专利名称：毛细管电泳中的连续样品注射的制作方法
背景技术：
核酸测序和从测序反应中分离多核苷酸过程的自动化使得多种目的核酸的快速和大规模测序得以实现。通常，核酸测序通过在测序反应中掺入标记有荧光基团或染料的链终止核苷酸来进行。不同大小的核酸产物通过凝胶电泳分离，并在自动测序仪上检测。正在进行的大规模核酸测序项目要求核酸测序过程尽可能高效。然而，现有的核酸测序方法受到电泳步骤的限制。
现有的方法不能使通过自动化电泳技术分离和检测的测序多核苷酸产生的有用数据量最大化。使用毛细管电泳一般需要15到40分钟才能使样品中的第一个核酸片段分离，生成峰形式的有用数据。没有有用数据产生的这段起始时间被称为“样品死时间”，时间长度随核酸片段的大小和电泳进行的条件而异。
另一个对现有的基于毛细管凝胶电泳的多核苷酸测序方法产生有用数据的限速因素是，凝胶在每个样品通过电泳被分离和鉴定后需要冲洗和替换新的凝胶。在通常的自动化毛细管凝胶电泳系统中，每个完整的循环中冲洗步骤需大约10分钟。因此，电泳运行一次需进行35到150分钟，而有用的数据只在该电泳运行的约10到100分钟内收集。
需要降低样品死时间和提高核酸样品电泳效率的电泳方法，来使大规模核酸测序项目得以更迅速而且全面低成本的进行。
发明概述本发明满足上述需要。本发明是进行电泳的方法，其能增加样品通量并通过提高自动化毛细管凝胶电泳的负载循环而增加多核苷酸分析的效率和速度。该方法包括提供毛细管电泳体系。该毛细管电泳体系包括有上样端和洗脱端的毛细管电泳凝胶。选择一个以上的样品。每个样品通常含有不同大小的多核苷酸的混合物，各个多核苷酸有与其大小相应的电泳迁移率。样品中最小的多核苷酸有最快的电泳迁移率，而最大的多核苷酸有最慢的电泳迁移率。第一样品在时刻TO上样到凝胶的上样端，当进行电泳时在该第一样品中电泳迁移率最快的多核苷酸在时刻TF通过检测窗口，而电泳迁移率最慢的多核苷酸在TS时刻之前通过检测窗口。对该第一样品进行电泳。第二样品在(TS-TF)时刻上样到凝胶的上样端，对第二样品进行电泳以使第一样品中电泳迁移率最慢的多核苷酸比第二样品中电泳迁移率最快的多核苷酸早通过电泳体系的检测窗口。第三样品在2(TS-TF)时刻上样到凝胶的上样端，对第三样品进行电泳以使第二样品中电泳迁移率最慢的多核苷酸比第三样品中电泳迁移率最快的多核苷酸早通过电泳体系的检测窗口。该方法还包括在n(TS-TF)时刻连续上样另外的样品到凝胶的上样端的步骤，其中n为3-25的整数。来自各样品的多核苷酸当其通过检测窗口时被检测。在一个实施方案中，该方法同时在一个以上毛细管凝胶中对一个以上样品进行。
附图本发明的这些特征、方面和优势，结合下面的说明书、权利要求书和附图将可以更好地理解，其中
图1测序反应运行的带有大小从54到294个碱基长度的标记片段的PCR产物的电泳谱图；图2图示本发明实施方案的含复合的数个样品运行的单个电泳谱图；图3对图1所述的PCR产物在一个毛细管中运行的12个连续注射产生的电泳谱图；以及图4图示本发明方法与现有技术通常方法相比效率的提高。
发明详述下述的讨论描述本发明的实施方案和这些实施方案的一些变体。本讨论不应视为将本发明限制在这些特定实施方案。本领域的技术人员还会认可若干其他的实施方案。在这里描述的所有实施方案中，被指称为优选或特别优选的这些实施方案尽管其可能是优选的，但并不是必不可少的。
本发明是提高样品通量和允许更多的样品在给定的时间段内被处理的电泳方法。该方法的第一步骤是提供带有电泳凝胶的电泳体系。在优选的实施方案中，电泳凝胶是毛细管凝胶。该毛细管电泳凝胶包括上样端和洗脱端。在示例性的实施方案中，毛细管凝胶长度约10cm到约100cm，凝胶的含量为1％到10％的聚丙烯酰胺聚合物。
选择一个以上的样品。每个样品通常含有不同大小的多核苷酸，并具有与多核苷酸大小对应的电泳迁移率。样品中最小的多核苷酸有最快的电泳迁移率，而最大的多核苷酸有最慢的电泳迁移率。
含多核苷酸的样品通常包含DNA片段。在优选的实施方案中，多核苷酸是测序反应的产物。在该实施方案中，不同大小的多核苷酸通常通过测序反应中的链终止核苷酸产生。链终止核苷酸标记有对各核苷酸特异的染料或荧光基团。其他的多核苷酸，包括RNA和修饰的核酸也可使用。通常，DNA片段的长度范围为约20到约800个核苷酸。或者，样品还可以包含其他的生物分子，如蛋白质，其能通过电泳被分离。用PCR扩增子作为模板产生的测序反应产物通过毛细管电泳分离的实例见于图1。
本方法的下一步骤是在To时刻将第一样品上样到凝胶的上样端。这一步骤可以通过自动化手段进行，例如包括动电注射。在第二样品上样到凝胶的上样端之前的预定时刻，对第一样品进行电泳。第二样品和所有后续样品的注射时间通常是预知的或在通过在设定的电泳运行条件下试运行和考虑样品中多核苷酸大小的差异而预定的，该试验运行。对第一样品进行电泳，第一样品中电泳迁移率最快的多核苷酸在TF时刻通过检测窗口，而第一样品中电泳迁移率最慢的多核苷酸在TS时刻之前通过检测窗口(图2)。
在第二样品上样到凝胶上样端前的预定时刻，对第一样品进行电泳。第一样品的多核苷酸向毛细管凝胶的洗脱端迁移，在那里被检测器检测。第二样品上样到凝胶的上样端的步骤在某时刻进行，该时刻使第一样品中迁移率最慢的多核苷酸比第二样品中迁移率最快的多核苷酸早通过电泳体系的检测窗口。对第二样品进行电泳，以使第一样品中迁移率最慢的多核苷酸比第二样品中迁移率最快的多核苷酸早通过电泳体系的检测窗口。在优选的实施方案中，第二样品在(TS-TF)时刻上样，或在等同于(TS-TF)时刻后检测一个峰宽的时刻进行，以防止第一样品的最后峰和第二样品的第一个峰共同迁移。因此，第二样品通常在(TS-TF)时刻上样或(TS-TF)时刻加等同于检测一个峰宽的时间上样。等同于检测一个峰宽的时间根据样品和电泳运行条件而异，例如在1-30秒，及更通常的在1-10秒，及更更通常在1-5秒。这些时间可根据样品的大小和运行条件而变化。时间点To，TF，TS等的微小变动是可接受的，只要防止样品在检测时重叠的整体目标没有被损害。
在优选的实施方案中，本方法包括在2(TS-TF)时刻将第三样品上样到凝胶上样端的下一步骤。对第三样品进行电泳，并使第二样品中迁移率最慢的多核苷酸比第三样品中迁移率最快的多核苷酸早通过电泳体系的检测窗口。
在优选的实施方案中，本方法还包括连续地在n(TS-TF)时刻上样另外的样品到凝胶的上样端的其他步骤，其中n是3到25的整数，(n-1)代表样品数。通常，n在3到12。
本方法的最后步骤是检测各样品的多核苷酸。在优选的实施方案中，电泳在自动化的系统中进行，如Beckman CEQ 2000DNA分析系统(Beckman Coulter，Inc.，Fullerton)。Beckman CEQ 2000DNA分析系统在多核苷酸通过检测窗口时检测多核苷酸。第一样品的多核苷酸的检测与第二样品的多核苷酸的电泳同时进行。类似的，第二样品的多核苷酸的检测与第三样品的多核苷酸的电泳同时进行。
因此，本发明的方法消除了第一样品之外的所有样品的死时间。这可以使多个样品在每个样品单独运行所需时间的一小部分内进行电泳。
在示例性的实施方案中，在同一毛细管电泳凝胶中不经冲洗或替换毛细管凝胶最多可进行总计25次运行，以致同一毛细管聚丙烯酰胺凝胶可对所有样品进行电泳。更通常的，12到16个样品，或8到12个样品，连续地在同一毛细管凝胶中不经冲洗或替换毛细管凝胶进行电泳。
在优选的实施方案中，在多个毛细管凝胶中对多个样品同时进行电泳。该方法包括下列步骤a)提供含毛细管电泳凝胶的电泳体系，凝胶具有上样端和洗脱端；b)选择一种以上的样品，每个样品包含不同大小的多核苷酸，并具有与其大小相对应的电泳迁移率，其中样品中最小的多核苷酸电泳迁移率最快而最大的多核苷酸电泳迁移率最慢；c)将第一样品上样到凝胶的上样端；d)对第一样品进行电泳以分离多核苷酸；在步骤d后，在某时刻将第二样品上样到凝胶的上样端，该时刻使得第一样品中电泳迁移率最慢的多核苷酸比第二样品中电泳迁移率最快的多核苷酸早通过电泳体系的检测窗口；及f)对第二样品进行电泳；g)检测来自各样品的多核苷酸。在示例性实施方案中，电泳体系包括约2到约100个毛细管电泳凝胶，电泳在2个或更多的毛细管凝胶上同时进行。不过，包含超过100个毛细管电泳凝胶的电泳体系仍属于本发明的范围。
本发明的方法可以视为提供了通过降低自动化毛细管凝胶电泳的负载循环能降低样品死时间和提高电泳过程速度和效率的电泳方法。
实施例I每个毛细管凝胶进行12个连续样品注射利用Beckman CEQ 2000DNA分析系统(Beckman Coulter，Inc.，Fullerton)在8个不同的毛细管凝胶上进行电泳。每个毛细管凝胶被连续上样12个由测序反应产生的DNA片段样品。该片段通过BeckmanCoulter染料标记的双脱氧-终止子循环测序试剂盒，零件编号608000，(Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA)，产生。该模板是从人乳头瘤病毒产生的294个碱基对的PCR复制子。
分离介质由高分子量的聚丙烯酰胺聚合物的30mM TRIS和100mM TAPS([2-羟基-1，1双[羟甲基]乙基]氨基)1-丙烷磺酸)缓冲液组成。
样品以动电方式在2kV下注射到30cm长的充满凝胶的毛细管中15秒，而分离在6kV下进行。总共96个样品在8个毛细管凝胶中分析。一个毛细管的电泳谱图见于图3。在电泳谱图上4种核苷酸各自表示为不同颜色，179分钟内96个样品被分析和检测产生大约23,040个被叫碱基(called base){12×8×(294-54)}。该凝胶没有用新的凝胶替换，且毛细管凝胶在样品运行时没有重新排列。通过常规的方法进行相似的分析需进行大约432分钟。因此，对该样品而言，本方法只用了现有技术方法检测和分析多核苷酸所需时间的42％。
实施例II每个凝胶超过12个连续样品注射的预计通量增加图4显示图1和图3中示例的通量最高达每个毛细管25个连续样品注射的预计增加。利用常规的方法对n个样品进行电泳分析的时间量为36n，其中36是系统预热时间13分钟，死时间13分钟，及样品时间13分钟的总和。总的死时间是23n，其包括每个样品10分钟系统预热时间和13分钟死时间。反之，利用本发明的方法，对每个毛细管样品而言，随着运行次数增加，死时间和样品准备时间接近零，而通量时间只为13n。计算的通量增加因子(TIF)为36N/13N＝约2.8。因此，对大量的注射而言，建议的方法比常规方法快2.8倍。图2显示本发明方法与常规方法比较进行多样品注射预计的时间。
根据如上描述的本发明，显而易见，在不偏离如上所述和如下文权利要求所述的本发明的范围和本意的情况下可采取很多的修饰和调整。
尽管本发明以相当详细的程度参照其特定的优选形式进行了描述，其他的形式也是可行的。因此权利要求书的实质和范围不应限于此处描述的优选形式。
在说明书中公开的所有特征，包括权利要求书、摘要和附图，及公开的任何方法中的所有步骤，可以以任何组合方式组合，除了至少一些这样的特征和/或步骤是相互排斥的组合之外。除非另有说明，说明书中公开的每个特征，包括权利要求书、摘要和附图可以用实现相同、等同或相似目的的替代特征替换。因此，除非另有说明，公开的每个特征只是一系列等同或相似特征的一个示例。
权利要求
1.一种进行电泳的方法，该方法包括下列步骤a)提供含毛细管电泳凝胶的电泳体系，该凝胶具有上样端和洗脱端；b)选择一种以上样品，每个样品包含不同大小的多核苷酸，并具有与其大小相对应的电泳迁移率，其中样品中最小的多核苷酸电泳迁移率最快而最大的多核苷酸电泳迁移率最慢；c)在To时刻将第一样品上样到凝胶的上样端，其中当进行电泳时，在该第一样品中电泳迁移率最快的多核苷酸在TF时刻通过检测窗口，而电泳迁移率最慢的多核苷酸在TS时刻之前通过检测窗口；d)对第一样品进行电泳；e)第二样品在(TS-TF)时刻上样到凝胶的上样端，对第二样品进行电泳以使第一样品中电泳迁移率最慢的多核苷酸比第二样品中电泳迁移率最快的多核苷酸早通过电泳体系的检测窗口；f)第三样品在时刻2(TS-TF)上样到凝胶的上样端，对第三样品进行电泳以使第二样品中电泳迁移率最慢的多核苷酸比第三样品中电泳迁移率最快的多核苷酸早通过电泳体系的检测窗口；g)在n(TS-TF)时刻连续上样更多的样品到凝胶的上样端，其中n是4到25的整数，以及其中对每个样品进行电泳，以使每个在前样品中电泳迁移率最慢的多核苷酸比每个后续样品中电泳迁移率最快的多核苷酸早通过检测窗口；和h)当各样品的多核苷酸通过检测窗口时进行检测。
2.一种进行电泳的方法，该方法包括下列步骤a)提供含毛细管电泳凝胶的电泳体系，该凝胶具有上样端和洗脱端；b)选择一种以上样品，每个样品包含不同大小的多核苷酸，并具有与其大小相对应的电泳迁移率，其中样品中最小的多核苷酸电泳迁移率最快而最大的多核苷酸电泳迁移率最慢；c)将第一样品上样到凝胶的上样端；d)对第一样品进行电泳以分离多核苷酸；e)在步骤d之后，将第二样品在某时刻上样到凝胶的上样端，该时刻使得第一样品中电泳迁移率最慢的多核苷酸比第二样品中电泳迁移率最快的多核苷酸早通过电泳体系的检测窗口；f)对第二样品进行电泳；g)检测每个样品的多核苷酸。
3.一种进行电泳的方法，该方法包括下列步骤a)提供含一个以上毛细管电泳凝胶的电泳体系，每个凝胶具有上样端和洗脱端；b)对每个毛细管电泳凝胶选择一种以上样品，每个样品包含不同大小的多核苷酸，并具有与其大小相对应的电泳迁移率，其中样品中最小的多核苷酸电泳迁移率最快而最大的多核苷酸电泳迁移率最慢；c)在To时刻将一个以上第一样品上样到一个以上凝胶的上样端，其中当进行电泳时，在该第一样品中电泳迁移率最快的多核苷酸在TF时刻通过检测窗口，而电泳迁移率最慢的的多核苷酸在TS时刻之前通过检测窗口。d)对第一样品进行电泳；e)将一个以上第二样品在(TS-TF)时刻上样到凝胶的上样端，并对第二样品进行电泳，以致第一样品中电泳迁移率最慢的多核苷酸比第二样品中电泳迁移率最快的多核苷酸早通过电泳体系的检测窗口；f)第三样品在2(TS-TF)时刻上样到凝胶的上样端，对第三样品进行电泳以使第二样品中电泳迁移率最慢的多核苷酸比第三样品中电泳迁移率最快的多核苷酸早通过电泳体系的检测窗口；g)在n(TS-TF)时刻连续上样更多的样品到凝胶的上样端，其中n是4到25的整数；h)当各样品的多核苷酸通过检测窗口时进行检测。
4.权利要求1的方法，其中对一个以上样品在一个以上毛细管凝胶中同时进行电泳。
5.权利要求1，2或3的方法，其中样品含有包括DNA片段的多核苷酸。
6.权利要求5的方法，其中DNA片段的大小为20到800个核苷酸长。
7.权利要求1，2或3的方法，其中该方法在自动化系统中进行。
8.权利要求1的方法，其中总共有4到16个样品在同一毛细管电泳凝胶中连续进行电泳。
9.权利要求8的方法，其中总共有6到12个样品在同一毛细管电泳凝胶中连续进行电泳。
10.权利要求1，2或3的方法，其中电泳体系还包括2到约100个毛细管电泳凝胶，且电泳在2个或更多个毛细管凝胶上同时进行。
11.权利要求2的方法，其中步骤f)后该方法还包括单独且连续地将3到12个样品上样到凝胶的上样端，并对各个样品进行电泳，以致每个在前的样品中电泳迁移率最慢的多核苷酸比每个后续样品中电泳迁移率最快的多核苷酸早通过检测窗口。
12.权利要求2的方法，其中在第二样品上样前对第一样品的电泳进行预定的最少时间(Tx)。
13.权利要求2的方法，其中第二样品在预定的最少时间之后及预定的最多时间之前上样。
14.权利要求2的方法，其中该方法在自动化系统中进行。
全文摘要
本发明公开一种电泳方法，其能增加样品通量和提高多核苷酸电泳分析的效率和速度。该方法为在每个毛细管凝胶中上样和运行多个连续的样品，无需在样品之间进行冲洗或替换凝胶。
文档编号G01N27/447GK1723390SQ200380102009
公开日2006年1月18日 申请日期2003年10月24日 优先权日2002年10月25日
发明者克拉伦斯·卢, 斯特芬·L·小彭托尼, 杨大伟 申请人:贝克曼考尔特公司