至少两种不同的、特异于预定抗原的抗体混合物和该混合物的用途的制作方法

专利名称：至少两种不同的、特异于预定抗原的抗体混合物和该混合物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及至少两种不同的、各自特异于预定的被分析物的亲和性分子的混合物和该混合物的用途。更准确地，本发明的混合物是用于单或多流动池(flow cell)的压电晶体微量天平仪的、在液体载体中的分离的或合成的亲和性分子混合物，其包含至少两种不同的、各自对预定的被分析物具有亲和性的亲和性分子。
背景技术：
压电技术是基于通过测量压电晶体晶体的频率来实时测量质量变化的公知原理。压电晶体器件由两面具有金属电极的石英晶体片组成。这些电极用于诱导依赖于电极质量的振荡共振频率，并且频率变化与电极上沉积质量的变化直接相关。压电晶体因此可用于灵敏质量测量法，并因此称为石英晶体微量天平(QCM)。已经提出了许多方程式来描述在频率变化和晶体的沉积质量之间的关系。
许多专利指导了通过使用压电晶体微量天平在溶液中检测预定化学或生物分子，例如，美国专利4,735906、4,789,804和5,705,399。当在相同的待测溶液中确定了几种单个化学或生物分子(被分析物)的存在时，那么它的优势在于具有通过单独特异于一种待检被分析物的流动池可同时操作由多个微量天平组成的系统。在我们的国际专利申请WO2004001392中已公开了所述的系统，并且它可具体用于在短时间内筛选大量样品。
本发明的混合物可用于前述提到的专利和专利申请中公开的压电晶体微量天平仪。
发明描述本发明提供用于单或多流动池的压电晶体微量天平仪的、在液体载体中的分离的或合成的亲和性分子的混合物，其包含至少两种不同的、各自对预定的被分析物具有亲和性的亲和性分子。
本发明的混合物优选是这样的混合物，使得各个分离的或合成的亲和性分子与预定的被分析物形成选自下列的相互作用对阴离子-阳离子、抗体-抗原、受体-配体、酶-底物、寡核苷酸-具有互补序列的寡核苷酸、寡核苷酸-蛋白质、寡核苷酸-细胞以及肽核酸(PNA)寡聚物-多核苷酸，其中多核苷酸选自RNA、DNA和互补于PNA寡聚物的PNA聚合物。
应当理解以任意适宜的方式来单独产生亲和性分子，例如通过从天然或人造来源分离、通过使用化学合成或生物合成或两者、通过从大分子裂解等。
在本发明的优选实施方案中，各个分离的或合成的亲和性分子选自各自对预定的被分析物(即预定的抗原)具有亲和力的单特异性多克隆或单克隆抗体、抗体片段或其衍生物。
抗体可通过专业化的生产商定制，从不同供应商购买或通过从文献中已知的方法合成，例如Hybridoma Technology in the Biosciences& Medicine.T.A.Springer，editor，Plenum Press，1985。
目前，在本发明混合物的优选实施方案中，不同亲和性分子的各自浓度为0.01-0.8mg/ml液体载体。
液体载体例如是水，它可另外含有缓冲液、稳定剂和/或防腐剂，并可由本领域普通技术人员基于选择的复合混合物进行选择。例如稳定剂是表面活性剂(如Tween20或Tween80或类似物)和/或多种蛋白质(如白蛋白、酪蛋白或其它防护剂或封闭剂)的混合物。
单个被分析物(可以通过使用本发明的混合物在单或多流动池的压电晶体微量天平仪中在待测液中检测)的实例是不同的药物，例如可卡因、海洛因、安非他明、甲基苯异丙胺、大麻酚、四氢大麻酚(THC)、亚甲二氧基-N-甲基安非他明(狂喜)；是不同的爆炸物，例如三硝基甲苯(TNT)、二硝基甲苯(DNT)、六氢-1，3，5-三硝基-1，3，5-三嗪(RDX)、八氢-1，3，5，7-四硝基-1，3，5，7-四嗪(HMX)、四硝酸季戊四醇酯(PETN)以及硝化甘油(NG)；是不同的生物分子、微生物及其部分。微生物的实例是细菌、细菌孢子、分支细菌、真菌和病毒。
本发明的另一方面涉及根据本发明的混合物用于导入单或多流动池的压电晶体微量天平仪的液体流中的用途。
在本发明中，有两个稍有不同的概念使用作为本发明的优先目的的压电晶体微量天平仪竞争模式和置换方式。
在根据本发明的混合物的用途的一个实施方案中，在导入天平仪的液体流之前，将亲和性分子混合物与可能含有一种或几种预定的被分析物的待测试液混合。待测样品中无被分析物的分子与固定于压电水晶微量天平仪的电极表面上的被分析物类似物竞争亲和性分子，并记录电极的质量变化。该用途举例说明竞争模式概念。
在根据本发明的混合物的用途的另一个实施方案中，通过附着于预定的被分析物的固定在电极上的被分析物类似物而导入天平仪的液体流中是为了活化或再活化一个或几个流动池的晶体电极。该用途适于置换模式的概念。
亲和性分子附着于位于电极表面上的被分析物类似物，但是与所讨论的被分析物的附着更弱，因此当被分析物存在于待测溶液中时，被分析物与从被分析物类似物上分离的亲和性分子形成相互作用对，并记录电极的重量损失，指示被分析物在待测溶液中的存在。
本发明的混合物可以以时间间隔被导入天平仪的连续流中，例如时间间隔选自20分钟至24小时的范围，例如是每隔30分钟。
本发明的混合物也可在电极复原后被导入天平仪的连续流中，即用pH调低剂如甘氨酸从电极表面除去抗体。
本发明的混合物是先天稳定的或通过加入例如蛋白质(如白蛋白)的稳定剂而稳定化的。
本发明的附加方面涉及含有根据本发明的稳定的或稳定化混合物的试剂盒。
现在进一步通过其中亲和性分子是抗体并且被分析物是抗原的实施方案来举例说明本发明。
在竞争模式中，在暴露于含有未知量的被分析物(即抗原)和预定量的特异抗体的混合物的待测样品溶液之前，我们的国际专利申请WO2004001392所公开的多个流动池的压电天平的晶体是用如上所述的抗原类似物修饰的第一表面。现在固定化的和游离的被分析物的分子竞争结合抗体。当待测样品和抗体的混合物暴露于表面经过修饰的晶体表面时，晶体的质量增加，即频率降低并且负相关于待测样品中被分析物浓度。
本发明的混合物特别适用于活化或再活化压电晶体微量天平仪的流动池，所述流动池具有附着于或包被于(即固定于)一个池中的电极或单个池中的单个电极上的至少两种不同的抗原类似物。
应当理解表述“附着于或包被于或固定于电极上的抗原类似物”包括介于结合抗体的抗原位点和流动池电极的金属表面之间的各种间隔分子。我们的国际专利申请WO2004001417和WO20041416包括了所述间隔分子的实例。
预定的抗原的不同抗原类似物，各自与特异于所述的抗原以形成免疫复合物结合。免疫复合物包被的压电晶体微量天平的流动池在传感器系统中作为活化抗体的流动池，其中所述的系统使用适于在流体样品(即待测溶液)中检测至少两种不同的被分析物(即待检测的预定被分析物)的置换模式。
采用具有一个、两个或多个流动池的压电晶体微量天平仪，本发明的稳定的或稳定化的混合物能快速分析可能存在的药物和/或爆炸物，其中所述的流动池在筛选环境(如在海关或机场旅客管理)中包含待检测的预定抗原的至少两种不同的抗原类似物。
不必标记混合物的抗体，因此本发明的混合物能使无标记的免疫传感器系统用于检测药物、爆炸物和本文所述的其它物质。该技术的主要特征是抗体从免疫复合物包被的压电上的置换归因于所述物质的存在。抗体的置换根据晶体振荡特性中的变化、通常根据压电晶体的频率增量进行监测，并且其直接相关于物质的浓度。


图1显示了置换原理。以图中可以看到QCM电极首先被抗原类似物和抗体的免疫复合物包被。当该免疫复合物包被的电极暴露于含有抗原的液体样品时，可溶性抗原在表面上竞争免疫复合物中的抗体，并引起它们的置换，结果导致晶体的频率增加。置换范围直接相关于液体样品中抗原的浓度。然而，设计用于调控灵敏度的免疫复合物是非常精巧的工作。如果表面固定的抗原类似物和抗体之间的亲和力太强，将只有细微的置换或根本没有置换。多数情况下在其它免疫分析技术中，理想的是抗体-抗原的相互作用是很强的和不可逆的。然而，在置换分析中如果在抗原类似物和抗体之间的亲和力太弱，在仅仅有限的时间内抗体非常容易解离并且灵敏度高。
附图简述图1显示了发生于QCM表面上的置换机理。
注意图示不按比例尺。事实上抗体远远大于结合于金属(如金表面)的药物分子类似物。在图的左边，药物分子进入BioCell，其中抗体与传感器上的抗原类似物结合。在右边，在晶体表面上方的溶液中，在药物(即预定抗原)分子的存在下释放抗体。根据质量变化，在药物分子和抗体之间的质量比产生倍增效应。
图2是实施例中所用的分析系统的示意图。
图3显示在注射约4微升含有分别特异于可卡因、海洛因、安非他明和狂喜(MDMA)的0.1mg/ml抗体的抗体混合物后频率降低。
图4显示通过将样品塞循环至流体中而注入含有2ng安非他明的样品，在图4中除了安非他明的池中的正响应之外，在其它池中未观察到响应(交叉反应)。
图5显示含有2ng TNT和2ng可卡因的混合物被注入4个串联池，以及图6显示约2ng TNT被注入相同的池结构中。
在我们的共同未决的国际专利申请WO2004001392中所公开的QCM仪的操作，其内容因此被本文列入作为参考，在滤器上加入待分析的样品或注射样品或通过其它技术将样品注入QCM仪之后是完全自动的。仪器的自动操作包括将被分析物从如滤器脱附到冷点、用合适的缓冲液萃取，随即将含有缓冲液的被分析物导入抗体活化的QCM池用于通过监测频移进行的分析中。图2显示该系统的示意图。
电极的制备根据我们的共同未决的国际专利申请WO20041416和WO20041417，制备了用于置换反应的分析系统仪中的生物池中的QCM电极。压电晶体上的各个金电极被它们各自的抗原类似物包被表面，所述抗原类似物是待检的预定的被分析物-抗原的衍生物。已经修饰了各个包被的抗原类似物以便在溶液中显示抗体比被分析物-抗原更弱的亲和力。表面修饰的QCM晶体被插入流动池室(生物池)中，此后停靠在仪器中的流动系统上。泵入通过连续的池洗脱剂(缓冲液)，该洗脱剂在几分钟内被稳定化。
如下描述典型的分析操作通过将小量体积(样品塞)的待分析的样品水溶液进入循环(looping-in)而将样品导入自动仪器中的池中(参见共同未决的国际专利申请WO2004001392)。通常通过使用某种真空吸尘器或预浓缩器来擦拭可疑的表面和/或收集周围的蒸汽，将待检样品收集在滤器上。根据国际专利申请WO 03/073070中描述的解吸附方法(其内容被本文列入作为参考)或根据用电离剂探针(如我们的共同未决的国际专利申请PCT/SE/000767描述的一种)的提取法，转移和纯化收集在滤器上的样品被分析物。在样品塞被导入流中之前，将抗多种被分析物(即不同抗原)的不同单克隆抗体的混合物(MAB混合物)注入多个池。
有趣的是，用滤器、布或类似物擦拭吸毒成瘾者的皮肤并根据本发明进行的分析对待测药物可给出有效的分析结果。
根据本发明的抗原特异性抗体混合物包含至少两种不同的抗体，并且在一次操作中依赖于期望检测的不同抗原的数目不同，混合物包含如3、4、5、6、7、8种或多种不同的抗体。
待检被分析物的实例是选自下列不同的药物(抗原)可卡因、海洛因、安非他明、甲基苯异丙胺、大麻酚、四氢大麻酚(THC)、亚甲二氧基-N-甲基安非他明(狂喜)，和选自下列的不同爆炸物三硝基甲苯(TNT)、二硝基甲苯(DNT)、六氢-1，3，5-三硝基-1，3，5-三嗪(RDX)、八氢-1，3，5，7-四硝基-1，3，5，7-四嗪(HMX)、四硝酸季戊四醇酯(PETN)，以及硝化甘油(NG)。
例如，根据本发明的抗原特异性的抗体混合物可含有图2-6的每一个中用到的抗体。应该指出特异于爆炸物的不同抗体可与特异于药物的不同抗体混合，因此在一次操作中能同时检测爆炸物和药物。
注入的MAB混合物通常是2-50微升，并且当样品被导入含有QCM电极的池中之前，通过自动微注射从某种MAB的容器注射约几秒钟的MAB，以下通过被整合到仪器中的小瓶来举例说明(参见图2)。在具有连续流的仪器中也可时间间隔、手动或自动注射MAB。
在小量注射MAB混合物后，短期内(典型地少于20秒钟)在所有池中观察到压电晶体的5-200Hz的负频移(参见图3和图4)。
一些附图详述图3微注射4微升抗体混合物并随后导入约40秒钟的空白样品后，来自四组不同的串联式生物池(参见图2)的典型响应。
图4先微注射4微升抗体混合物(对比图3)，随后40秒钟后注入2ng D/L安非他明时，来自四组不同的串联式生物池(参见图2)的典型响应。(串联顺序与图3相同，即可卡因在池1、海洛因在池2、安非他明在池3和狂喜(MDMA)在池4)。
图5先微注射4微升抗体混合物(对比图3和4)、随后40秒钟后注入2ng可卡因和2ng TNT时，来自四组不同的串联式生物池(参见图2)的典型响应。(串联顺序除池2之外与图3相同，即可卡因在池1、三硝基甲苯在池2、安非他明在池3和狂喜(MDMA)在池4)。
图6先微注射4微升抗体混合物(对比图3和4和5)、随后40秒钟后注入2ng TNT时，来自四组不同的串联式生物池(参见图2)的典型响应。(串联顺序与图5相同，即可卡因在池1、三硝基甲苯在池2、安非他明在池3和狂喜(MDMA)在池4)。
根据池中预期的静置时间在20-200微升/分钟之间将仪器中的洗脱剂(即缓冲液)的流动速率保持恒定，但可以在抗体活化步骤和分析过程的样品分析步骤中进行变化。
我们推断最大的优势在于调控抗体对在电极上的抗原类似物的亲和力，以便提高置换反应的灵敏度。通过在洗脱液中添加离液剂(例如尿素、盐酸胍、KSCN)MgCls、多种表面活性剂(如Tween20或Tween80)，将pH调整至可实现离液效果的低于或高于7的值，来进行调控。
总分析时间，包括抗体活化和分析过程(置换)，少于70秒钟(参见图4)。在自动方式中使用我们的国际专利申请WO2004001392中多流动池的压电晶体微量天平，现在分析时间大约是40秒钟。
当稳定化时小瓶中抗体混合物的稳定性在室温下通常是几周或几个月。
在各自的MAB活化后，以重复方式注射有限数目的连续样品。然而，在各自注入样品前需要进行如图4所示的MAB活化，以使灵敏度最大化。如图3和4所示，通过选择性抗体(即特异于被分析物抗原的抗体)活化所有抗原类似物包被的QCM电极。图4也显示在注入含有一种预选抗原(2ng安非他明)的样品后的响应。一个池中频率的阳性响应归因于来自于唯一一个电极(即通过安非他明包被制备且通过含有作为一种抗体的、并特异于安非他明的抗体的抗体混合物活化的唯一电极)的安非他明抗体的选择性置换。在系统中，在任何的剩余池中未观测到交叉反应，其中剩余池可同样地通过用可卡因、海洛因和狂喜(MDMA)类似物进行制备。
使用单个操作的压电晶体微量天平的阵列，至少两种不同的、各自特异于预定抗原的抗体的稳定化混合物可具体用于在待测等分溶液中检测几个单个的被分析物的系统中，该系统包括使洗脱液、抗体混合物和待测溶液的等分液连续流动到并穿过含有压电晶体的隔室的流动工具以及在抗体和存在于待测溶液的等分液中单个被分析物之间的相互作用之后通过单个特异性微量天平测量晶体的振荡特性的变化。
另外，该抗体混合物可用于在分析前同时活化许多单个电极。
典型地，在置换分析前将小量体积、1-50微升(例如4微升)的抗体混合物导入单个池中。该小量体积按照它们彼此与流动相关的顺序穿过池。
商用的，优选一次性的容器，例如小瓶、注射器、盒子或相似物，典型地含有稳定的或稳定化的抗体混合物，以便在筛选环境中在测试几个流体样品的期间用于几个电极的初次活化和中间体的二次活化。
含有本发明的稳定化的抗体混合物的小瓶的一个实例在总体积为1ml的去离子水中包含0.1mg/ml的各个抗原的特异性抗体、2mg/ml的白蛋白、pH 7.4的磷酸盐缓冲液。
稳定化的抗体混合物可用于在流体中检测被分析物的方法中，该方法包括通过使用含有包被了特异抗原的至少一种振荡压电晶体的传感器系统，导入小量体积的特异抗体，随即导入含有被分析物(抗原)的流体样品，以及检测当由于抗原和抗体之间的相互作用而产生的振荡特性的变化时在压电晶体电极上包被层的质量变化。
为了提高该方法的灵敏度和系统流动池的使用寿命，将去污剂例如0.05％的Tween20加入洗脱液中是有利的。
权利要求
1.用于单或多流动池的压电晶体微量天平仪的一种在液体载体中的分离的或合成的亲和性分子的混合物，包含至少两种不同的、各自对预定的被分析物具有亲和力的亲和性分子。
2.根据权利要求1中所述的混合物，其中各个分离的或合成的亲和性分子与预定的被分析物形成选自下列的相互作用对阴离子-阳离子、抗体-抗原、受体-配体、酶-底物、寡核苷酸-具有互补序列的寡核苷酸、寡核苷酸-蛋白质、寡核苷酸-细胞以及肽核酸(PNA)寡聚物-多核苷酸，其中多核苷酸选自RNA、DNA和互补于PNA寡聚物的PNA聚合物。
3.根据权利要求1或2中所述的混合物，其中各个分离的或合成的亲和性分子选自各自对预定的被分析物抗原具有亲和力的单特异性多克隆或单克隆抗体、抗体片段或其衍生物。
4.根据权利要求3中所述的混合物，其中不同亲和性分子的各自浓度为0.01-0.8mg/ml液体载体。
5.根据权利要求1-4中任何一项所述的混合物，其中液体载体是水并且另外含有缓冲液、稳定剂和/或防腐剂。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的混合物，其中各个被分析物选自可卡因、海洛因、安非他明、甲基苯异丙胺、大麻酚、四氢大麻酚(THC)和亚甲二氧基-N-甲基安非他明(狂喜)的不同药物。
7.根据权利要求1-5中任何一项所述的混合物，其中各个被分析物选自三硝基甲苯(TNT)、二硝基甲苯(DNT)、六氢-1，3，5-三硝基-1，3，5-三嗪(RDX)、八氢-1，3，5，7-四硝基-1，3，5，7-四嗪(HMX)、四硝酸季戊四醇酯(PETN)和硝化甘油(NG)组成的不同爆炸物。
8.根据权利要求1-5中任何一项所述的混合物，其中各个被分析物选自不同的生物分子、微生物及其部分。
9.根据权利要求8中所述的混合物，其中微生物选自细菌、细菌孢子、分支杆菌、真菌和病毒。
10.权利要求1-9中任何一项所述的混合物用于导入单或多流动池的压电晶体微量天平仪的液体流的用途。
11.根据权利要求10中所述的用途，其中在导入微量天平仪的液体流之前使亲和性分子的混合物与可能含有一种或几种或预定的被分析物的待测样品溶液混合，以用于与预定的被分析物的被分析物类似物进行亲和性的结合竞争，该被分析物类似物被固定在电极上用于竞争模式分析。
12.根据权利要求10中所述的用途，其中导入微量天平仪的液体流是为了通过附着在预定的被分析物的被分析物类似物上来活化或再活化一个或几个流动池晶体电极，其中该被分析物一类似物被固定在电极上。
13.根据权利要求10至12中任何一项所述的用途，其中将混合物以时间间隔导入微量天平仪的连续流中。
14.根据权利要求13中所述的用途，其中时间间隔选自20分钟至24小时的范围。
15.根据权利要求13或14中所述的用途，其中在用pH调低剂，如甘氨酸复原电极后，将混合物导入微量天平仪的连续流中。
16.含有权利要求1-9中任何一项所述的稳定的或稳定化的混合物的试剂盒。
全文摘要
公开了用于单或多流动池的压电晶体微量天平仪的在液体载体中的分离的或合成的亲和性分子的混合物。该混合物包含至少两种不同的、各自对预定的被分析物具有亲和力的亲和性分子。各个分离的或合成的亲和性分子与预定的被分析物形成选自下列的相互作用对阴离子－阳离子、抗体－抗原、受体－配体、酶－底物、寡核苷酸－具有互补序列的寡核苷酸、寡核苷酸－蛋白质、寡核苷酸－细胞以及肽核酸(PNA)寡聚物－多核苷酸，其中多核苷酸选自RNA、DNA和互补于PNA寡聚物的PNA聚合物。还描述了混合物用于导入单或多流动池的压电晶体微量天平仪的液体流的用途，以及含有该混合物的试剂盒。
文档编号G01N33/553GK1902491SQ200480034168
公开日2007年1月24日 申请日期2004年11月19日 优先权日2003年11月20日
发明者P·曼松, D·贝里格伦, C·隆德贝里, A·－C·赫尔格伦, L·赫瓦尔 申请人:瑞典生物传感器应用股份公司