专利名称：特异于类浆细胞树突状细胞的抗体的制作方法
技术领域：
本发明提供能够结合类浆细胞树突状细胞(plasmacytoid dendrticcells，pDC)的免疫学试剂(抗体)，表达这种抗体的细胞系以及利用这种抗体从包含pDC的组织鉴定和纯化类浆细胞树突状细胞的方法。
背景技术：
树突状细胞(DC)是引发T细胞依赖的免疫应答的抗原呈递细胞(APC)(Steinman，1991，Ann.Rev.Immunol.9271-296)。在人类中，类浆细胞DC(pDC)是DC亚型，其特征在于它们的超微结构类似于分泌Ig的浆细胞(Grouard等人，1997，J.Exp.Med.185(6)1101-1111)，它们独特的表面表型(CD4+IL-3R++CD45RA+HLA-DR+)(Grouard等人，1997，J.Exp.Med.185(6)1101-1111；Facchetti等人，1999，Histopathology 35(1)88-9；Res等人，1999，Blood 94(8)2647-57)，以及它们应答病毒或包含特定CpG基序的寡脱氧核苷酸(ODN)刺激而产生高水平IFNα的能力(Siegal等人，1999，Science 284(5421)1835-7；Kadowaki等人，2001，J Immunol 166(4)2291-5)以及体外有效诱导遭遇病毒后幼稚T细胞的启动(priming)和Th-1极化(Cella等人，2000，Nat Immunol 1(4)305-10；Kadowaki等人，2000，J Exp Med192(2)219-26)。据认为pDC起源于T细胞和B细胞的共同前体(Grouard等人，1997，J.Exp.Med.185，61101-1111；Res等人，1999.Blood 94，82647-57；Res等人，1999，Blood 94(8)2647-57；Bruno等人，1997，J.Exp.Med.185875-884；Bendriss-Vermare等人，2001，JCI 107835；Spits等人，2000，J.Exp.Med.192(12)1775-84)。
在小鼠中，最近已经有几个小组将pDC鉴定为CD11clowB220hiGr1low细胞，其能够应答病毒刺激而产生I型的IFN，平且显示出类浆细胞形态学(Nakano等人，2001，J.Exp Med，194(8)1171-8；Paturel等人，2001，Nat Immunol.2(12)1144-1150；Bjorck，2001，Blood 98(13)3520-6)。也可通过在存在FLT3L时，使骨髓细胞分化成为树突状细胞而在体外大量地获得小鼠pDC。
除其形态学、其IFNα产生及其假定的起源外，pDC在其弱的吞噬活性(Grouard等人，1997，J.Exp.Med.185，61101-1111)、其弱的IL-12生产能力(Rissoan等人，1999，Science 2831183-1186)，和诱导其活化的信号(Kadowaki等人，2001，J.Immunol 166(4)2291-5)方面与骨髓的DC有所不同。虽然活化pDC的募集将通过幼稚T细胞活化而引发免疫性，然而已经报道不成熟的或失活的DC可能通过诱导调节T细胞而诱导免疫耐受性(Jonuleit等人，2001，Trends Immunol.22394；Bell等人，2001，Trends Immunol 2211，Ronearolo等人，2001，JEM 193F5；Jonuleit等人，2000，JEM 1621213)。此外，已经显示pDC诱导分泌IL-10的T细胞(Rissoan等人，1999，Science 2831183；Liu等人，2001，Nature Immunol 2585)和CD8调节T细胞(Gilliet等人，2002，J.ExpMed.195(6)695-704)。也已经显示人天然产生IFN的细胞(HuIPC)在活化自然杀伤(NK)细胞以杀死受病毒感染的细胞中起重要作用(Bandyopadhyay等人，1986，J.Exp Med 164(1)180-95)。此外，最近pDC已经与自身免疫疾病，特别是红斑狼疮相关(Farkas等人，2001，Am.J.Pathol.159(1)237-43)。
I型干扰素(IFN-α、β或ω)在寄主对病毒或微生物感染的抗性中发挥中心作用(Pfeffer等人，1998，Cancer Res 58(12)2489-99；van denBroek等人，1995，Immunol Rev 69(8)4792-6)。最近已经在MCMV和VSV感染模型中体内证明了pDC在病毒感染中的重要作用(Dalod等人，2002，J Exp Med 195(4)517-28；Barchet等人，2002，J Exp Med195(4)507-16)。实际上，当缺乏小鼠pDC时，在感染MCMV的小鼠中IFNα的水平显著降低。在该研究中，用于排空pDC的抗-Gr1处理可能除排空嗜中性粒细胞外，也可能减少部分巨噬细胞和活化T细胞。然而，因为所有这些细胞不在体外产生IFN-α，并且T或B淋巴细胞不是体内产生IFN-α所需要的，这些数据证明要么MIPC是能够应答MCMV感染而体内产生I型IFN的唯一细胞，要么I型IFN的初期产量是为从其他细胞类型引发IFN级联生成所必需的(Dalod等人，2002，J Exp Med195(4)p.517-28)。
在人类中，已经显示静止的pDC特异表达BDCA-2和BDCA-4(Dzionek等人，2000，J.Immunol.165(11)6037-46)。在小鼠中，迄今为止还没有鉴定出这种特异的标记物。为了监测、表征和分离pDC，以及为了在动物模型中研究其体内功能，鉴定出特异于小鼠pDC的新标记物将是非常有用的。
发明概述本发明通过提供具有在2003年1月27日，以ATCC保藏号PTA-4957保藏的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体的结合特性的结合化合物而填补了上述空白。在优选的实施方案中，该结合组合物是抗体或抗体片段。最优选地，该单克隆抗体是由杂交瘤ATCC No.PTA-4957产生的单克隆抗体120G8。
本发明也提供保藏号为PTA-4957的杂交瘤细胞系。
本发明进一步提供从含pDC的样品纯化pDC的方法，所述方法包括将所述的样品与120G8抗体接触，然后回收已经结合所述抗体的pDC。
最后，本发明提供从含pDC的样品鉴定pDC的方法，包括将所述样品与120G8抗体接触以形成抗体/pDC复合物，以及检测所述抗体/pDC复合物的存在以鉴定pDC的步骤。
发明详述本发明部分地基于在小鼠中发现的特异识别pDC的抗体。
通过DC呈递抗原的T细胞应答特性取决于所涉及的DC亚群和呈递DC的成熟阶段(Steinman等人，2000，J.Exp.Med.191(3)411-6)。不考虑功能可塑性，MDC和pDC能够分别通过其分泌IL-12或不分泌IL-12的能力，使T细胞应答的类型向Th1或Th2应答极化(Rissoan等人，1999，Science 2831183-1186)。在应答病毒中伴随MDC活化B细胞(Dubois等人，1999，J.Leukoc.Biol.66224-230)和NK细胞(Zitvogel等人，2002，J.Exp.Med.195(3)F9-14)，并且pDC产生大量天然的IFNs(Liu，Y.J.，2001，Cell 106(3)259-62)，2种DC亚类也在获得性和先天性的免疫应答之间形成不同的连接。鉴于例如，在小鼠中缺乏能够识别静止和活化的pDC的特异标记物，本发明人已经制备出了直接针对小鼠pDC的mAb。
这个抗体已经命名为120G8，并且是由在2003年1月27日按照布达佩斯条约，以ATCC保藏号PTA-4957保藏的杂交瘤细胞系产生的。120G8mAb可用于从总体细胞中有选择地分离pDC。它染色pDC，所述的pDC来自由离体的总体细胞或体外骨髓衍生的DC。它不仅识别起源自小鼠不同器官的pDC，而且识别起源自不同小鼠品系的pDC。它可用于激发荧光细胞分拣术(FACS)研究、免疫组织化学(IHC)或组织切片上的免疫组织荧光(IHF)染色。因为120G8mAb识别静止和活化的pDC，它最有助于研究体外和体内的pDC应答活化。最后如表型和功能上所确定的，体内注射120G8 mAb排空了小鼠的pDC。
如在此所使用的术语″结合化合物″包括抗体及其功能性片段，其特异地结合pDC，并且具有与在此所述的120G8 mAb相同或相似的表位特异性。可通过它们与120G8 mAb竞争结合pDC的能力而鉴定具有与120G8 mAb相同或相似的表位特异性的结合化合物。
实施例本发明可通过下列非限制性的实施例加以说明，其可通过参考下列材料和方法更容易地进行理解。
小鼠、培养基和抗体从Charles River(Iffa-Credo，L’Arbresle，法国)购买无特殊病原体的BALB/cByJ、129SvPas、C57BI/6J、CBA/J、C3H/HeN、DBA/2J、BALB/c-6-8周龄雌性裸鼠。按照由设立的动物委员会许可的方案并且根据EEC委员会指令86/609以及制度化的动物护理和使用方针进行所有的小鼠实验。
初级细胞于37℃，5％CO2中，生长在完全的RPMI1640培养基中RPMI1640(Life Technologies，Paisley Park，英国)，其补充有10％(v/v)热灭活的胎牛血清(FCS，Life Technologies)，2mM L-谷氨酰胺(LifeTechnologies)，80μg/ml Gentallin(Schering Plough，Union，NJ)，10mMHepes(Life Technologies)，50μM β2-巯基乙醇(Sigma，St Louis，MO)。在补充有2mM L-谷氨酰胺，80μg/ml Gentallin的DMEM/F12(LifeTechnologies)中产生杂交瘤的高密度上清液。如果不指定则加入10％(v/v)马血清(HS，Life Technologies)。除非另作说明，所有的抗体都来自于Pharmingen(San Diego，CA)。
组织制备和细胞排空通过吸入CO2杀死小鼠。该方法自始至终将分离的细胞维持在PBS-FCS-EDTA中补克有5％(v/v)热灭活的FCS和0.5mM EDFA(Sigma)的PBS(Life Technologies)。通过处死后立即进行心脏穿刺而在过量的PBS-FCS-EDTA中收集血细胞。在PBS-FCS-EDTA中压碎脾脏、胸腺、淋巴结(部位或外周的(汇集在腹股沟的、腋下的和部位的)、peyer′s小块，并且通过25G的针。在NH4Cl溶液(Stem CellTechnologies，Vancouver，BC)中裂解红血细胞5分钟。用冷的PBS-FCS-EDTA从骨上冲洗下骨髓细胞。
为人类T和B细胞排空，用抗-CD3分子络合物(17A2)的混合物使细胞在4℃培养30分钟，备选使用抗-CD8β(53-5.8)、抗-CD19(1D3)或抗-红血球(TER119)。于4℃连续搅动混合细胞和山羊抗-大鼠IgG-包被的Dyna珠子(Dynal，Oslo，挪威)15分钟。利用Dynal磁体移出珠子和附着的细胞。
利用CD11c+微珠和MiniMacs(Myltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)从总的脾脏细胞、总的骨髓细胞或排空CD19、CD3、CD8β、TER119的细胞，通过阳性选择纯化CD11c+细胞。
为获得FLT3L中骨髓体外衍生的DC(BM-DC)，将以106个细胞/ml接种在24-孔平板中的分离骨髓细胞，在补充有25ng/ml重组的鼠FLT3L(R&D systems，Abingdon，英国)的完全RPM11640培养基中培养9天。每2-3天更新培养基。
用小鼠类浆细胞DC免疫接种大鼠使来自BALB/c小鼠的小鼠脾脏细胞与包括抗-CD3分子络合物(17A2)、抗-CD8β(53-5.8)、抗-CD19(1D3)、抗-CD5(53-7.3)、抗-CD11b(M1/70)、和抗-红血球(TER119)的大鼠mAb混合物在4℃培养30分钟，然后利用Dyna珠子移出抗体包被的细胞。用大鼠抗-Ly6G/C(RB6-8C5)-藻红蛋白(PE)、仓鼠抗-CD11c(HL-3)-生物素、和包含异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的仓鼠抗-CD3ε(145-2C11)、大鼠抗-CD19(1D3)、抗-CD5(53-7.3)、抗-CD11b(M1/70)、和抗-pan NK细胞(DX5)的混合物在4℃染色排空的细胞30min。然后用链霉抗生物素蛋白-Pe-Cy5(Dako，Glostrup，丹麦)染色细胞，并且利用FACStar加流式细胞仪(Becton Dickinson，Moutain View，CA)分拣CD11c+Grl+CD3s-CD19-CD5-CD11b-DX5-细胞(pDC)。在PBS(LifeTechnology，Paisley Park，英国)中洗涤分拣的细胞3次，重悬浮在PBS中并且在-20℃冷冻以备注射使用。
用分拣的pDC免疫一只4周龄的LOU雌性大鼠(Iffa Credo)。方案如下第0天腹膜内(ip)注射完全弗氏佐剂(CFA)中的106个细胞第14天ip注射不完全弗氏佐剂(IFA)中的106个细胞第21天ip注射PBS中的106个细胞第35天静脉内(iv)注射PBS中的2.106个细胞第38天杀死大鼠并收集脾脏。
利用聚乙二醇-1000(Sigma)使脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞系SP20融合。将杂种细胞接种到96-孔平板中并且用补充有10％HS，2mM L-谷氨酰胺，80μg/ml Gentallin，1％培养基添加剂(CRTS，里昂，法国)，10-5M重氮乙酰丝氨酸(Sigma)和5×10-5M次黄嘌呤的DMEM/F12培养。用离体分离的脾脏细胞、骨髓和脾的CD11c+树突状细胞筛选上清液的反应性。通过有限稀释克隆所选择的杂交瘤。
从无血清的高密度上清液通过在Hiload Q柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)上进行阴离子交换色谱纯化mAb 120G8，并且利用标准方法与Alexa488和生物素偶联。在Balb/c-裸鼠(Iffa Credo)中产生腹水。利用大鼠Ig亚类试剂盒(Pharmingen，San Diego，CA)通过ELISA确定Ig同种型。
FACS分析对于所有的FACS分析，首先将维持在PBS-FCS-EDTA中的细胞与未标记抗-CD16/32的大鼠Ab培养15分钟以确保封闭Fc受体，然后用指明的Abs在4℃染色30分钟。用FACScan流式细胞仪分析染色细胞。用同种型相配的大鼠或仓鼠Ig作为阴性对照。当没有使用PerCpCy5.5染色时，利用FL3通路控制输出(gated out)自发荧光的细胞。
对于120G8+细胞表面表型，用Alexa-488-标记的120G8，PE-标记的抗体(抗-CD3ε、CD19、DX5、CD11c、CD45R/B220、Lv6C、Lv6G/C(Gr1、RB6-8C5)、CD11b、I-Ad、H2-Kd)和APC-标记的仓鼠抗-CD11c(HL-3)染色分离的细胞。对于染色在FLT3L中培养指定天数的BM-DC，用120G8 Alexa488、抗-CD11c-PE、抗-CD11b-PerCpCy5.5和抗-CD45R/B220-APC染色细胞。对于不同器官中的120G8+和120G8-CD11c+细胞的表面表型，用120G8-Alexa488、抗-CD45R/B220-PE、抗-Ly6C-生物素和抗-CD11c-APC染色分离的细胞。用PerCP-Cy5.5链霉抗生物素蛋白(Pharmingen)显示生物素酰化的抗-Ly6C。
为分析小鼠器官中的DC亚型细胞频率，用大鼠120G8-Alexa488、抗-CD19和抗-CD3ε-PerCPCy5.5、抗-CD11c-APC和抗-CD8α-PE或抗-CD11b-PE染色在PBS-FCS-EDTA中维持的脾脏细胞。利用FL3通路控制输出CD19+/CD3ε+细胞用于分析。结果表示为总的脾脏细胞中指定的细胞亚型的频率。
细胞的活化和细胞因子的产生对于细胞活化，在缺乏或存在指明的刺激时，在完全的RPMI 1640培养基中培养指明的细胞(对于未分拣的细胞为106个细胞/ml，而对于分拣的细胞为0.5×106个细胞/ml)。以每ml 100个血球凝集素单位的终浓度向培养物加入甲醛-灭活的人流感病毒，菌株NK/TM/138/00(由N.Kuehn，Aventis Pasteur，Val de Reuil，法国惠赠)。除非另作说明，从MWGBiotech(慕尼黑，德国)购买硫代磷酸酯(phosphorothioate)CpG ODNs，(TCA TTG GAA AAC GTT CTT CGG GGC G)(SEQ IDNO1)并以10μg/ml的终浓度加以使用。以指明的终浓度使用重组的小鼠IFN-α(Hycult Biotechnology，Uden，荷兰)。以2ng/ml的终浓度使用重组的小鼠IFN-γ(R&D)。
对于120G8+细胞生产细胞因子，使脾脏细胞在4℃与包括抗-CD3分子络合物、抗-CD8β、抗-CD19和抗-红血球(TER119)的mAb混合物培养30分钟，然后利用Dyna珠子移出抗体包被的细胞。用大鼠120G8-Alexa488、仓鼠抗-CD11c(HL-3)-藻红蛋白(PE)在4℃染色排空的细胞30分钟。然后利用FACStar加流式细胞仪(BectonDickinson)分拣细胞，进行洗涤并接种在96孔培养平板中，进行20-24h指明的刺激。在20-24h收集上清液并储存在-20℃以备用于通过特异的ELISAs分析IFN-α和IL-12(p40或p70)(分别为PBL BiomedicalLaboratories，New Brunswick，NJ和R&D Systems)。
对于细胞活化后的120G8表达，用指明的刺激培养分离细胞20-24h。然后染色经刺激的细胞，对于CD11c+活化的细胞用120G8-Alexa488、抗-CD11b-PerCpCy5.5和或和抗-CD45R/B220-PE染色，对于总的脾脏细胞用120G8-Alexa488和与PE偶联的指明mAbs染色。对于后者的实验，利用FL2通路控制输入(gated in)指明的细胞。
组织切片上120G8的免疫染色将脾脏包埋在OCT-化合物(Miles)中，在液氮中快速冷冻，并且储存在-80℃以备用于进一步的分析。将8微米厚的低温切片于-20℃在80％丙酮(Sigma)中固定20分钟，在室温下干燥并冷冻储存直到染色。在PBS(Life Technology)中使切片再水合。分别利用特异的试剂盒(Vector Laboratory，Burlingame，CA)和0.3％的H2O2(Sigma)分别中和抗生物素蛋白/生物素和过氧化物酶组织含量。用2％的标准小鼠血清(Dako，Glostrup，丹麦)封闭切片，并在室温下进行染色。对于各种小鼠组织中120G8+细胞的原位分布，顺序地用未标记的120G8 Ab染色切片60分钟、偶联生物素的山羊抗-大鼠(Jackson Immunoresearch)染色60分钟，偶联过氧化物酶(Sigma)的外抗生物素蛋白(extravidin)染色30分钟，并且用过氧化物酶底物(AEC，Sigma)显示。用苏木精(Vector Laboratory)进行复染。对于免疫组织荧光分析，顺序地用未标记的120G8 Ab染色切片60分钟，偶联Alexa488的山羊抗-大鼠(Molecular Probes，Leiden，荷兰)染色60分钟，2％大鼠血清、偶联生物素和链霉抗生物素蛋白-Alexa594的指明Abs(Molecular Probes)染色。
体内治疗对于CpG处理，在注射入麻醉小鼠的眼窝后静脉中之前将每只小鼠30μL的阳离子脂质体制剂(DOTAP，Roche，曼海姆，德国)与170μLPBS中的5μg CpG ODN在聚苯乙烯试管中混合10分钟。CpG注射6小时后，收集脾脏并且准备免疫染色。
对于体内排空120G8+细胞，用最适量的120G8腹水腹膜内注射小鼠。对于pDC排空的FACS分析，注射120G8后24h，分离脾脏细胞并且用抗-Ly6C-FITC、抗-CD45R/B220-PE，抗-CD11cAPC和抗-CD 19-PerCpCy5.5或抗-CD3ε-PerCpCy5.5染色。对于CpG处理后评估120G8+细胞体内协助产生细胞因子的实验，在第-1天和在CpG处理的时候用120G8腹水腹膜内注射小鼠。CpG注射6h后，通过处死后立即进行心脏穿刺术而收集血液。通过在37℃凝固30分钟和离心从全血制备血清，冷冻血清以备用于分析细胞因子含量。通过流式细胞光度术分离脾脏细胞以评估排空效率。
实施例1选择针对小鼠pDC反应的单克隆抗体120G8筛选来自2400个杂交瘤的上清液与总的小鼠脾脏细胞制品中小于5％的细胞的反应性，并进一步筛选与排空CD3+、CD19+、TER119+、CD11b+细胞的脾脏的反应性。将由融合产生的25个平板中的5个96孔平板于-80℃冷冻在补充有10％DMSO的HS中。解冻这5个平板中的2个，如上所述用完全的DMEM F12喂养，并且通过在总的脾脏细胞上(小于5％)进行FACS染色来第二次筛选上清液。分析所选择上清液在骨髓和脾脏CD11c+细胞上的反应性。发现来自命名为120G8的一个杂交瘤的上清液只与骨髓CD11c+细胞的主要亚型(60-70％)，和脾脏CD11c+细胞的次要CD11clow亚型(10-20％)起作用。通过有限稀释克隆该杂交瘤。一旦选择出与亲本系具有相似反应性，所得到的克隆通过有限稀释进一步加以克隆，并且选择在小鼠CD11c+细胞上具有最高反应性的克隆，即具有产生Ab的最高能力的克隆(克隆6)。
该抗体是从腹水和高密度的上清液中的亲本和克隆6产生的。如ELISA所确定的，发现Mab 120G8是IgG1/κ同种型。因为脾脏中的120G8+细胞似乎也是特别感兴趣的CD11c+B220+Gr1+细胞(以前定义为小鼠pDC)，选择mAb 120G8用于进一步研究。
实施例2120G8 mAb与产生小鼠IFN-α的细胞[pDC]是高度反应性的利用偶联Alexa 488的120G8和谱系特异标记物的双免疫荧光研究，进一步在未刺激的脾脏细胞上检验120G8 mAb的反应性。120G8 Ab染色在正向和侧面散布中同质的新鲜分离的脾细胞小亚型。这个亚型不表达TER119(红细胞谱系标记物)、CD19(B细胞谱系标记物)、CD3ε(T细胞谱系标记物)和DX5(Nk细胞谱系标记物)。所有的120G8+细胞也是CD11clow，证实Ab染色脾脏DC的亚型。这些结果代表至少3次实验。
其次，体外测试120G8 mAb特异识别产生IFN-α的细胞(IPC)的能力。已经证明CD11c+脾细胞是应答流感病毒而体外产生下量IFNα的唯一细胞(Paturel等人，Nat Immunol，2001)。通过流式细胞术从排空CD3+CD19+CD8β+TER119+细胞的脾脏细胞纯化CD11c+120G8+和CD11c+120G8-细胞。通过灭活的流感病毒或CpG如上所述体外刺激2种亚型。进行3次实验并得到相似的结果。来自用培养基单独培养的这两种分拣群体的IFN-α和IL-12p40的产生低于ELISA检测水平。在流感病毒和CpG刺激后只有CD11c+细胞的120G8+亚型产生IFN-α。由120G8-分拣细胞应答流感病毒和CpG产生的IFN-α的水平极低或观察不到。120G8+细胞也能够应答这两种刺激而产生IL-12p40，但对于CpG刺激，其水平低于包括CD11ChighDC的120G8-细胞亚型。这与上述显示CD8α+CD11chighDC能够应答各种刺激而产生高量IL-12的上述数据相符合。
实施例3120G8+CD11c+脾细胞的表面表型先前已经描述小鼠pDC是脾脏中的CD11c+Gr1+B220+细胞(Paturel，2001，Nagano，2001，Bjorck，2001)，和从骨髓细胞体外衍生的DC中的CD11c+B220+CD11b-细胞。为了研究120G8+细胞的表面表型，与120G8-CD11c+DC相比较，用120G8、CD11c和几个偶联PE的Abs染色离体分离的CD11c+和在FLT3L中体外衍生的DC。当分析离体分离的脾脏CD11c+细胞时，120G8+细胞是B220high、Gr1low、Ly6Chigh、CD11b-、CD8αneg/low、IAdlow和H-2Kd+，而CD11c+120G8-细胞是B220neg/low、Grl-、Ly6Cneg/low、CD11b+/-、CD8αneg/hi、IAdlow/high和H-2Kd+。1208G8表型与先前描述的小鼠pDC表面表型符合。此外，120G8也染色先前鉴定的在FLT3L-刺激的骨髓细胞培养物中体外衍生的CD11b-CD11c+B220+小鼠pDC(BM-DC)。当分析BM-DC时，120G8+细胞是B220high、Gr1neg/low、Ly6Chigh、CD11b-，而120G8-细胞是B220neg/low、Gr1-、Ly6Cneg、CD11b+。
因此，120G8mAb对小鼠脾脏pDC和体外衍生的pDC均可染色。
实施例4120G8是小鼠pDC分化的早期标记物在pDC体外分化的第6天和第10天之间研究BM-DC(FLT3L)上的120G8 mAb染色。用120G8、CD11c、CD11b和B220染色细胞。从第6天到第10天，120G8 mAb不染色CD11c-细胞。然而，早在培养6天后所有的120G8+细胞都是CD11c+CD11b-B220+细胞。也可检测到B220+CD11c+120G8-的亚型，其是CD11b+，并且最可能来源于CD11b+骨髓样DC。虽然从第6天(70％)至第8天(90％)CD11c+细胞的百分比增加，并且直到第10天保持恒定，从第6天(23％)至第8天(38％)，CD11c+细胞中120G8+细胞的百分比缓慢增加，并且其后迅速降低(在第10天为4％)。这些结果表明120G8 mAb是小鼠pDC沿其体外分化的早期标记物。
实施例5各种淋巴器官中120G8+细胞的表面表型在来自Balb/c小鼠的脾脏、骨髓、血液、胸腺、外周和肠系膜淋巴结中研究120G8 mAb的染色。用120G8、抗-CD45R/B220、抗-Ly6C和抗-CD11c Abs四重表面染色分析分离的细胞。研究在CD11c+120G8+和CD11c+120G8-细胞上的Ly6C和B220表达。在所有试验的器官和血液中，CD11c+120G8+都是B220highLy6Chigh。相反地，没有CD11c+120G8-是B220highLy6Chigh。这表明120G8mAb可识别小鼠pDC(CD11c+B22OhighLy6Chigh)细胞，而与pDC分离自哪些组织无关。
实施例6不同小鼠品系中120G8+细胞的频率进一步研究120G8 mAb与来自不同小鼠品系的pDC反应的能力。120G8 mAb与分离自BALB/cByJ、129SvPas、C57BI/6J、CBA/J、C3H/HeN和DBA/2J小鼠的脾脏pDC起反应。进一步研究来自这6个不同小鼠品系的总的脾脏细胞当中120G8+DC亚型的频率。从相同年龄的小鼠(每个小鼠品系3只小鼠，进行两次实验)分离脾脏细胞，并用120G8、CD11c、CD19和CD3ε染色。控制输出CD19/CD3ε+细胞用于分析。总的脾脏细胞当中pDC频率的分析显示其变化取决于所考虑的小鼠品系，例如C57/BI6小鼠显示最低的脾脏pDC频率(总的脾脏细胞的0.6％+/-0.06)，而129Sv小鼠显示最高频率(总的脾脏细胞的1.94％+/-0.37)。
实施例7组织切片上120G8的免疫组织化学染色通过免疫组织化学分析胸腺、脾脏、peyer′s小决、外周淋巴结、肠系膜淋巴结来检验120G8+细胞的原位分布。在所有的这些器官中，可检测到120G8+的单个细胞。在一些器官(例如胸腺)中，可在内皮细胞上检测到一些低的染色。也在肠被绒毛上检测到一些低的染色。
实施例8体外活化后在小鼠pDC上维持120G8BDCA2、CD123、BDCA4是3种通常用于检测人pDC的标记物。然而众所周知，在体外活化的人pDCs非常迅速地下调这些标记物。因此迄今为止很难原位检测活化的pDC。在小鼠中，通常通过用抗-CD11c和抗-CD45R/B220复染来检测pDC(静止或活化的)，但是该组合染色其他的细胞，例如B细胞。为了评估静止和活化的pDC上的120G8染色，在有或没有灭活的流感病毒和CpG ODN 1668(TCC ATG ACG TTCCTG ATG CT)(SEQ ID NO2)时，体外培养来自129Sv小鼠的MACS纯化的CD11c+脾细胞20h。在所有试验的状况中，120G8 mAb染色的平均荧光强度在小的CD11c+B22highCD11b-亚型(pDC)上保持恒定。尽管在流感病毒和CpG刺激后检测到一些CD11c+B220hi120G8-，那些细胞也表达CD11b，表明一些骨髓样DC可上调B220，而不是120G8，进一步证实pDC上120G8染色的特异性。
为了进一步证实120G8 mAb也可体内染色活化的pDC，如所描述的方法用CpG处理129Sv小鼠。在CpG注射后6h分离脾脏细胞，并且对DC亚型研究DC上表达的活化标记物。120G8+细胞上调DC活化分子，例如CD40、CD86，并且在用CpG体内刺激后调节至更少程度的CD8α和MHC类型II分子。在对照和CpG处理的小鼠中，那些细胞显示相同水平的CD11c(低)和CD11b(阴性)，并且pDC中120G8染色的平均荧光强度保持恒定。因此120G8 mAb在体外和体内都识别静止和活化的pDC。
实施例9在来自正常和CpG活化的小鼠脾脏的120G8+细胞定位虽然一些研究已经显示人pDC位于T细胞区，应答HSV感染而产生IFNα的细胞位于小鼠脾脏的边缘区(Eloranta，Alm，Scand J Immunol，1999)。如实施例7中呈现的免疫组织化学染色研究表明正常小鼠中脾脏的pDC位于T细胞区。由于120G8 mAb似乎是原位染色静止和活化的pDC的独特工具，为了在脾脏中追踪小鼠pDC定位，我们如所描述的方法用CpG处理129Sv小鼠。通过用在CpG处理后6h的脾脏中用绿色荧光(Alexa488荧光染料)染色120G8+细胞和用红色荧光(Alexa594荧光染料、抗-CD3ε、抗-CD19、抗-CD11c(N418克隆)和抗-CD11bmAbs)染色T、B、DC或巨噬细胞的共染色，进行免疫荧光原位分析来实现这个研究。我们注意到在该实验条件下，由于pDC低表达CD11c，120G8+细胞不能被CD11c染色。因此通过CD11c原位染色只检测到CD11chigh。用120G8分析连续切片的CD19、CD3或CD11b共染色。在静止的动物中，120G8mAb染色来自T细胞区(CD3染色)和边缘区(CD11b染色)的细胞。在B细胞区(CD19染色)没有发现120G8+细胞。在红浆(red pulp)和T细胞区之间的桥连通道中检测到CD11chigh细胞(CD11c染色)，但是没有显示与pDC相同的分布模式。
在CpG活化的脾脏中，120G8 mAb染色来自边缘区的细胞。在B或T细胞区没有或几乎没有检测到120G8+细胞。相反，在T细胞区可检测到大流量的CD11chigh细胞。
因此，120G8mAb可用于直接地原位追踪应答活化的pDC迁移。
实施例10120G8细胞的体内排空终止了IFN-α的产生在上述的研究中，已经通过用抗-Ly6G/C(Gr1)处理排空那些细胞而证明pDC在病毒感染中的作用。这个处理，除pDC和中性粒细胞外，也可能减少部分巨噬细胞和活化的T细胞。因此通过利用120G8特异地排空pDC可能对于体内研究具有很大的用途。腹膜内注射或不注射120G8 mAb的BALB/c小鼠，24h后，在未处理和120G8处理的小鼠(每组3只小鼠)中分离脾脏细胞，用于FACS分析脾脏细胞中Ly6C+B220+CD11c+的频率，以及CD19或CD3ε污染细胞的水平。用120G8 Ab体内处理降低脾脏Ly6C+B220+CD11c+细胞的频率。此外，剩余的Ly6C+B220+CD11c+细胞不全是pDC，因为它们表达CD3(42％)并且表达较少的CD19(18％)。
为了评估120G8排空对IFNα生产的影响，在CpG处理129Sv小鼠(每组3只小鼠)后6h，预先排空或不排空120G8+细胞来分析seric IFNα和IL 12的产生。对于两个细胞因子，对照小鼠血清(单独地DOTAP)都是阴性的。120G8处理完全消除了由CpG处理(对于正常的小鼠为13300pg/ml+/-1500，对于120G8处理的小鼠为小于150pg/ml)诱导的IFNα产生，同时导致对IL-12产生的小的抑制，p40和p70两者(对于正常的小鼠为IL-12p701240pg/ml+/-540，对于120G8处理的小鼠为300pg/ml+/-74；对于正常的小鼠为IL-12p405806pg/ml+/-1135，对于120G8处理的小鼠为4250pg/ml+/-1170)。因此120G8 mAb可用于排除小鼠体内产生IFNα的细胞。
实施例11存在IFNα时在B细胞上120G8表达上调120G8 mAb只染色分离自正常小鼠的总的静止细胞当中的pDC。我们研究其它的细胞是否在细胞因子活化后也可被120G8染色。从Balb/c小鼠分离脾脏细胞并且在存在细胞因子的情况下培养24h。然后在这些细胞上分析用120G8和抗-CD19、CD4、CD8β或CD11c mAbs的复染。利用FL3通路控制输出自发荧光的细胞。这证明，在B细胞和CD11c+DC上，而不是在T CD4+或T CD8+DC上，应答100U/ml的IFN-α上调被120G8 mAb识别的抗原。在应答IFNγ、IL-12或TNFα中没有观察到这种上调。然而B细胞上120G8染色的平均荧光强度仍然保持比pDC上的低至少一个量级(log)。
对于本领域的技术人员来说，产生本发明的许多改进和变化而不背离其精神和范围是显而易见的。在此只是通过实施例的方式来提供所述的具体实施方案，并且本发明只受到所附权利要求的条款的限定，伴随有这些权利要求的等同物所赋予的全部范围。
序列表<110>Schering Corporation<120>特异于类浆细胞树突状细胞的抗体<130>SF06011WI01<150>US 60/443,244<151>2003-01-28<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(ODN)<400>1tcattggaaa acgttcttcg gggcg 25<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(ODN)<400>2cccatgacgt tcctgatgct 20
权利要求
1.一种结合化合物，其具有由ATCC保藏号PTA-4957保藏的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的结合特性。
2.权利要求1的结合化合物，其是抗体或抗体片段。
3.一种由ATCC保藏号PTA-4957保藏的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的抗原结合片段。
4.由以ATCC保藏号PTA-4957保藏的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。
5.以ATCC保藏号PTA-4957保藏的杂交瘤细胞系。
6.一种用于从包含类浆细胞树突状细胞的样品中纯化所述类浆细胞树突状细胞的方法，所述的方法包括将所述的样品与权利要求1的结合化合物接触，然后回收已经结合所述结合化合物的类浆细胞树突状细胞的步骤。
7.一种用于从包含类浆细胞树突状细胞的样品中鉴定所述类浆细胞树突状细胞的方法，所述的方法包括将所述的样品与权利要求1的结合化合物接触，以形成抗体/类浆细胞树突状细胞复合物；以及检测所述复合物的存在的步骤。
全文摘要
本发明提供能够结合类浆细胞树突状细胞(pDC)的免疫学试剂(抗体)，表达这种抗体的细胞系以及利用这种抗体从包含pDC的组织鉴定和纯化类浆细胞树突状细胞的方法。
文档编号G01N33/563GK1745104SQ200480003047
公开日2006年3月8日 申请日期2004年1月26日 优先权日2003年1月28日
发明者C·帕图雷尔, G·特林基里, J·－J·宾 申请人:先灵公司