的温度设置点在集成电路U6(TLC2202)中进行放大比较，驱动Q6的开关状态，控制接于FAN端的风扇动作，实现散热器的温度自动控制，U3和U4是恒流源，它起到了稳定被测温度信号的作用。
控制电路中的微处理器可用80C196。接口可采用RS232。
本发明的荧光定量PCR分析系统，利用计算机、微处理器控制，在热循环装置对靶基因实施扩增的同时，采用荧光检测装置对被检物和标准物的荧光强度进行检测，并由计算机软件将被检物和标准物的荧光强度作比较，由于靶基因强度与荧光强度成比例，因此可自动、快速实现对靶基因浓度的实时定量检测，由于整个检测过程是在完全密闭的试管中进行，而加入试管的荧光剂并不污染反应物，因此检测物不会受到环境污染。
权利要求
1.荧光定量PCR分析系统，其特征在于它包括置于箱体内的热循环装置[I]，荧光检测装置[II]、控制电路[III]和置于箱体外的计算机[IV]，所说的热循环装置[I]包括具有一排插孔[21]的变温金属模块[4]、与变温金属模块[4]紧贴的热电制冷器[3]，设在热电制冷器[3]旁的散热器[2]、风扇[1]和插放在插孔[21]中的试管[5]，试管[5]上盖有带加热器的热盖[6]，在热盖[6]、散热器[2]中分别设有温度传感器[7]，在变温金属模块[4]中设有温度传感器[8]；荧光检测装置[II]包括位于变温金属模块[4]下方的与金属模块上的一排插孔[21]平行，并由步进电机[17]带动来回移动的同步带[16]，固定在同步带[16]上的壳体[22]，壳体上设有位置传感器[36]，壳体顶端有孔[19]，自顶端孔而下依次设有透镜[13]，与轴线呈45°倾角的二向分色镜[12]，与轴线垂直的横杆[20]及光电倍增管[15]，横杆[20]贯穿于壳体相对两壁，该横杆随壳体来回移动，其二端与箱体上的定位板[18]撞击作水平滑动，在横杆上设有若干不同波长的滤光片[14]，在壳体内位于横杆上方设有激发光源[9]、滤光片[10]、透镜[11]，光源发出的光经滤光片[10]、透镜[11]水平照射到二向分色镜[12]上；控制电路[III]包括通过接口[24]与外设计算机[IV]相连的微处理器[25]，分别将来自温度传感器[8]和光电倍增管[15]的输出信号转换成数字信号输给微处理器[25]的A/D转换器[26、27]，输入端与微处理器相连，输出与热电制冷器[3]电连接的用于使电压换向的固态换向桥[28]，输入端与温度传感器[7]相连，输出与热盖上加热器和风扇[1]相连的温度控制电路[30]以及开关电源[29]，开关电源[29]与微处理器[25]相连，其输出电压分别输给固态换向桥[28]，温度控制电路[30]及步进电机驱动器[34]，微处理器输出的驱动信号输入步进电机驱动器[34]，位置传感器[36]的输出信号输入微处理器。
2.按权利要求1所述的荧光定量PCR分析系统，其特征在于所说的固态换向桥是由二片IR2110集成块和MOSFET管[Q1～Q4]构成。
全文摘要
荧光定量PCR分析系统。它包括置于箱体内的热循环装置,荧光检测装置、控制电路和置于箱体外的计算机,利用计算机、微处理器控制,在热循环装置对靶基因实施扩增的同时,采用荧光检测装置对被检物和标准物的荧光强度进行检测,并由计算机软件将被检物和标准物的荧光强度作比较,由于靶基因强度与荧光强度成比例,因此可自动、快速实现对靶基因浓度的实时定量检测,由于整个检测过程是在完全密闭的试管中进行,因此检测物不会受到环境污染。
文档编号G01N21/64GK1379236SQ0111642
公开日2002年11月13日 申请日期2001年4月12日 优先权日2001年4月12日
发明者李社刚, 毛立新, 李建峰, 项伟平, 刘志华, 吴志和 申请人:杭州大和热磁电子有限公司