磁性粒子测定的制作方法

专利名称：磁性粒子测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于测定样品中磁粒子数的方法与设备。例如用于免疫测定中的测定磁粒子数的方法。
这种方法允许将涂层的顺磁粒子(PMP)用作标记，采用新颖的电子电路设计来探测它们。
PMP的直径通常为2.8μm，包括顺磁材料芯料涂以适当的聚合物层，而在聚合物层上则根据PMP的具体应用附有抗体/抗原层。当前，这些磁粒子的主要应用是免疫测定中的样品分离、提纯与用作固相。
在典型的免疫测定法中，PMP以蛋白质涂层，使之能用作可于其上发生免疫反应的固相材料。这种免疫反应用酶、荧光或化学反光分子为标记进行探测与定量化。PMP并非永磁化的而是被吸引到永磁铁上允许进行简单的洗涤处理，因此洗涤这种已涂层的PMP不要求进行过滤或离心处理。在洗涤步骤之后，用适当的方法探测已涂层的PMP表面上固定的标记。
将铁磁粒子用作免疫测定法中的标记的方法已为Kriz等在两篇论文中描述到。这两篇论文是“磁性免疫测定法的进展”，Biosensors andBioelectronics 13(1998),pp817～823；“生物分析与生物传感器中的磁导率的测量，Analgfical Chemistry 1996,68,1966～1970。但在这些方法中，铁磁粒子是由置于Maxwell电桥中的简单测量线圈进行探测，允许测量拟制备的样品的磁导率。然后用此磁导率为指示数去测定此样品物质中的粒子数。
根据本发明的第一方面，提供了用具有电容器与线圈的调谐电路来测定样品内的磁粒子数的方法，此方法包括a．测定此样品在和不在该线圈中时，上述谐振电路的谐振频率差；b．应用此谐振频率差来测定磁粒子的浓度。
根据本发明的第二方面，提供了用来测定样品内磁粒子浓度的设备，此设备包括a．具有电容器与线圈的调谐电路；b．产生用于驱动调谐电路的驱动信号的驱动器；c．探测此调谐电路谐振频率的探测器，样品在和不在线圈中时此谐振频率的差即表示PMP的浓度。
据此，本发明提供了用来测定样品中的磁粒子数的方法与设备。本发明利用了这样一个事实磁粒子如顺磁粒子、铁磁粒子或类似粒子的存在，将导致样品中磁导率的固有变化。由于线圈的自感取决于线圈中材料的磁导率，将含有磁粒子的样品置于线圈中会导致线圈自感的变化。本发明通过测量包含线圈的LC电路的谐振频率，求得线圈自感的指示数来利用上述效应。样品置于线圈内与将样品自此线圈中取出时，上述电路的谐振频率是不同的。因此，通过测量LC电路中谐振频率，就能测定样品中的磁粒子数。此外，通过将这种线圈选择为螺线管、环形线圈与扁平线圈之一，就有助于使线圈与样品间的静压减至最少，由此可以保证获得最佳信号。
通常，测定调谐电路的谐振频率差包括将样品置于线圈内；测定此调谐电路的谐振频率；从线圈中取出样品；再测定此调谐电路的谐振效率。最好是去测定有样品在然后除去样品时的调谐电路的谐振频率，以解决此线圈谐振频率的长期变化影响。这种长期变化通常是由于周围环境中的温度变化以及其他这类因素造成。但由于这类变化通常是长期地发生这几个小时之久，于是通过使样品存在而随即便除去样品来进行此后的测量，就可以保证所测谐振频率的变化唯一的原因是由于样品的存在和/或不存在所致。于是，这将有助于防止线圈固有谐振频率的变化影响到测量结果。但应认识到，要是能提供足够稳定的调谐电路，则可以只需对无样品的调谐电路的谐振频率测量一次，然后以之用于所有的继后测量中即可。
测定此谐振频率的步骤一般包括对调谐电路施加驱动信号；测量此驱动信号与取自调谐电路的输出信号间的相位差；然后调节所加信号的频率，直至所加信号与输出信号间无相位差。也可以采用其他的适当方法，但上述方法的优点是能用反馈机构调节电路而使此电路能自动确定该谐振频率。
此驱动信号所具的频率通常大于200KHz，而最好是大于500KHz。这是由于在较高的频率下时，线圈电感的一定变化会造成调谐电路谐振频率的显著变化。因此，使电路在较高频率下运行会提高系统的灵敏度。
通常所用的磁粒子是顺磁粒子，但也可采用铁磁粒子或任何其他磁性粒子。
用于探测调谐电路谐振频率的探测器可以包括相位比较器，用以测定驱动信号和从调谐电路取得的输出信号之间的相位差，同时还包括用于将驱动信号施加到调谐电路上的驱动器，此驱动器则包括压控振荡器(VCO)。这样的设备结构有利于让比较的相位直接耦合VCO，使此VCO能响应相位比较器，改变驱动信号的频率直至不存在相位差。
上述设备最好包括锁相环振荡器电路。这是特别有利的，因为如上所述，这样能允许精确定测定调谐电路的谐振频率而不受人为的干扰。这是一种能获得高精确结果的自动化方法。
本发明特别适用于免疫测定。但它也可用于其他类型的样品，如瓶罐与其他容器、标记等。
根据本发明的第三方面，提供了进行结合试验的方法，此方法包括a．将分子层固定于基片上；b．提供许多磁粒子作为标记；c．用分子层进行反应，以使至少一些磁粒子结合到基片上。
d．通过测定基片暴露于线圈产生的磁场之下和基片未暴露于线圈产生的磁场下时调谐电路的谐振频率差，由此来测定结合到基片上的磁粒子数。
因此，本发明还提供了用磁粒子为标记进行试验的方法。实现这项试验时是用上面固定有适于此项试验的分子层的基片。试验的反应设计成，使得磁粒子上的涂层与基片上的固定层之间形成结合。因此，通过测定此基片在和不在线圈内时调谐电路的谐振频率，就能测定结合到基片上的磁粒子数。
通常，磁粒子是结合到相应个数的第二种分子上，其中的反应使第二种分子与该分子层结合而使磁粒子结合到基片上。但也可用另一种方式，即将磁粒子设计成与结合到基片上的分子直接反应。
这种反应可以是任何反应形式，例如DNA杂交反应。此时，第一种与第二种分子将包含部分DNA。但这种结合试验最好是这样一种免疫测定试验，其中的分子层是抗体/抗原层而第二种分子是抗原或抗体。因此，磁粒子可以耦合到此抗原或抗体上，然后结合到基片上形上的抗体/抗原层上。
如上所述，当样品设在基片上时，最好是使线圈与样品间的静压最小化。为此，较为理想的是使调谐电路是螺线管、环线线圈与扁平线圈中的一种。这时，如果线圈是螺线管，此方法一般涉及到将样品置于此种线圈内而暴露于磁场之下。此外，这种线圈最好具有椭圆形剖面，虽然矩形剖面也是可以采用的。或者，可以采用扁平线圈而把样品置于线圈邻边使之暴露于磁场之下。
应该认识到，本发明的第三方面可以有利地利用本发明的第一与第二方面来实施。因此，可以用前述的电子电路来产生与基片上固定的PMP直接相关的输出。在此方法中，PMP粒子此时被用作标记物，而不需用独立的荧光的、放射性的、化学发光的或其他的标记物。这样就能显著地减少分析步骤数和缩短试验所需的时间。此外，这种电子电路在形体上小到足以允许开发手持式仪器。
采用荧光或类似标记物的当前的分析式免疫测定系统需用昂贵的专门设备，把它们制造成手持式系统是不实际的。当前市售的仅有的手持式系统是采用利用颜色标记的测杆工艺。这种系统主要用于近乎病人的试验例如怀孕试验，而这种试验的结果只会是阳性或阴性的。它们一般不适用于测定物质的实际浓度。
下面参考


本发明的例子，附图中图1A是调谐电路第一例子的示意图；图1B是调谐电路第二例子的示意图；图2是传统的振荡器电路的示意图；图3是本发明的电路的示意图；图4是曲线图，示明在图3的电路中，频率相对于所得到的磁粒子浓度减少而下降；图5是适用于图3电路中的振荡器的电路图；图6是曲线图，示明探测出的PMP粒子数相对于调谐电路谐振频率的变化；图7是用于图3的调谐电路中的线圈第二例的示意图；图8是曲线图，示明在图7的线圈下，所探测到的PMP数相对于调谐电路的谐振频率的变化；图9是用于图3中调谐电路的线圈的第三例的示意图；图10是曲线图，示明探测出的PMP粒子数相对于调谐电路谐振频率的变化；图11A与11B例示了用于图3的调谐电路中的两种扁平线圈构型；图12是曲线图，示明在图7的线圈下，所探测到的PMP数相对于调谐电路的谐振频率的变化；图13是依据本发明的免疫测定反应的示意图。
在本发明的一个例子中，为了测定塑料片上涂层的顺磁粒子数，将此塑料片置于绝缘导线的线圈中，同时观察这些顺磁粒子的存在对线圈自感L的影响。假设只是这种粒子的高的磁导率才会对线圈自感的变化才有显著影响。
大匝数的均匀螺旋形线圈的自感给定为L≈μμom2lA(1)式中μo=真空的磁导率(4π×10-7Hm-1)；μ=(线圈)芯的相对磁导率；
m=每单位长度的匝数；l=长度；A=线圈的横剖面积。
当上面附有n个顺磁粒子的塑料片置于线圈内时，此线圈的μ的有效值是某个与塑料片中塑料磁导率μv、塑料片上任何残余缓冲液的磁导率μs、顺磁粒子的磁导率μp以及线圈中空气间隙的磁导率μA有关的值。此时的自感成为L={Cvμv+CAμA+Csμs+nCμp}μom2lA={Cvμv+CAμA+Csμs}μom2lA+nCμpμom2lA(2)式中Cv=塑料片中塑料的有效量；Cs=塑料片上缓冲液的有效量；CA=线圈中空气的有效量；C =使各个粒子的磁导率与它们对总的磁导率的影响相关的常数。
由于这些顺磁粒子与线圈内容积相比极其之小，各粒子周围的磁场是不均匀的，但由于这些粒子的形状与粒度(2.8μm直径)都相同，它们对总的有效磁导率的影响都相等。对这些研究中的所有样品来说，各塑料片均有一致的结构，而缓冲液残余物的体积可以假定为常数。于是第一项中所有的值为常数或小到可忽略的程度，从而式(1)可以改写为L=Lo+kn(3)式中k=Cμpμom2lA=常数，Lo={Cvμv+CAμA+Csμs}μom2lA=包含着上面只有缓冲液残余物而无粒子的塑料片的线圈的电感相对应的另一常数。
于是，线圈的电感随塑料片上顺磁粒子数的增加而变得均匀。为使n对于L的影响最大而由此提高探测系统的灵敏度，Lo应尽可能地小而k应尽可能地大。通过减小线圈的内部尺寸使之大到刚好足以盛纳下此样品片使线圈中的静空间保持到最小，这样就将减小CA，从而减小Lo。这也同样保证了线圈中有更多的电磁场通过磁粒子，从而提高了C与k。
顺磁粒子对线圈电感的影响是通过将样品片置于与并联电容器形成谐振电路的线圈中进行测定(图1A)。
图1A中电路的谐振频率给定为f={2π(LC)1/2}-1(4)由式(3)与(4)得到f={2πC1/2(Lo+kn)1/2}-1={2π(LoC)1/2}-1{1+(k/Lo)n}-1/2f=fo{1+(k/Lo)n}-1/2(5)式中，fo=包含着上面只有剩余缓冲液而无磁粒子的塑料片的电路的谐振频率。
用二项式定理展开式(5)，得f=fo{1-1/2(k/Lo)n+…}f=fo{1-1/2(k/Lo)n}(略去了高次项)(6)式(6)表明LC调谐电路的振荡频率将随塑料片存在的顺磁粒子数的增加作线性的减少。
在实际的LC电路中，如图1B中例示，此线圈具有内阻RL而电容器具有漏泄电阻RC，同时有杂散电容CL主要存在于线圈中的各绕组间。对于优质的电容器，RC很大，对电路性能的影响可略去不计。这种杂散电容在绝大程度上取决于线圈的结构而会减少电路的谐振频率。要是线圈具有刚性结构，CL将不保不变而其存在可以基本上忽略。当把空白的塑料片插入线圈内时常可以观察到谐振频率略有减少，这是由于此塑料片较它移走的空气有较高的介电常数使CL增加所致。内阻RL由于它会减小谐振频率可能具有最大的影响f={1-(RL2C/L)}1/2{2π(LC)1/2}-1(7)对于L=130μH、C=4.7nF和RL=17Ω的典型线圈而言，RL能使谐振频率从f=203.61KHz(式4)减少到f=202.54KHz(式7)，即谐振频率下降了1.07KHz。
实际的LC电路的谐振频率与温度关系至为密切。图1B中所示各元件的值在某种程度上都会随温度变化，因而会影响到谐振频率随温度漂移。线圈是由薄铜丝制成，这就加大了它的电阻随温度升高而增加的特性。此外，线圈的尺寸与电容器C的电容也随温度而改变。
于是，LC电路的振荡频率，从而塑料片上的顺磁粒子数，是由采用LC电路来控制振荡器电路的振荡而决定的。试验结果表明，当把上面载有磁粒子的塑料片置于在约250KHz下振荡的线圈中时，谐振频率通常只减少几个Hz。因此上述振荡器电路必须非常稳定。
传统的振荡器电路例如图2所示的Colpitts振荡器并未见稳定到足以可靠地测出这样小的频率变化。性能如此差的可能原因是此电路是在式7给定的频率下振荡，因而谐振频率受到LC电路内阻的影响。在图2所示的电路中，晶体管TR1的输入阻抗也会影响LC电路的谐振频率，而由于此阻抗也是温度函数，它将加大振荡器的不稳定性。
为此需要有全新的方法，业已发现，最稳定的振荡器电路乃是基于锁相环(PLL)的振荡器电路，它的一个例子示明于图3。
图3所示电路包括压控振荡器(VCO)1，它的输出端耦连到频率计2与鉴相器3上。VCO1的输出端也通过电阻器5与包括线圈L和电容器C的调谐电路4耦连，如图所示。鉴相器3除与VCO1的输出端耦连外还与调谐电路4耦连。鉴相器3的输出经由环路滤波器6传送给VCO1。
工作时，用VCO1产生一经电阻器5施加给调谐电路4的驱动信号，驱使调谐电路4振荡。
当调谐电路4振荡时，L与C的电位差由于它们的振荡完全相同但相互180°(π弧度)异相而互消。LC电路在谐振时的阻抗完全是电阻的(在图1B中约等于RL)，而在电路中流过的电流则与所加电压同相。与LC电路串联的电阻器两端的电位差与在此电路谐振时所加的电压同相。发生这种情形的频率由式(4)给定但用C+CL取代了C。这一频率在很大程度上与RL(它可能是影响LC电路不稳定性的最主要因素之一)无关。
这样，鉴相器3与VCO1的输出端耦连来测定驱动信号的相位，同时与调谐电路耦连来测定调谐电路振荡的相位。然后此鉴相器3产生一DC信号来代表输出给环路滤波器6的振荡相位差。上述信号经此环路滤波器滤波后返回到VCO1。
VCO1经控制成当施加DC误差信号时将改变其输出频率，直至此驱动信号与调谐电路振荡间不存在相位差而由鉴相器3无误差信号输出时。
VCO的输出频率由频率计测量。上述电路显著提高了频率稳定性，在谐振频率200～300KHz范围内可以测出的频率变化小于1Hz。
适用于PLL VCO的电路给出于图5中。IC1是具有正弦波输出的VCO，可以在10KΩ的预设定下从约18KΩ变化到38KΩ。VCO的输出经10KΩ的电阻器馈送给LC电路。OP1是比较器，它从VCO输出的正弦波导出方波，同时驱动IC2这一D型的触发器。此LC电路上的正弦波电压经高输入阻抗缓冲放大器(OP2)传送给第二比较器(OP3)与触发器(IC3)。这些触发器接合NAND(“与非”)门(IC4)和二极管D1与D4，形成了边缘敏感的超前-滞后(Ⅱ型)相敏检测器。在PSD输出端的±dC误差信号由高增益低通滤波器(f3dB=16Hz)OP4放大。为了加速接通后的锁定过程，由二极管D3与D4将上述误差信号限制为约±0.6V。经缓冲放大器(OP5)将dC误差信号反馈给VCO，使上述环路闭合。
为了形成这种电路，首先必须用式(4)计算LC电路的谐振频率的近似值(此值必需在VCO的输出频率范围内)。现在对这种预设定进行调节，直至IC1的输出约为此近似值。存在预设定的调节范围，其中的输出频率几乎无变化。这表明PLL锁定到LC电路的谐振频率上。
图3所示PLL电路的性能最初是用包含有大量悬浮的PMP的样品进行研究的。所用的样品具有悬浮于缓冲液中已知浓度的PMP(0、1.03、2.11、4.19、6.22与8.21mg/ml)。这些样品盛放于30mm直径与47mm高的密封圆柱形塑料瓶中。这种瓶含20ml的乳浊液。将瓶剧烈摇晃保证其均匀混合，然后放入接附于锁相环电路(图5)的线圈(50匝，24SWG的漆包铜线，电感≈75μH)中，测量振荡频率。此时除去样品瓶，观察频率的增加。对于所有的瓶重复该试验10次，如图4所示，相对于瓶中粒子的浓度标绘出两种读数的差。
结果清楚地表明，正如式(6)所示，LC调谐电路的谐振频率的减少与瓶中乳浊液内的粒子数直接相关。业已发现，这种方法是很可靠的，能将瓶中未知的磁粒子浓度测定到优于1％的精度。
从上述试验所得到的另一项重要发现是，尽管此振荡电路具有良好的短期稳定性，但仍然存在着主要因环境温度变化致线圈电感改变而导致频率普遍的长期漂移。经过一昼夜的时间，室温的变化可能导致基线频率漂移大于±50Hz。但是发现，这对于样品从线圈中取出时所产生的频率改变几乎无影响。于是，下面的测量方法有利于进行这种试验观察。
·将样品插入线圈中；·测量频率；·从线圈中快速地取出样品；·再次测量频率并记录频率的增加结果。
这样，在整个测量时间内所提供的记录下频率的变化大于基线频率的漂移，于是所得结果与基线频率无关。这一测量方法大大消除了温度对所得结果的任何影响。因此，不必要对电子电路与线圈进行精致的温度控制，而这在手持式电池供电的仪器中则是需要重点考虑的因素，其中的控温包装本身就将消耗颇多的电功率。
当线圈L符合下述条件时，以此线圈L置于图3的PLL电路中而样品瓶含有顺磁粒子(PMP)时得到了最佳的总体性能·所具的内径刚好大到足以置纳下样品而使静区的量保持到最小；·刚性；·在约200～300KHz发生谐振。
此种系统可以用于测量结合在基片上的许多PMP，例如在免役测定法中所出现的情形。
在此情形中，应用与上述相同的操作方法，将上面载有未知数量的PMP的塑料片置于线圈内，观察电路的振荡频率。当此塑料片从线圈中快速地取出后可观察到频率增加了，这可以用来测定塑料片上PMP数量的标记。
然后，通过生产许多基片(在此情形下为塑料片，例如免疫测定法中所用的)，上面载有未知数量的PMP，由此来校正上述系统。然后用它们来测定在一定磁粒子数下所得到的频率变化。
所用的磁粒子是Dynal H-280，直径为2.8μm。样品中磁粒子的浓度通过计算已知容积中的粒子数来测定。这可以用一种NewNeubauer血细胞计来完成，这种血细胞计具有在玻璃载片上蚀刻出的校准过的方格和已知的深度。知道浓度后，可计算出加到塑料片上的粒子数。将这些磁粒子在塑料片上干燥。对于在3.33×106～1.68×105的磁粒子数制定了若干标准，这些标准已被用于仪器响应的校准中。
采用基本线圈构型测定了图3中PLL电路对标准塑料片的响应。所用方法与前述的相同。将上面载有已知数量的PMP的试验片插入线圈L中测量调谐电路4的谐振频率。然后从线圈L中取出样品再测量其谐振频率。任意此谐振频率的变化。用同一测试片将此试验重复10次。再用另外的测试片重复此试验。将此结果示明于如图6所示的PMP数目相对于谐振频率变化的曲线图中。
上述结果标明于log-log轴上，用线性回归法确定出最佳的直线。图中的点表示的是各样品读数的平均值，而误差条则表示此平均的标准误差。此PLL电路如式(6)所示对于增多的粒子数具有良好的线性响应，灵敏度约为0.16Hz/105粒子。
这些结果中的某些分散值可能是由于样品在所有的测试片上未能设置于完全同一的位置上，以及样品在各次测量中未能每次总是在线圈中确切的同一位置上所致。
但是，为了改进这种系统，采用了若干较小的线圈以便减小线圈内的静区，从而提高线圈L在图3中PLL电路上的灵敏度。业已确定，最优的线圈乃是具有椭圆形横剖面的且免疫测定法中所用的样品基片能恰好配合于其中的螺线管。
这类线圈易用下述方法构成·将4～6层管工用PTFE螺纹带卷绕到空白塑料片上；·将线圈绕到PTFE带的顶部上；·用速固的环氧树脂给线圈作厚的涂层；·让此环氧树脂硬化；·仔细地牵引此塑料片将其从线圈中撤出；·从线圈中取出PTFE带。
结果得到了内部尺寸恰好大到足以容纳此测试塑料片的刚性线圈。还可以在线圈内侧涂布环氧树脂，用以保护导线不受意外损伤。
线圈的电感随线圈有效横剖面积以及线圈中匝数的增加而增加。减小线圈的横剖面积就意味着必须增多线圈中的匝数来产生具有所需电感的线圈。为此，最好使线圈的长度恰好稍大于样品的长度。这就是说，导线必须很细，不然就需生产出很厚的多层式线圈。
于是生产了图7所示的线圈L，具有2.5×7mm的椭圆形剖面和7mm长。用市售的最细漆包铜线(42SWG)绕制线圈。采用了4层导线，最终的线圈L=131μH而R=17.18Ω。此线圈与C=3.3nF的电容器并联，在217KHz下谐振。
然后如上所述，于图3的PLL电路中测试此线圈。结果示于图8的曲线图中。
上述线圈装置用于PLL电路中时，与测试塑料片上有约0.4Hz/105粒子的先有线圈设计相比，具有良好的线性响应和改进了的灵敏度。误差条也较小，这表明此电路一般较为稳定。若将线圈制备得更小而使线圈与样品间的静区甚至更小，则可能进一步提高线圈装置的灵敏度。更小的线圈将需要比上述结构所用42SWG还要细的导线。用手来精确地绕制线圈对于这样细的导线是很困难的，因而需要某种绕线机。
最近的观察结果也指出，用于线圈结构中的部件应具有低的介电常数以提高调谐电路4的Q值。
这种线圈结构的进一步发展形式示明于图9中。它包括铁氧体环20，上面绕有绕组20。铁氧体是电的绝缘体，有很高的磁导率，可以在很高的频率下工作。这说明具有铁氧体磁心的线圈需要较少的匝数以具有高的电感。
上述铁氧体环20包括厚约1mm的环隙21。此铁氧体环两端间的间隙小到由线圈产生的电磁场几乎无损耗地通过置于此环隙中的样品片。与前述例子相同，样品中顺磁粒子的存在将加大线圈的电感，因而这种构型能用作调谐电路4中的线圈L。对此系统再次进行了测试，结果标绘于图10所示的曲线中。这时的铁氧体环具有下述尺寸外径=23.6mm，内径=13.4mm，高=7.6mm。将40SWG漆包铜线的120匝线圈绕到此环上并涂以厚的环氧树脂层(L=880μH,R=4.6Ω,fo=206KHz而C=680pF)。
当将此线圈用于图3中的PLL电路中时，再次获得了对磁粒子数的良好线性反应。此线圈的灵敏度约为0.3Hz/105粒子，低于图7中椭圆形线圈结构的灵敏度。但此线圈装置的性能，可以通过采用能够与这种用途更好配合的铁氧体材料且具有宽度(约0.25mm)刚好足以接纳此样品的较窄环隙，得到改进。
还可以采用以圆形或方形螺旋装置为基础的全扁平线圈(图11A与11B)。这种设计比前述装置有许多优越之处。此种线圈可以与样品紧密接触而减小样品与线圈间的静区，而且能用光刻法或类似技术大规模生产有重显性的线圈。要是将两个线圈串联而将样品与它们相互面对的方式置于其间，则当样品中存在顺磁粒子时将增大此线圈对的电感。
正如以前所述，这种线圈一般是在约200～300KHz间的频率下工作。这种频率范围当电路结合其中含有大量悬浮于水性缓冲液的PMP的瓶子使用时，已由试验证明乃是最佳的工作频率范围。但水的存在会使此电路在较高频率下工作时的稳定性差。
业已发现，在极高的频率下能工作得更好。图12示明以椭圆形剖面的线圈在529KHz下工作时的电路响应。
在上述情形下，当线圈是在217KHz下工作时，与0.4Hz/105粒子相比，灵敏度增加到1.2Hz/105。一般性的技术表明，在更高的频率下可以提高灵敏度。但图5中的VCO电路却不能可靠地在远高于519KHz的频率下工作，这是由于所用到的一些部件受到了限制。为使其能在较高的频率下工作，就必须采用能在这种频率下工作的部件来改进此电路。
为了证明这种顺磁粒子探测器具有实用性，用PMP为标记开发了一种模型试验系统。此系统是基于用于铁传递蛋白的双抗体夹层试验的。将这种模型试验发展成能使免疫反应发生于塑料膜的表面上，同时能将测试区域容易地引到此探测器上。用于探测固定的免疫复合物的标记是涂有适当抗体的PMP，这于图13中示意地表明。
使不同抗体层的浓度最优化，以在工作的铁传递蛋白范围给出最大的响应。对此模型试验产生出剂量响应曲线，用显微镜的手工计数和用探测器两种方法确定磁粒子的数量。
先前的结果表明，铁传递蛋白剂量响应曲线的上部区域(约有1.3×105粒子)处在磁探测器的下部校准范围内，而在由手工计数测定的测试塑料片上所结合的PMP数与用磁探测器测定的数之间有良好的一致性。
权利要求
1．一种用具有电容器与线圈的调谐电路测定样品中磁粒子数的方法，此方法包括a)测定样品暴露于此线圈产生的磁场下和样品未暴露于此线圈产生的磁场下时所述调谐电路的谐振频率差；b)利用此谐振频率差来确定样品中的磁粒子数。
2．根据权利要求1所述的方法，其中的步骤a)包括ⅰ)将样品暴露于该线圈产生的磁场下；ⅱ)测定此调谐电路的谐振频率；ⅲ)从该线圈产生的磁场中取出样品；ⅳ)测定此调谐电路的谐振频率。
3．根据权利要求2所述的方法，其中用于测定谐振频率的步骤包括a)给此调谐电路施加驱动信号；b)测量此驱动信号与自该调谐电路得到的输出信号间的相位差；c)调节所加驱动信号的频率直到它与该输出信号间不存在相位差。
4．根据权利要求3所述的方法，其中所述驱动信号具有高于200KHz的频率。
5．根据上述任一项权利要求所述的方法，其中所述磁粒子包括PMP。
6．根据上述任一项权利要求所述的方法，其中所述线圈是螺线管、环形线圈与扁平线圈中之一。
7．根据权利要求6所述的方法，其中当线圈是螺线管时，所述将样品暴露于磁场下的方法包括将样品置于此螺线管内。
8．根据权利要求6所述的方法，其中当线圈是扁平线圈时，所述方法包括将样品置于此线圈的邻边。
9．一种进行结合试验的方法，此方法包括a)将分子层固定于基片上；b)提供许多磁粒子作为标记；c)应用此分子层进行反应，使至少将某些磁粒子结合到基片上；d)通过测定基片暴露和不暴露于线圈产生的磁场下两种情形中调谐电路的谐振频率差，来测定结合到此基片上的磁粒子数。
10．根据权利要求9所述的方法，其中所述磁粒子是结合到相应个数的第二种分子上，而所述反应则将此第二种分子与该分子层粘合从而将磁粒子结合到基片上。
11．根据权利要求10所述的方法，其中所述结合试验是免疫测定试验，所述分子层是抗体/抗原层而所述第二种分子是抗原或抗体。
12．根据权利要求9～11中任一项所述的方法，其中所述基片包括塑料片。
13．根据权利要求9～12中任一项所述的方法，其中所述线圈是螺线管、环形线圈与扁平线圈中之一。
14．根据权利要求9～13中任一项所述的方法，其中所述测定磁粒子数的方法包括依据权利要求1～8中任一项所述的方法。
15．一种测定样品中磁粒子数的设备，此设备包括a)具有电容器与线圈的调谐电路；b)产生用于驱动调谐电路的驱动信号的驱动器；c)探测此调谐电路谐振频率的探测器，其中当样品暴露和不暴露于该线圈产生的磁场下两种情形中调谐电路的谐振频率差，表示此样品中的磁粒子数。
16．根据权利要求15所述的设备，其中所述探测器包括用来测定此驱动信号与从该调谐电路获得的输出信号之间相位差的相位比较器。
17．根据权利要求15或16所述的设备，其中所述驱动器包括压控振荡器(VCO)。
18．根据权利要求17所述的设备，其中当从属于权利要求时，所述VCO响应上述相位比较器，改变驱动信号的频率至不存在相位差时。
19．根据权利要求15～18中任一项所述的设备，其中此设备形成锁相环振荡器电路。
20．根据权利要求15～19中任一项所述的设备，其中所述磁粒子是PMP。
21．根据权利要求15～20中任一项所述的设备，其中所述线圈是螺线管、环形线圈与扁平线圈中之一。
22．根据权利要求21所述的设备，其中当线圈是形成于基本为平面上的扁平线圈时，将此样品置于此线圈邻近使样品暴露于磁场之下。
23．根据权利要求21所述的设备，其中当线圈是螺线管时，将此样品置于螺线管内使样品暴露于磁场之下。
24．根据权利要求23所述的设备，其中所述螺线管具有椭圆形横剖面。
25．根据权利要求21所述的设备，其中当线圈为环形线圈时，将此样品置于此环形线圈的环隙中使此样品暴露于磁场之下。
26．根据权利要求15～25中任一项所述的设备，其中所述驱动信号具有高于200KHz的频率。
全文摘要
应用具有电容器(C)与线圈(L)的调谐电路测定样品中磁粒子数的方法。此方法包括a)测定样品暴露于和不暴露于此线圈产生的磁场下时两种情形中的调谐电路的谐振频率差；b)利用此谐振频率差来测定样品中的磁粒子数。
文档编号G01N33/543GK1317693SQ0111636
公开日2001年10月17日 申请日期2001年4月10日 优先权日2000年4月10日
发明者彼得·霍金斯, 理查德·威廉·勒克司顿 申请人:兰道克斯实验有限公司