专利名称：用于控制板蓝根及其制剂质量及药效的指纹图谱及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用板蓝根抗病毒活性部位的指纹图谱来控制板蓝根及板蓝根制剂质量的技术。
背景技术：
板蓝根为十字花科植物菘蓝的根，具有清热解毒、凉血利咽之功效，用于病毒性感染。《中国药典》及卫生部颁标准记载的板蓝根及其制剂的质量控制方法均采用鉴别氨基酸和荧光的有无来控制内在质量。这种荧光和氨基酸的鉴别反应又难于达到控制其内在质量的目的，因为，其中的两项鉴别反应无法肯定制剂中所使用的药材是来自于基源植物菘蓝，表现在A，荧光反应绝大多数植物均有；B，氨基酸为广谱成分，几乎是所有的植物均含有氨基酸。
文献对板蓝根及其制剂的质量控制也有所研究，但其研究的内容均集中于靛蓝和靛玉红的HPLC和TLC分析上，如《中国中药杂志》1990(5)31-33；《沈阳药科大学学报》2000，17(3)191-192；《中药新药与临床药理》19967(2)43-44；《天津药学》1994，6(3)30-33，由于板蓝根制剂包括板蓝根颗粒、板蓝根注射液、板蓝根片、抗病毒口服液、清开灵系列等均采用水煎醇沉法，生产工艺中保留的是水溶性的成分，靛蓝、靛玉红的保留率极低，如《中成药1990，12(9)8-9》报导＜10％。因而文献报道的方法也难于反映板蓝根及其制剂的质量。
中国专利申请号01119925.3的一种《丹参药材指纹图谱的建立的方法》对丹参水溶性提取物建立起来的高效液相色谱仪的指纹图谱，这种对丹参质量检测是有效的，但对含有完全不同成分的另一种药材来说则是无效的。
化学指纹图谱是一种适合中药特点的质量控制技术，近几年来，很多中药都进行了指纹图谱的研究。陈勇等报道了板蓝根指纹图谱[中医药学报，2003，31(3)18-19]，但没有说明该指纹图谱反映的是哪种成分部位及与板蓝根的抗病毒活性是否相关。
从以上所述可以看出，目前板蓝根及其制剂的质量还没有真正可控制的技术，不能有效的判断板蓝根制剂中板蓝根药材的有无，不能区别不同来源不同产地的板蓝根药材及评价其质量的优劣。
发明内容
本发明的目的是提供一种表征板蓝根及其制剂质量及药效的指纹图谱，它可使板蓝根及其制剂的质量有了真正可控制的标准，以及确立该指纹图谱的制作方法。
本发明通过对板蓝根药材进行组份的分离和活性筛选，从中获得一种具有显著抗病毒活性的提取物，该提取物为首次从板蓝根中提取分离得到，其抗病毒活性明显强于板蓝根中的其它部位，其抗病毒活性的结果如表1所示。板蓝根抗病毒活性部位的确定(1)、按细胞毒性实验方法进行试验，结果表明各部分在最大实验浓度下均无毒性反应。
(2)、抗甲型流感病毒实验将已长48h的MDCK倒掉细胞培养液，备用。每种药物按以下方式加样取一支试管，加入0.4ml药物(已消毒灭菌)+3.6ml维持液，混匀。分别按0.9ml，0.5ml，0.25ml各种4支试管，后八支试管各补加0.4ml及0.65ml维持液，最后总量为0.9ml；另准备4支试管单纯加入0.9ml维持液，作为病毒对照。以上实验管分别接种HA为1∶64的流感163株病毒培养液(-40℃保存)0.1ml。接种后于33℃温箱培养48h、72h，测定HA。结果见表1。根据血细胞凝集程度的不同来进行判断，以“++”为终点，即观察到红细胞在孔底形成一个环状，四周有小凝集块，以此为标准测定血凝滴度。判断结果时如果药物实验组血凝滴度为病毒对照组的1/4以下，即说明药物对病毒增殖有抑制作用。
表1培养72h后测定HA的结果
“#”为完全病变(++++)；病毒株为粤防-9220，病毒效价为1∶64表1结果表明，对甲型流感病毒在作用72h后，核苷部位能显著的抑制病毒生长，其抗病毒效果明显强于其它成分部位，其低浓度(相当于12.5mg/ml生药)的抑制作用和阳性药的抗病毒效果相当；从而确定该部分为板蓝根的抗病毒活性部位。
本发明的技术解决方案是这样来完成的，本发明用板蓝根中的抗病毒活性部位制作指纹图谱，该活性部位以核苷类为主要组成部分，其中已知的核苷类成分有腺苷、尿苷、鸟苷。
以上所述板蓝根活性部位指纹图谱中，包含有10个左右的色谱峰，各色谱峰的峰值大小和比值依板蓝根的来源和产地而异，其紫外最大吸收在240nm～280nm之间。
本发明所述的10个左右的色谱峰中，9号峰为腺苷、8号峰为鸟苷、6号峰为尿苷。
本发明板蓝根核苷类活性部位的指纹图谱制作方法，它是以液相色谱法作为指纹图谱的制作方法，即以C18柱为色谱柱，以乙腈-水为流动相，梯度洗脱，以240nm～280nm检测波长。在上述条件下，分别吸取对照样品溶液，即腺苷、尿苷、鸟苷溶液，和板蓝根及其制剂的供试品溶液各5mL注入高效液相色谱仪，进行分析，制作板蓝根中的具有抗病毒活性部位指纹图谱。
以上所述洗脱为梯度洗脱，或者是等梯度洗脱。
本发明的制作方法中所指对照品溶液为，取腺苷、尿苷、鸟苷各10mg，置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，量取2mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
本发明的制作方法中所指板蓝根及其制剂的供试品溶液为，取板蓝根药材粉末1.0g，加蒸馏水50ml，超声提取30min，滤过，取续滤液20ml，蒸干，甲醇溶解并定溶成10ml，即得板蓝根及其制剂抗病毒活性部位的供试品溶液。
取不同产地来源板蓝根药材或制剂粉末等量混合均匀，按上述方法制作指纹图谱，即是板蓝根药材或制剂的混批样品的抗病毒活性部位指纹图谱，它可代表板蓝根药材或制剂的质量平均水平。
本发明通过体外抗病毒实验筛选得到了板蓝根中具有抗病毒活性的活性成分部位(注活性部位是指某一类成分的活性部位，如生物碱类活性部位，核苷类活性部位等)，该活性部位为核苷类，通过对该活性部位的成分进行分离和结构鉴定，发现，该核苷类活性部位中含有已知的核苷成分腺苷、尿苷和鸟苷。随后，分别以腺苷、鸟苷和尿苷或三者为对照(参照物)，通过高效液相色谱(HPLC)方法建立了该核苷类活性部位的指纹图谱，并对其中的成分进行了紫外(UV)光谱识别，各色谱峰的UV最大吸收波长均在240-280nm内，证实了该活性部位的主要成分为核苷类。该指纹图谱中有10个左右的色谱峰，各色谱峰的组成、峰值大小和比值依板蓝根的来源和产地而异。通过对板蓝根药材或其制剂活性部位指纹图谱的制作以及结合指标成分(如腺苷)的定量分析结果，可以综合评价板蓝根及其制剂的质量。即某一来源的板蓝根药材或制剂的活性部位指纹图谱中各色谱峰的组成、峰值大小和比值代表了该板蓝根中核苷类活性成分的组成、各组成成分的量的多少和它们之间的相对比值(定性分析)。并通过已知成分(如腺苷等)的定量分析，可以以数据的形式表明其中已知成分的含量，从其含量高低也能反映板蓝根的质量。这种通过某一板蓝根核苷活性部位的指纹图谱的整体特征结合已知成分的定量分析和板蓝根混批的指纹图谱(代表平均质量水平)的进行比较，即可以评价其质量的优劣。
本发明的优点是通过建立板蓝根活性部位的指纹图谱，结合指标成分的定量分析结果，可以综合评价板蓝根及其制剂的质量、药效，使其板蓝根及其制剂的质量有了真正可控制的标准。本发明制作该指纹图谱的方法操作简单、准确可靠、适于在板蓝根及其制剂的质量控制方面使用。
图1本发明对照品腺苷的用LC色谱2不同产地板蓝根药材混批样品的活性部位指纹图谱(代表平均质量水平)图3以混批样品、药典法定工艺制作的板蓝根颗粒等制剂的活性部位指纹图谱图4混批样品中10个色谱峰的紫外光谱5安徽某地产的板蓝根药材的活性部位指纹图谱图6东北某地产的板蓝根药材活性部位指纹图谱图7四川某地产的板蓝根药材的活性部位指纹图谱图8河北某地产的板蓝根药材的活性部位指纹图谱图9广东某厂产的板蓝根颗粒的活性部位指纹图谱图10四川某厂产的板蓝根颗粒中活性部位指纹图谱
具体实施例方式
本发明板蓝根活性部位指纹图谱的建立供试品溶液和对照品(参照物)溶液的制备精密称取板蓝根药材粉末1.0g，加蒸馏水50ml，超声提取30min，滤过，取续滤液20ml，蒸干，甲醇溶解定容成10ml，即得板蓝根药材活性部位的供试品溶液；或精密称取板蓝根颗粒5.0g(或板蓝根流浸膏0.5g)，以20ml甲醇-丙酮任意比例的混和溶剂超声提取30min，滤过，取续滤液10ml，蒸干，以甲醇溶解并定容成10ml，即分别制得板蓝根流浸膏和板蓝根颗粒活性部分的供试品溶液。
分别精密称取参照物(腺苷、鸟苷、尿苷)各10mg，置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取2mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释置刻度，摇匀，即得(每1mL中含各对照品80μg)。
指纹图谱的建立Agilent1100系列高效液相色谱仪，Agilent自动进样器，Agilent DAD检测器；ODS C18色谱柱(10um，250×4.6mm)；乙腈(色谱醇)，美国Tedia公司；水为乐百氏纯净水。色谱柱依利特C18柱(10μm，4.6mm×250mm)；流动相∶乙腈(A)-水(B)梯度洗脱25min。0-5min，保持A∶B＝(1∶99)，流速0.6mL/min；5-6min，仍保持A∶B＝(1∶99)，流速线性上升为0.8mL/min；6-25min，A线性上升至78％，流速0.8ml/min.检测波长260nm。
在上述条件下，分别吸取对照品溶液(参照物溶液)和供试品溶液各5mL注入高效液相色谱仪，进行分析，制作指纹图谱。板蓝根活性部位的指纹图谱如图1所示。结果表明，该图谱中具有10个明显的色谱峰，其UV最大吸收分别在240nm～280nm之间。其中，9号峰为腺苷，8号峰为鸟苷，6号峰为尿苷。
实施例1取安徽某地产的板蓝根药材，研成粉末，取粉末1.0g，加蒸馏水50ml，超声提取30min，滤过，取续滤液20ml，蒸干，甲醇溶解定容成10ml，按上述的色谱方法进行分析，制作该药材的指纹图谱，同时，定量分析其中的腺苷、鸟苷和尿苷的含量，其指纹图谱如图2所示。腺苷、鸟苷和尿苷的含量分别为472、98和363μg/g.该产地的药材活性部位中腺苷和尿苷的含量较高，2、5、6、7、8、9、10号峰峰值大，非常明显，为图谱中的主要色谱峰。除1，3号色谱峰外，其它色谱峰均高于平均质量水平的板蓝根(见图2，5)，且三个已知的指标成分(腺苷、尿苷、鸟苷)的含量均高于平均水平，因而，从该地板蓝根核苷类活性部位指纹图谱的整体特征及各色谱峰的峰值和板蓝根混批的指纹图谱(示平均质量水平，见图2)比较，可以说明，该地板蓝根中核苷类活性部位中各成分的含量相对较高，从而表明，该产地的板蓝根质量较好。
实施例2取东北某地产的板蓝根药材，研成粉末，取粉末1.0g，加蒸馏水50ml，超声提取30min，滤过，取续滤液20ml，蒸干，甲醇溶解定容成10ml，按上述的色谱方法进行分析，制作该药材的指纹图谱，同时，定量分析其中的腺苷、鸟苷和尿苷的含量，其整个指纹图谱特征如图6所示。腺苷和尿苷的含量分别为132和326μg/g，鸟苷检测不到.从该产地的药材活性部位指纹图谱的整体特征看，峰值大的色谱峰少，相对而言，图谱中以尿苷的含量较高，2、6、9号峰峰值大、明显，为图谱中的主要色谱峰，但其峰值低于平均水平；其余的色谱峰不明显，其峰值也显著低于平均水平。从整体特征以及定量分析结果可以说明，该产地板蓝根的质量差。
实施例3取四川某地产的板蓝根药材，研成粉末，取粉末1.0g，加蒸馏水50ml，超声提取30min，滤过，取续滤液20ml，蒸干，甲醇溶解定容成10ml，按上述的色谱方法进行分析，制作该药材的指纹图谱，同时，定量分析其中的腺苷、鸟苷和尿苷的含量，其指纹图谱如图7所示。腺苷、鸟苷和尿苷的含量分别为236、82和123μg/g.该产地的药材活性部位中以腺苷的含量相对较高，各色谱峰的峰值均较小，活性成分的含量低。从该产地的药材活性部位指纹图谱的整体特征看，各色谱峰峰值均较小，相对而言，图谱中以腺苷的含量较高，2、6、7、8、9、10号峰明显，为图谱中的主要色谱峰，但其峰值低于平均水平；其余的1、3、4、5号色谱峰不明显，其峰值也显著低于平均水平。从该产地板蓝根活性部位指纹图谱的整体特征以及定量分析结果可以说明，该产地板蓝根的质量非常差。
实施例4取河北某地产的板蓝根药材，研成粉末，取粉末1.0g，加蒸馏水50ml，超声提取30min，滤过，取续滤液20ml，蒸干，甲醇溶解定容成10ml，按上述的色谱方法进行分析，制作该药材的指纹图谱，同时，定量分析其中的腺苷、鸟苷和尿苷的含量，其指纹图谱如图8所示。腺苷、鸟苷和尿苷的含量分别为496、149和113μg/g.该产地的药材活性部位中以腺苷的含量较高，鸟苷和尿苷的含量相当，图谱中，以1、2、3、4、9号峰为主要色谱峰，5、6、7、8号峰峰值也较明显，10号峰非常小。除10号色谱峰外，其它色谱峰均高于平均质量水平的板蓝根，且三个已知的指标成分(腺苷、尿苷、鸟苷)的含量均高于平均水平，因而，从该地板蓝根核苷类活性部位指纹图谱的整体特征及各色谱峰的峰值和板蓝根混批的指纹图谱比较，可以说明，该地产的板蓝根药材的质量好。
实施例5取广东某厂产的板蓝根颗粒5.0g，以20ml甲醇-丙酮任意比例的混和溶剂超声提取30min，滤过，取续滤液10ml，蒸干，以甲醇溶解并定容成10ml，按上述的色谱方法进行分析，制作该药材的指纹图谱，同时，定量分析其中的腺苷、鸟苷和尿苷的含量，其指纹图谱如图6所示。腺苷、鸟苷和尿苷的含量分别为346、29和225μg/g.该厂板蓝根颗粒活性部位中以腺苷的含量较高，其次是尿苷，鸟苷含量很低，图谱中，以2、6、9号峰为峰值非常明显的色谱峰，7、10号峰峰值也较明显。各色谱峰均高于平均质量水平的板蓝根颗粒(见图3，9)，且三个已知的指标成分(腺苷、尿苷、鸟苷)的含量均高于平均水平，因而，从该厂的板蓝根颗粒核苷类活性部位指纹图谱的整体特征及各色谱峰的峰值和平均质量水平的板蓝根颗粒指纹图谱比较，该厂的板蓝根颗粒的质量稍高于平均质量水平。
实施例6取四川某厂产的板蓝根颗粒5.0g，以20ml甲醇-丙酮任意比例的混和溶剂超声提取30min，滤过，取续滤液10ml，蒸干，以甲醇溶解并定容成10ml，按上述的色谱方法进行分析，制作该药材的指纹图谱，同时，定量分析其中的腺苷、鸟苷和尿苷的含量，其指纹图谱如图7所示。图谱中，以2号峰的峰值大，其它峰的峰值均较小，腺苷和尿苷的含量分别为 134和92μg/g.各色谱峰的峰值均低于平均质量水平的板蓝根颗粒(见图3，10)，该厂板蓝根颗粒活性部位中以腺苷和尿苷的含量稍高，鸟苷的含量很低，但腺苷和尿苷的含量均低于平均水平，从该厂的板蓝根颗粒核苷类活性部位指纹图谱的整体特征及各色谱峰的峰值与平均质量水平的板蓝根颗粒指纹图谱比较，可以说明，该厂的板蓝根颗粒的质量低于平均质量水平的板蓝根颗粒，说明该厂的板蓝根颗粒的质量差。
权利要求
1.用于控制板蓝根及其制剂质量及药效的指纹图谱，其特征在于该指纹图谱是板蓝根中抗病毒活性部位的指纹图谱，该活性部位以核苷类为主要组成部分，其中已知的核苷类成分有腺苷、尿苷、鸟苷。
2.根据权利要求1所述的用于控制板蓝根及其制剂质量及药效的指纹图谱，其特征是板蓝根活性部位指纹图谱中，包含有10个左右的色谱峰，各色谱峰的峰值大小和比值依板蓝根的来源和产地而异，其紫外最大吸收在240nm～280nm之间。
3.根据权利要求2所述的用于控制板蓝根及其制剂质量及药效的指纹图谱，其特征是在10个左右的色谱峰中，9号峰为腺苷、8号峰为鸟苷、6号峰为尿苷。
4.板蓝根核苷类活性部位的指纹图谱制作方法，其特征是以液相色谱法作为指纹图谱的制作方法，即以C18柱为色谱柱，以乙腈—水为流动相，梯度洗脱，以240nm～280nm检测波长，在上述条件下，分别吸取对照样品溶液，即腺苷、尿苷、鸟苷溶液，和板蓝根及其制剂的抗病毒活性部位的供试品溶液各5mL注入高效液相色谱仪，进行分析，制作板蓝根及其制剂中的具有抗病毒活性部位指纹图谱。
5.根据权利要求4所述的板蓝根活性成分核苷类的指纹图谱制作方法，其特征是洗脱为梯度洗脱，或者是等梯度洗脱。
6.根据权利要求4所述的板蓝根活性成分核苷类的指纹图谱制作方法，其特征是对照品溶液为，取腺苷、尿苷、鸟苷按常规方法配制。
7.根据权利要求4所述的板蓝根活性成分核苷类的指纹图谱制作方法，其特征是板蓝根及其制剂的供试品溶液为，取板蓝根药材粉末1.0g，加蒸馏水50ml，超声提取30min，滤过，取续滤液20ml，蒸干，甲醇溶解并定溶成10ml，即得供试品溶液。
全文摘要
本发明涉及用于控制板蓝根及其制剂质量及药效的指纹图谱及其制法，它公开该指纹图谱为板蓝根中抗病毒活性部位的指纹图谱，该活性部位以核苷类为主要组成部分，其中已知的核苷类成分有腺苷、尿苷、鸟苷。本发明通过建立板蓝根活性部位的指纹图谱，结合指标成分的定量分析结果，可以综合评价板蓝根及其制剂的质量、药效，使板蓝根及其制剂的质量有了真正可控制的标准。本发明制作该指纹图谱的方法操作简单、准确可靠、适于在板蓝根及其制剂的质量控制方面使用。
文档编号G01N33/15GK1591007SQ200410015398
公开日2005年3月9日 申请日期2004年2月19日 优先权日2004年2月19日
发明者曾令杰, 李楚源, 陈矛, 王德勤, 陈薇 申请人:广州白云山制药股份有限公司广州白云山中药厂