专利名称：用于高灵敏度地检测多种多核苷酸序列的微阵列支持物的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的微阵列制备方法、所获得的微阵列支持物、包含它们的试剂盒以及它们用于高效地检测存在于生物学样品或测试溶液之中的多种靶多核苷酸(或核苷酸序列)的用途。所获得的微阵列支持物尤其可用于分子诊断和基因表达分析。本发明的微阵列支持物也允许鉴定、检测和/或定量通过遗传扩增所获得的大量基因或基因产物(扩增子)，这些基因或基因产物存在于样品之中，并由包含所述基因的属于不同遗传分类组别(纲、科、属、种、个体)的(微)生物体获得。
背景技术：
多个表达基因的鉴定以及(微)生物体的鉴定可通过来自遗传物质的特定序列的检测实现。(样品中存在的)表达基因的鉴定和定量通常是在将mRNA反转录为其相应的cDNA后并检测所述cDNA进行的。特定(微)生物体的检测通过扩增(或复制)(样品中存在的)基因组DNA的特定序列、然后检测和/或鉴定所扩增的序列而很容易地进行。在这两种情况下，所扩增或复制的序列(靶序列)都可介由与存在于或连接于根据微阵列的固体支持物之上的相应俘获分子的特异性杂交而予以检测。与其特异性俘获分子结合的靶序列的定量允许估计样品中存在的mRNA或基因组DNA的含量。优选地，合适的对照手段包括在内，并进行必要的校正以考虑不同步骤的效率，例如靶序列的复制或扩增步骤以及它们介由与形成微阵列的俘获分子的杂交的结合。微阵列为主要是根据两种方法制造的固体支持物。第一种方法在美国专利5,510,270和5,700,637中有描述，是基于位于固体支持物表面的俘获序列的光蚀刻原位合成。光蚀刻DNA合成使用的是快速固相亚磷酰胺(phosphoramidite)化学。位置及顺序的控制是通过组合可因光照射而激活的5′-光保护的亚磷酰胺和在适当位置上含有光得以通过的孔洞的系列光罩实现的。一经激发，在此操作初期合成的部分寡核苷酸序列上存在的光保护基团即被除去，而寡聚体则在添加有关单体之后延伸又一个核苷酸。当前的偶联效率对这些微阵列造成大约25个碱基实际大小限制的影响。除此限之外，还积累不完全产物，削弱了该测定的特异性。根据本方法的俘获寡核苷酸大小或长度方面的限制是归因于逐步进行的合成的效率并非100％、从而在同一位置内发生截短的寡核苷酸的积累的事实。光蚀刻法导致了支持物上短寡核苷酸的存在。该方法的主要优势在于使如此获得的俘获核苷酸序列小型化以及产生含数千个俘获核苷酸序列的高密度阵列的可能性。第二种方法是基于化学或酶促合成俘获序列，之后机械沉积到已知的(根据固体支持物表面的)特定位置上。利用这种方法，在待点样、沉积或连接的序列的大小方面没有限制，因为它们可根据任何化学或酶促方法合成，且其序列可通过分析方法(通常为测序法)加以确认。与原位合成途径相比，沉积技术的主要优势在于其重要的多功能性。该方法允许制造具有实际上任何目的俘获分子的微阵列，包括但不限于任何长度的核酸序列、抗体、脂质、碳水化合物、小化合物等。此外，可优化序列的合成、可纯化序列、可在用前检验其质量和/或在偶联至固体表面前调整其浓度。不过，该方法的一个劣势在于此操作费时，因为每一个俘获分子序列在点样到根据阵列的固体支持物表面前都必需分别处理，因而限制了所获得的微阵列的大小。与寡核苷酸微阵列杂交的化学明显不同于由长DNA俘获序列或分子构建的阵列。已观察到长的特定俘获序列提供了比其相应短片段好得多的溶液或样品中存在的互补靶序列的结合。在实践中，长多核苷酸俘获序列用于长多核苷酸靶序列的直接结合。在典型的基因表达实验中，用于cDNA结合的俘获核苷酸序列含50个碱基或更多，例如70个碱基或者可能甚至含600个碱基或核苷。当仅有15-20个碱基的短寡核苷酸用作为俘获序列时(参见US5,510,270)，长cDNA的结合罕见且可能不可检测。为充分地检测、鉴定和/或定量长cDNA，需采取以下附加步骤。通过使用携带T7RNA聚合酶转录起始位点的引物，首先将RNA序列反转录为相应的cDNA。然后将这些cDNA序列在体外重新转录为若干RNA拷贝，随之将其切割成小片段。然后利用这些小RNA片段在携带针对这些RNA片段中每一个的系列俘获序列的阵列上进行杂交。片段化是必需的，以确保靶RNA序列充分地接近极短的俘获序列。需要特定的算法以恰当地将这些不同俘获分子的杂交模式与靶DNA或mRNA的原始序列联系起来。
为了能够检验特定靶序列的特异性杂交，也有必要为每一个俘获核苷酸序列实施对照，这包括添加除了一个碱基的差异之外与俘获核苷酸序列相同的对照俘获核苷酸序列。另一个问题因双链DNA(dsDNA)而起。当待于微阵列上分析dsDNA时，将优选其在溶液中重新结合，而不与存在于或连接于固体基质表面的相应俘获核苷酸序列杂交。利用短寡核苷酸直接鉴定和/或定量大的双链扩增子(遗传扩增后获得的)产生极低的灵敏度或者根本不灵敏，因此并不实用。再次地，扩增子必需使用由携带T3或T7序列的引物进行的双链扩增操作、然后是使用RNA聚合酶的反转录重新转录为RNA。这些RNA被切割成大约40个碱基的片段，之后于阵列上检测(参见国际专利申请WO97/29212的实施例1)。这里利用了小于30个核苷的俘获核苷酸序列，将上述技术应用于结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)rpoB基因的鉴定。所述方法就其不允许直接检测由遗传扩增反应(如PCR)产生的扩增子、而是需要另一轮的反应和靶序列的复制而言很复杂，这在所述靶序列的定量中分别引入了额外的偏差。然而，介由短多核苷酸序列的化学合成和沉积构建微阵列是有用的，因为它是快速且廉价的方法。除此之外，俘获分子或序列的设计可根据待分析或辨别序列的要求而容易地调配。不过，如上文所解释的那样，使用短核苷酸俘获探针对长靶核苷酸片段的检测造成强大的限制。
发明目的本发明旨在提供用于获得无现有技术中缺点的微阵列支持物的新颖的制造方法。本发明尤其旨在提供用于快速构建携带序列的微阵列支持物的新颖方法，其在检测方法中有利地将(1)短核苷酸序列对待检测、鉴定和/或定量的靶核苷酸序列特异的高特异性和(2)长核苷酸序列的高灵敏度(与超过150个碱基的长核苷酸序列的结合灵敏度相同)结合起来。本发明的另一个目.的在于提供高度适合于直接检测cDNA或长双链DNA序列的新颖的(微)阵列支持物。本发明的另一目的在于提供新颖的构建方法，以获得高度适合于进一步调配并构建适应不同客户需求的可定制(微)阵列的标准(微)阵列固体支持物。
发明概述本发明的第一方面涉及用于获得位于固体支持物表面的核苷酸组(set)(微)阵列的新方法，以用于检测、鉴定和/或定量很可能存在于生物学样品或测试溶液之中的至少两种、优选四种不同靶多核苷酸或核苷酸序列。有利地，所述方法包括步骤-将核苷酸线序列(line sequence)固定于固体支持物表面，所述核苷酸线(nucleotide line)长至少20个核苷酸，并且具有与待检测和/或定量的靶核苷酸序列无关的(随机)核苷酸序列(这意味着所述序列不能够与所述靶核苷酸序列互补杂交)；-将核苷酸钓钩(hooks)置于由所述核苷酸线所覆盖的固体支持物表面的至少4个特定位置上，所述钓钩具有对于所述待检测和/或定量的靶多核苷酸序列特异性的序列；和
-使苷酸钓钩与核苷酸线在所述特定表面位置上共价连接，以便在固体支持物表面的所述特定位置上形成对于所述靶多核苷酸或核苷酸序列的结合特异性的多核苷酸组。核苷酸线通过其末端之一(5′或3′)将序列共价固定至固体支持物表面，并能够通过另一未结合的末端固定核苷酸钓钩。此简单且不贵的方法中获得的具有长核苷酸组构建体的阵列提供了(1)短特异性核苷酸钓钩序列的高特异性，其中每一种核苷酸钓钩对至少四种不同多核苷酸或核苷酸序列中的一种靶序列是特异的，和(2)高灵敏度，达到了超过150个碱基、很可能超过350个碱基的长多核苷酸序列的有利的灵敏度。此外，优选的方法旨在通过沉积核苷酸线而获得固体支持物表面均一和有效的覆盖，其允许核苷酸钓钩与这些核苷酸线在固体支持物表面的特定位置上进一步共价连接。并非所述固体支持物表面都导致形成多核苷酸组，因为所述固体支持物表面的有些位置依然仅被核苷酸线所覆盖。
或者，通过例如为链抗生物素蛋白、抗原或抗体(与早已固定于固体支持物表面的互补分子(生物素、抗体、抗原)相结合)的接头分子将线核苷酸序列固定于固体支持物的表面。
这样，也可能通过根据本发明的方法仅仅选择固体支持物表面上包括了能够与待检测、鉴定和/或定量的相同或不同靶多核苷酸或核苷酸序列结合的(与所述线)相似或不同地相连的核苷酸钓钩的特定位置。本发明的固体支持物表面优选每cm2包含至少四个点样点的多核苷酸组的微阵列。此阵列的核苷酸线序列可以是一个随机(同一随机)序列或者可以是多随机(不同随机)序列。优选地，所述核苷酸线不包含或者不是由能够在所用条件下与生物学样品或测试溶液之中存在的待检测和/或定量的任何靶多核苷酸或核苷酸序列杂交的序列构成的。两核苷酸链的杂交，如所属领域的熟练技术人员所公知的那样，是由两序列的同一性或相似性百分比决定的，并由所用的杂交条件(如严谨、轻度严谨或非严谨条件)决定。
在本案中，术语“不杂交”的含义意味着将有少于1％的靶杂交到俘获多核苷酸上，且优选少于0.1％，而且甚至优选少于0.01％。为避免杂交，靶多核苷酸(或核苷酸)序列与其特异性或对应的核苷酸线序列之间将有不多于约15个连续互补碱基对的结合，优选可能将有少于10个这样的配对，更优选少于5个。这样，核苷酸线的序列将含有优选少于15个碱基，并且更优选少于10个，而且还更优选少于5个与待检测的靶序列互补的连续碱基。可能的连续序列的确定通过将该序列与如由Genbank所提供的分子数据库比较并利用诸如Nucleotide-nucleotideBLAST(blastn)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)的软件很容易进行。根据本发明的另一个实施方案，核苷酸线是通过支持物上核苷酸序列的原位合成获得的。根据本发明另一优选的实施方案，核苷酸线具有由大约20个-大约1000个核苷酸组成的序列，更优选大约50个-大约200个核苷酸，而且甚至更优选大约60个-大约100个核苷酸。根据本发明的另一个实施方案，与核苷酸钓钩偶联的核苷酸线是具有不同结合亲和力并连接于不同固体支持物的序列，其中这些固体支持物中的每一个都以特定的化学或物理条件或性质为特征，例如特定的化学或物理结合亲和力(即不同珠子的不同化学或物理性质包括(但不限于)不同的大小、荧光、颜色、磁性等)。该技术特征允许通过分析它们所结合的固体支持物的化学或物理性质来辨别序列。根据本发明，待检测、鉴定和/或定量的靶多核苷酸或和核苷酸序列为DNA或RNA序列，如基因组DNA或扩增子，它们很可能在其结合到核苷酸钓钩之前被扩增或复制。本发明的另一方面涉及通过根据本发明的方法可获得的微阵列，用于检测、鉴定和/或定量很可能同时存在于生物学样品或测试溶液之中的至少2种、至少4种、优选至少10种、更优选至少30种不同靶多核苷酸或核苷酸序列。本发明的另一方面涉及固体支持物，其包括具有长至少20个核苷酸的随机序列的核苷酸线，且所述核苷酸线通过其序列的第一末端均一地共价固定于固体支持物的表面，即用于制备根据本发明的微阵列的表面。所述“经处理的”固体支持物可被客户作为适应于制备检测微阵列固体支持物的中间产品直接使用；在添加核苷酸钓钩(以与核苷酸线相连)之后，客户能够在所述“经处理的”固体支持物表面的特定位置上形成多核苷酸组。
该固体支持物在下文被定义为“可定制的(customizable)微阵列”。有利地，核苷酸线序列的另一(游离)末端(未固定至表面的)优选包含能够在之后与(很可能是官能团化的)核苷酸钓钩序列共价(以形成连接)反应的反应基团或官能团。优选地，所述核苷酸钓钩也是以能够与核苷酸线(官能团化或否)反应(以形成连接)的一个或多个官能团的反应性化学基团为端点的序列。优选地，核苷酸线末端的所述反应性化学官能团或基团是由能够与核苷酸钓钩末端的NH2官能团直接反应的醛、环氧化物或丙烯酸酯官能团组成的。在优选的实施方案中，固定在支持物上的核苷酸线在其游离末端(或附近(这意味着允许与另一核苷酸序列(钓钩序列)的末端相结合的距离))含有核苷酸核糖。所述核糖被进一步氧化为醛，以便随后固定核苷酸钓钩末端的NH2官能团。有利地，固体支持物表面上的多核苷酸线和/或多核苷酸组的密度超过10fmole、优选100fmole/cm2固体支持物表面。在另一优选的实施方案中，线序列和钓钩序列之间的共价连接并非磷酸二酯键连接。本发明的另一方面涉及所述的固体支持物，其中固定的具有官能团化序列末端的核苷酸线通过共价连接与核苷酸钓钩结合，形成多核苷酸组，其中所述固体支持物表面仅在该固体支持物表面的特定位置上包含与核苷酸线结合的核苷酸钓钩，并且其中其它位置上仍仅被核苷酸线所覆盖。
这意味着固体支持物表面包含两类固定的核苷酸序列固体支持物特定位置上的多核苷酸组，以及所述固体支持物表面其它位置上的优选由反应活性的化学基团和官能团官能团化的核苷酸线。其它位置是可用于进一步固定钓钩的那些位置。这类固体支持物在下文被定义为“定制的微阵列”或“半定制的(semi-customized)微阵列”。这意味着这类“定制的微阵列”在固体支持物表面包括可被客户修饰的特定位置，以便在向核苷酸线添加特定的核苷酸钓钩(由客户选择)之后在固体支持物表面的特定位置上形成其它多核苷酸组，所述核苷酸钓钩能够与核苷酸线的官能团化末端共价反应。
在另一方面，“半定制的微阵列”也包括由两类固定的核苷酸序列组成的固体支持物表面固体支持物不为核苷酸线(根据现有技术中的阵列)所覆盖的特定位置上的标准多核苷酸，以及所述固体支持物其它位置上的核苷酸线。这意味着这类定制的微阵列包含预先点样到固体支持物特定位置上的常规多核苷酸，以及位于所述固体支持物其它位置上的核苷酸线，其能够被客户修饰以便在添加特定核苷酸钓钩之后在被核苷酸线所覆盖的固体支持物表面的特定位置上形成多核苷酸组。本发明的另一方面涉及包含选择用于获得为客户改造的微阵列的根据本发明(可定制微阵列或定制微阵列)的工具和介质的固体支持物的试剂盒。此类工具和介质优选为能够与核苷酸线或核苷酸钓钩末端反应的化学基团或官能团、能够与官能团化的核苷酸线反应的核苷酸钓钩(优选官能团化的)，以及可用于洗涤固体支持物表面以除去未结合的核苷酸钓钩序列的介质(缓冲液)。存在于根据本发明的试剂盒之中的核苷酸钓钩(优选为官能团化的核苷酸钓钩)根据客户的应用需求选择。因此，该试剂盒是可变通的，并可根据所需的样品中多个靶分子的检测、鉴定和/或定量调整。这意味着根据本发明的“定制的微阵列”可已经在固体支持物表面的特定位置上包含具有特定核苷酸钓钩的多核苷酸组，所述多核苷酸组存在于根据阵列的所述特定位置上，且其分布信息提供给客户，以使他能够用另外的序列在其它特定位置上完成所述“定制的微阵列”的制备，用以改善所需的多个靶分子的检测、鉴定和/或定量。存在于试剂盒之中的工具和介质也被选择用于实施一个或多个遗传扩增或复制步骤以及用于获得多个目的核苷酸序列的特异性检测、鉴定和/或定量。所属领域技术人员众所周知的此类工具和介质包括引物、循环仪、聚合酶或其它介质，例如用于获得由靶核苷酸序列与其相应的核苷酸组的结合所引起的信号的荧光、比色和/或放射性标记。多个靶分子的检测、鉴定和/或定量可介由肉眼进行，但优选在特定的仪器如自动读数器中进行，优选配备有必要的软件用以检测和/或解读因靶分子与其各自的俘获分子(多核苷酸组的钓钩末端)结合所产生的信号。此类仪器可完全自动化。在本发明上下文中，术语“核酸”、“寡核苷酸”、“靶或核苷酸序列”、“阵列”、“核苷酸序列”、“靶核酸”、 基本上结合”、“与…特异性杂交”、“背景”、“定量”等的含义如国际专利申请WO97/27317中所述，特此将其并入作为参考。本上下文中的术语“多核苷酸”是指至少2个核苷酸或核苷酸类似物的核苷酸序列或核苷酸样序列。术语“寡核苷酸”或“短多核苷酸”尤其是指少于100且优选少于50个核苷酸或核苷酸类似物的核苷酸或核苷酸样序列。术语“长多核苷酸”是指多于100个核苷酸的核苷酸或核苷酸样序列。核苷酸、寡核苷酸等包括类似的物质，其中糖-磷酸主链被修饰和/或替换，只要其杂交性质未受损害即可。作为举例，主链可被替换为等价的合成肽，称之为肽核酸(PNA)，或替换为嵌核酸(INA)。术语“同源序列”和“同源物”的含义如欧洲专利EP1266034所述，将其并入作为参考。本上下文中用于构建微阵列的术语“固体支持物”旨在包括任何类型的固体材料，可对其进行物理操作以实施必要的反应，象温育很可能含有靶核苷酸序列或靶核苷酸序列拷贝的测试溶液或样品。该固体支持物可以是独一的，或者可以是由数种材料组成的复合物，其中之一为基质(substrate)，在其上固定序列以产生微阵列。本领域所用基质的典型实例为聚合物，其可被官能团化以更好地固定俘获分子。在其上固定核苷酸线的所述基质或支持物可以是有孔或无孔支持物，可以是平滑或粗糙的，并且可被放置或安置到例如由玻璃或塑料制成的另一固体支持物之上。
术语“样品”、“生物学样品”或“测试溶液”旨在包括怀疑含有靶核苷酸序列的任何样品或溶液。在本发明的上下文中，检测的特别是对于(微)生物或其组分特异的多核苷酸或核苷酸序列。测试溶液可以是含有扩增产物(微)生物或其组分扩增子的溶液。
术语“均一地”旨在包括固定于固体支持物表面的均质的核苷酸线层。在本上下文中，每cm2表面的核苷酸线密度是均一的，固体支持物表面不同部分的差异小于30％且优选小于10％。阵列不同点上核苷酸钓钩的固定必需是定量的且相似的，因为核苷酸钓钩是存在于同一样品中的多个靶核苷酸的俘获分子，对于其含量必需加以量化并彼此相当。本发明将参照附图在下列实施例和具体实施方案中更详细地加以描述。所述实施例、实施方案和附图无论如何都不旨在限制所主张的本发明的范围，所用的参考标记也不是。
图1表示根据本发明具有核苷酸线(1)、核苷酸钓钩(2)和多核苷酸组(3)、用以在被核苷酸线(1)所覆盖的固体支持物表面(5)特定位置(6)上特异性检测、鉴定和/或定量样品中的多种靶多核苷酸或核苷酸序列(4)的阵列。
图2表示根据本发明被存在于特定位置(6)上的线(1)或(线-钓钩)多核苷酸特异性组(3)所覆盖的阵列(5)表面。用于构建(微)阵列的固体支持物表面均一地覆盖有核苷酸线(1)。
图3表示根据本发明“半定制阵列”的表面，其一部分(7)覆盖有存在于支持物(6)特定位置上的某些靶序列所特异的多核苷酸组，而表面(5)另一部分(8)覆盖有用于进一步的核苷酸钓钩(2)结合的核苷酸线(1)，以便提供特定的多核苷酸组(3)用于进一步的靶检测。
图4表示根据本发明“半定制阵列”的表面，其一部分(7)覆盖有存在于不被核苷酸线(1)所覆盖的支持物(9)特定位置上的某些靶序列所特异的多核苷酸，而表面(5)另一部分(8)覆盖有用于进一步的核苷酸钓钩(2)结合的核苷酸线(1)，以便提供特定的多核苷酸组(3)用于进一步的靶检测。
发明详述 本发明涉及新颖的构建法，其产生高度适合于检测很可能存在于生物学样品或测试溶液之中的多个靶核苷酸序列、尤其是cDNA序列或长双链DNA序列的新颖的(微)阵列。在根据本发明的一个实施方案中，如此获得的阵列固体支持物表面(5)的至少一部分很可能随机地覆盖有作为核苷酸线(1)的核苷酸序列，然后在其上的特定位置(6)上沉积特定的核苷酸钓钩，以产生多核苷酸组(3)，其允许相应的靶核苷酸序列的特异性结合。最后结合的序列(也称之为多核苷酸组(3))为长核苷酸序列或一部分为与支持物结合的非特异性序列、而另一部分为特异性识别或结合待检测靶序列(4)的序列的多核苷酸(见图1和图2)。所述多核苷酸组(3)也被称之为俘获序列、特异性俘获序列或对应的俘获序列，意味着它们以其互补于靶核苷酸序列的部分序列识别靶核苷酸序列。
在本发明优选的实施方案中，核苷酸线(1)存在于与样品接触的基质或微阵列支持物的整个表面(5)上。然后该表面被特定的核苷酸钓钩(2)部分或完全地覆盖。
在本发明特别的实施方案中，所有的核苷酸线(1)可能由相同的随机序列组成，其不与靶生物体基因组上多于10个的连续碱基互补。
在本发明的另一个实施方案中，线核苷酸序列(1)并不完全相同，即核苷酸线并不都具有相同的序列，而是涵盖了大量的不同序列。核苷酸线的序列可能是已知或未知的。
在特别的实施方案中，核苷酸线(1)的序列为随机序列，例如利用4核苷前体混合物经由原位合成所获得的随机序列。正如所属领域技术人员所公知的那样，给定序列的反应取决于反应的严谨性。交叉反应的概率主要地取决于序列同源性或同一性。在随机合成中获得与另一个相同的25个核苷的序列的概率为1/425或1/1×1015。考虑到相同序列这种极低的频率，线(1)的随机合成对于本发明的目的是可行的。
在优选的实施方案中，在沉积到阵列之前从而在固定到线(1)上之前化学合成本发明的核苷酸钓钩(2)或钓钩。酶促合成也是可能的。
在本发明特别的实施方案中，核苷酸钓钩(2)为寡核苷酸或短多核苷酸，具有由大约10个-大约120个核苷酸组成的序列，更优选大约15个-大约60个核苷酸，更优选大约20个-大约50个核苷酸，更优选大约20个-大约40个核苷酸。本上下文中的“大约”是指有可能要比所提及的多或少1、2、3到多达5个核苷酸。
在特别的应用中，(微)阵列携带具有少于大约100个核苷酸或碱基的序列的核苷酸钓钩(2)，但提供与具有多于大约150个核苷酸或碱基的长多核苷酸序列相同的结合效率。更优选地，它们提供与长于大约250个核苷酸或碱基的长多核苷酸序列相同的结合效率。介由核苷酸钓钩(2)与至少大约20个、大约40个碱基或核苷酸的核苷酸线(1)的结合、偶联或共价连接，这是可能的。
在特别的实施方案中，(微)阵列由具有核苷酸线和待检测和/或定量的至少4、10、20、50种不同靶核苷酸序列的特异性核苷酸钓钩的至少4、10、20、50、100、1000、10000个位置组成。此类阵列具有至少4、10、20、50、100、1000或10000个点/cm2。
在特别的实施方案中，线以及待检测的不同靶核苷酸分子的钓钩序列存在于至少4、10、20、50、100、500或1000个物理上不同的支持物上(优选为珠子)，每一个支持物通过优选不同的化学或物理性质(大小、磁性…)鉴定。
在特别的实施方案中，核苷酸线(1)和/或核苷酸钓钩(2)为DNA或RNA序列、PNA(参见国际专利申请WO0075372)或INA。
在本发明的实施方案中，在俘获到阵列上之前，介由已知的遗传扩增法例如象PCR法复制、扩增或拷贝待检测的靶序列(即多核苷酸或核苷酸序列(4))。
在优选的实施方案中，核苷酸线(1)的末端(5′或3′)通过化学反应固定到固体支持物或基质上。
优选地，所述核苷酸线(1)被选择性官能团化，以含有或携带特定的反应性化学官能团或基团，其与可能官能团化的支持物或基质反应，形成共价结合。化学官能团或基团可以是醛、胺、环氧化物、丙烯酸酯、硫氰酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺…，上述列表并非详尽的。
优选的结合是在5′氨化末端的核苷酸序列和醛覆盖表面之间获得的，形成亚胺键，其随之在NaBH4的存在下被还原。
优选地，所述化学官能团或基团位于5′或3′末端。核苷酸线共价固定在支持物上；核苷酸线的第二末端在第二步中通过合适的化学或物理工具激活，从而获得化学反应性官能团用以固定核苷酸钓钩。核苷酸钓钩含有适当的基团或官能团，以与核苷酸线共价偶联。反应性基团或官能团再次地可以是但不限于醛、胺、环氧化物、丙烯酸酯、硫氰酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺…位于核苷酸序列末端(最后一个碱基)或接近末端的末端工具距末端碱基小于50个碱基，且优选小于10个碱基。
在本发明的另一个实施方案中，核苷酸线(1)可通过结合到接头上而固定到阵列支持物上。在优选的实施方案中，将链霉抗生物素蛋白固定到支持物上，并使生物素化的核苷酸线与包被的支持物温育，从而通过生物素和链霉抗生物素蛋白之间的识别发生线的结合。另一种可能性包括使用合适的抗体-抗原或受体-配体对，以实现核苷酸线到支持物的有效结合。所属领域技术人员掌握不同的备选方案。
在优选的实施方案中，核苷酸线(1)含有末端核糖，其随之通过高碘酸盐处理而被氧化，这导致形成醛基。这些醛基可用于氨化核苷酸钓钩(2)的结合，两者的偶联形成亚胺键。该亚胺随之被还原，产生共价胺的稳定连接。末端核糖也指位于邻近线未结合末端的核糖，这意味着距离末端碱基小于50个碱基，且优选小于10个碱基。
在另一实施方案中，可利用介由亚磷酰胺法的固相合成将核苷酸钓钩(2)共价结合到核苷酸线(1)上。在一个实例中，核苷酸线在固体支持物表面上原位合成。核苷酸线的最后一个核苷酸在核糖上携带游离5′-OH，其能与存在于核苷酸钓钩最后一个核苷3′位的亚磷酰胺基团共价反应。
在本发明优选的实施方案中，核苷酸钓钩(2)以每cm2固体支持物表面超过10fmole且优选100fmole的密度存在。
在本发明特别的实施方案中，微阵列上用于检测的每一个特定位置都覆盖有一类特定的核苷酸钓钩。一类钓钩优选仅由一种分子组成。不过，实际上多核苷酸的合成是由一个核苷酸跟着一个核苷酸进行的连续过程。既然每一个连续反应都没有100％的产率，将有产生异质混合物的次级产物的累积。只要次级产物的污染水平不高到以至于它扰乱了相应靶序列或分子的特异性结合和识别或鉴定，终产物中此类次级产物的存在对于本发明的应用是无害的。
本发明的一方面涉及固体(不溶)支持物，其在所述固体表面(5)给定位置(6)上含有固定(在核苷酸线末端)的对给定靶多核苷酸或核苷酸序列(4)特异的核苷酸钓钩(2)，所述核苷酸钓钩(2)在其共价连接到长至少20个核苷酸的多核苷酸线(1)之后得以固定，从而形成靶-特异性的多核苷酸组(3)，所述阵列允许对很可能存在于生物学样品或测试溶液中的多种、优选至少4种不同靶多核苷酸或核苷酸序列(4)进行特异性检测、鉴定和/或定量。
本发明另一方面涉及固体(不溶)支持物，其表面(5)(有限的部分)覆盖有长至少20个核苷酸的核苷酸线(1)，并在该表面(5)给定的位置(6)上含有对给定的待检测靶多核苷酸或核苷酸序列特异的核苷酸钓钩(2)，所述核苷酸钓钩(2)与所述核苷酸线(1)共价连接，从而形成靶-特异性多核苷酸组(3)，所述阵列允许对可能存在于生物学样品或测试溶液中的多种、优选至少4种不同靶多核苷酸或核苷酸序列(4)进行特异性检测、鉴定和/或定量。
本发明特定的实施方案涉及固体支持物，在其表面(5)第一部分(7)包括在空间上隔开的用以检测第一组靶多核苷酸序列(4)的至少3个固定的多核苷酸组(6)；且在该固体支持物表面(5)第二部分(8)包括不能与所述第一组靶分子结合、但能够在空间上隔开的位置上固定、结合或俘获用以检测第二组靶多核苷酸序列(4)的靶特异性核苷酸钓钩(2)的核苷酸线(1)(见图3)。优选地，第二组包括至少2种不同的俘获分子，优选至少4种不同的俘获分子。
本发明另一个特别的实施方案涉及固体支持物，在其表面第一部分(7)包括第一组至少3个固定的标准多核苷酸序列，它们固定在不被核苷酸线(1)所覆盖的特定表面位置(9)上，且在空间上隔开，用以检测第一组靶多核苷酸序列(4)，且在该固体支持物表面(5)第二部分(8)包括不能与所述第一组靶分子结合、但能够与用以检测第二组靶多核苷酸序列(4)的靶特异性核苷酸钓钩(2)形成共价连接的核苷酸线(1)(见图4)。
两组靶分子可能都存在于同一样品或测试溶液之中。优选两组都以相同的效率结合、俘获和/或检测。如果需要，所述第一和第二组的检测效率被校正以恰当地定量存在于样品或测试溶液之中的靶分子。
在本发明的一个实施方案中，第一组多核苷酸组独立于第二组的制备和固定而先行制备。在特别的实施方案中，第一组仅仅存在于阵列支持物中不含线或激活的线(1)的位置上。第二组多核苷酸组是通过将靶-特异性钓钩(2)固定到激活的核苷酸线(1)上获得的。
最优选地，用于将来自第二组的多核苷酸组连接到支持物上的试剂并不导致所述第一组多核苷酸组的完全脱离和/或失活。优选地，所述脱离和/或失活保持尽可能地低。
在另一优选的实施方案中，第一组组为长多核苷酸，而第二组组由根据本发明的线(1)和钓钩(2)组成，钓钩(2)优选为小或短的靶-特异性多核苷酸或寡核苷酸。优选地，多核苷酸组(3)介由存在于固体支持物表面第二部分上的反应性化学基团或官能团与支持物或阵列共价结合，该表面优选为支持物上界定的表面。所述化学官能团或基团可通过化学处理激活。
本发明的另一方面涉及用于检测、鉴定和/或定量可能存在于生物学样品或测试溶液之中的(微)生物或其组分的试剂盒，所述试剂盒包括如上文所述的支持物或微阵列。
当靶分子俘获到所述支持物或微阵列上时，试剂盒可进一步包括用以检测其的必要溶液和试剂。
试剂盒可进一步包括用于实施本发明的方法以获获得本发明的微阵列的工具和介质，携带含连接于核苷酸线的靶-特异性核苷酸钓钩的靶-特异性多核苷酸组，所述俘获多核苷酸组优选以阵列的形式沉积在所述固体支持物的表面上，密度优选为至少4个单链俘获核苷酸序列/cm2固体支持物表面。
本发明支持物或阵列高度适合于检测不同的靶序列，即可能存在于测试溶液或样品之中的至少一种、优选至少4种靶核苷酸序列。属于第一和第二组的靶序列可存在于同一生物学样品之中，并由根据本发明的阵列同时检测。
本发明也涵盖这样的固体支持物，至少在其部分表面均一地固定有核苷酸线，其具有至少20个核苷酸的序列，通过第一末端固定至所述支持物的表面，且另一末端具有与核苷酸钓钩共价反应或能够被激活以与之反应的反应性化学基团。在特别的实施方案中，本发明的阵列或支持物可用于制备半定制的阵列。半定制的阵列是携带固定数目的根据本发明的给定多核苷酸组或可在支持物的其它部分补充有现有技术中具有对所选的其它靶特异的序列的标准多核苷酸序列的阵列。在阵列第一部分具有标准多核苷酸序列或组且在第二部分存有备用于制备所选第二组多核苷酸组的线的微阵列，则将作为其上可根据应用需求点样靶-特异性钓钩的标准产品交付。本发明涉及此类半定制的阵列。
本发明的方法尤其可用于这样的微阵列的标准化生产，其支持物一部分具有针对给定数目的特定靶序列的标准多核苷酸组，而在另一方面具有根据应用以检测不同靶序列的可变通部分，并且是非标准的。以这种方式，可根据用户的需求将标准阵列转化为无限数目的阵列。当在阵列第一位置上使用长多核苷酸集合、而在第二位置上使用容易合成的小寡核苷酸序列时，此类阵列尤为有用。比较两群多核苷酸组的结合效率允许比较存在于测试溶液或样品之中的每一个靶分子的最初含量。优选地，象测试溶液或样品之中添加适当的标准以允许校正两组多核苷酸组的结合效率。
本发明的另一方面包括阵列支持物或基质，其上一部分或第一部分结合有俘获分子用以检测给定的靶分子，而另一部分结合有线，很可能被激活以结合钓钩，适应于检测其它靶分子。
本发明的阵列高度适合于检测和/或定量细胞表达的基因，很可能是在至少部分地将靶基因序列复制为cDNA链、并将cDNA杂交到根据本发明提供的特异性俘获分子之上以后。本发明的方法尤其适用于检测需要及其灵敏的方法的彼此同源的cDNA序列。介由允许此类辨别同时具有良好的结合效率的小或短特异性序列的使用，可辨别同源或几乎相同序列。本发明的方法允许区别仅有一个或数个核苷酸差异、以及因而包含一个或数个SNP(单核苷酸多态性)的靶序列。
有利地，本发明的方法和阵列可用于鉴定和/或定量由生物体或其部分直接获得的-即未经任何在先的扩增步骤-或者在扩增其部分基因组DNA或RNA之后获得的DNA序列、单或双链序列。靶序列的扩增可介由本领域公知的任何方法实现，包括但不限于PCR、LCR、NASBA、滚环或允许产生给定序列相当可信的拷贝的任何其它方法。
微阵列上俘获的靶序列的检测可介由本领域公知的任何物理或化学检测法进行，包括但不限于利用荧光、比色、生物发光、化学发光、电子、表面胞质团共振、电磁信号… 用于构建根据本发明的微阵列的固体支持物或基质优选从由玻璃、电子装置、硅支持物、硅石、金属或其混合物组成的组中选择，制备成选自载片、盘、凝胶层和/或珠子的形式。珠子被视为阵列，只要其具有允许其彼此区分的特征，这样珠子的鉴定与给定钓钩序列从而是靶序列的鉴定相关。上述实例并非是详尽的。
在本发明的实施方案中，俘获的靶序列的检测、鉴定和/或定量通过使用至少包括检测和/或定量装置以检测和/或定量在俘获来自(微)生物的靶序列的阵列位置上形成的信号的仪器而易化，可是有关记录在所述固体支持物表面上的信息的阅读装置，用以识别携带结合其相应多核苷酸组上的靶序列的不连续区域以及它们的位置的计算机程序，可是所述位置上存在的信号的定量程序以及用于将这些位置上信号的存在与所述(微)生物或组分的诊断和/或定量关联起来的程序。本发明延及适应于这些目的且能够阅读本发明的微阵列和阐释其结果的仪器。
实施例实施例1支持物上的核苷酸线固定玻璃支持物的官能化 玻片根据欧洲专利申请EP1184349中描述的方法进行醛存在的官能化。
支持物上核苷酸线的固定 醛支持物上氨化线的固定如下进行。通过化学合成(Eurogentec，Liege，Belgium)合成在5′端拥有氨基而在3 ′端拥有核糖核苷酸的DNA核苷酸线。在milliQ纯水中将其稀释至1mg/l。每一个生物芯片都在含DNA溶液的银绿色管中于室温下搅拌(+/-200rpm)温育60分钟。在室温下洗涤玻片0.2％SDS水溶液2分钟3次、纯水2分钟2次、氢硼化钠溶液(2.5mg/ml NaBH4的PBS/无水乙醇(比为75/25)溶液)5分钟1次以及纯水2分钟1次。然后玻片于95℃用纯水洗涤3分钟。玻片室温下干燥，之后4℃贮存。
实施例2支持物特定位置上的核苷酸钓钩固定支持物上官能化线的激活 DNA核苷酸线上存在的核糖核苷酸以如下方式氧化为醛基。将玻片与新鲜制备的含0.1M pH 5.2醋酸钠溶液(CH3COONa.3H2O，Merck，ref.-1.06267)和25μl0.45M高碘酸钠溶液(NaIO4，Sigma，ref.-S1878)的溶液温育。溶液在支持物上于室温下暗中温育2小时。玻片以1ml醋酸缓冲溶液洗涤，然后以氧化形式于4℃保持备用。
钓钩固定 5′端氨化的核苷酸钓钩通过Eurogentec(Liege，Belgium)化学合成。将其在点样液中稀释(EAT，Namur，Belgium)。DNA溶液由点阵仪(arrayer)使用平针在支持物上点样。玻片于室温下干燥1小时。玻片用洗涤缓冲液洗涤2分钟2次，并用水洗涤3次。玻片于4℃保持在evergreen管中备用。
设计了3种大鼠基因所特异的氨化核苷酸，并具有如下序列SEQIDN°1(钓钩1)大鼠Fas抗原配体(登录号U03470)5′-ataaagttttgggctgctgtgtggcaatgcagaggcaaagagaaggaact-3′SEQIDN°2(钓钩2)大鼠解偶联蛋白2(登录号AB010743)5′-atgccattgtcaactgtactgagctggtgacctatgacctcatcaaagat-3′SEQIDN°(钓钩3)大鼠核糖体蛋白L19(登录号J02650)5′-cgtcctccgctgtggtaaaaagaaggtgtggttggaccccaatgaaacca-3′实施例3通过比色法检测生物芯片上的cDNA 含俘获分子的支持物表面围有杂交框，这界定了与含靶序列的溶液接触的支持物表面。将阵列与生物素化来自大鼠肝的cDNA如Delongueville等2002(Biochem.Pharmacol.64137-149)所解释的那样温育。靶DNA杂交后，洗涤阵列并在含有在封闭缓冲液(EppendorfHamburg，Germany)中以1/100稀释的偶联于20nm金颗粒的15ml抗-生物素抗体(British Biocell International，ref.BL-GAB20)的Evergreen管中于室温下温育45分钟。然后生物芯片用B1缓冲液(Eppendorf Hamburg，Germany)洗涤2分钟5次。每一个生物芯片都在新的Eppendorf管中在Silverquant溶液(Eppendorf，Hamburg，Germany)中于室温下暗中温育10分钟。通过用700μlmilliQ水洗涤2次终止暴露。然后生物芯片在比色Scanarray(Eppendorf，Hamburg，Germany)中扫描和定量。在数字化图像以后，使用软件程序(Eppendorf，Hamburg，Germany)以界定点样点的表面、整合各点信号、扣除各点周围的局部背景、鉴定点样点的分布并将此分布与靶标的密度关联起来。定量是通过将由掺入(spiked)的内部标准获得的信号与不同靶核苷酸点的信号进行比较获得的。
实施例4通过荧光检测生物芯片上的cDNA 实验基本上如实施例3中那样进行，但是在与生物素化的靶cDNA杂交后，阵列与在封闭缓冲液中以1/1000稀释的抗-花菁抗体(Jackson ImmunoResearch，Cy3ref.-200.162.096，Cy5ref.-200.172.096)温育。然后生物芯片用B1缓冲液洗涤2分钟4次。生物芯片于室温下干燥，并由GMS418 ScanArray扫描(总体扫描)。在数字化图像以后，利用imagene程序(Biodiscovery，Marina Del Rey，USA)以界定点样点的表面、整合各点信号、扣除各点周围的局部背景、鉴定点样点的分布并将此分布与靶序列的密度关联起来。样品中存在的靶序列的定量基本上如Delongueville等2002(Biochem.Pharmacol.64137-149)出版物中所述获得。
序列表<110>Eppendorf Array Technologies<120>用于高灵敏度地检测多种多核苷酸序列的微阵列支持物的制备方法和用途<130>BP.EAT.003A/EP<140>EP04447111.8<141>2004-05-04<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>50<212>DNA<213>大鼠Fas抗原配体(登录号U03470)<400>1ataaagtttt gggctgctgt gtggcaatgc agaggcaaag agaaggaact 50<210>2<211>50<212>DNA<213>大鼠解偶联蛋白2(登录号AB010743)<400>2atgccattgt caactgtact gagctggtga cctatgacct catcaaagat 50<210>3<211>50<212>DNA<213>大鼠核糖体蛋白L19(登录号J02650)<400>3cgtcctccgc tgtggtaaaa agaaggtgtg gttggacccc aatgaaacca 50
权利要求
1.用于在固体支持物表面(5)构建多核苷酸组(3)的微阵列的方法，微阵列用于检测和/或定量可能存在于生物学样品或测试溶液之中的至少四种不同的靶多核苷酸或核苷酸序列(4)，所述方法包括步骤-将核苷酸线序列(1)固定于固体支持物表面(5)，所述核苷酸线(1)长至少20个核苷酸，并且具有随机的核苷酸序列；-将核苷酸钓钩(2)置于所述固体支持物表面(5)的至少4个特定位置(6)上，所述钓钩具有对于所述待检测和/或定量的至少四种不同靶多核苷酸序列(4)之一特异的序列；和-使所述核苷酸钓钩(2)与核苷酸线序列(1)在所述特定表面位置(6)上共价连接，以便形成对于所述靶多核苷酸序列(4)的结合特异性的多核苷酸组(3)。
2.根据权利要求1的方法，其中用于构建微阵列的固体支持物表面(5)均一地覆盖有核苷酸线(1)序列。
3.根据权利要求1至2的方法，其中核苷酸线(1)序列通过其末端(5′，3′)之一共价固定至固体支持物表面，并通过另一个末端共价固定至核苷酸钓钩(2)。
4.根据权利要求1至3的方法，其中固体表面每cm2包含至少四个点样点的多核苷酸组(3)的微阵列。
5.根据权利要求1至4的方法，其中核苷酸线(1)的序列包含少于15个碱基，优选少于10个，并且还优选少于5个与待检测靶多核苷酸序列(4)互补的连续碱基。
6.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中核苷酸线(1)序列为多随机序列。
7.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中所有核苷酸线(1)由相同的随机序列构成。
8.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中核苷酸线(1)序列与少于1％、优选少于0.1％并且甚至优选少于0.01％的任一待检测靶多核苷酸序列(4)杂交。
9.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中核苷酸钓钩(2)具有约10个-约120个核苷酸组成的序列。
10.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中在与核苷酸线(1)相连之后，核苷酸钓钩(2)实现了与用至少150个核苷酸的多核苷酸序列所获得的杂交效率等同或比其更高的杂交效率。
11.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中在与核苷酸线(1)相连之后，核苷酸钓钩(2)实现了与用至少250个核苷酸的多核苷酸序列所获得的杂交效率等同或比其更高的杂交效率。
12.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中核苷酸钓钩(2)是化学合成的寡核苷酸。
13.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中核苷酸线(1)在固体支持物表面(5)原位合成。
14.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中偶联于核苷酸钓钩(2)的核苷酸线(1)是对不同靶多核苷酸序列(4)具有不同结合亲和力的序列并且连接于不同固体支持物，每一个这些固体支持物都以特定的化学或物理性质为特征。
15.根据权利要求14的方法，其中固体支持物包含具有不同化学或物理性质的不同珠子。
16.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中靶多核苷酸序列(4)是扩增或复制的核苷酸序列。
17.固体支持物，包含通过其末端(3′或5′)之一均一地固定在该固体支持物至少一个表面(5)上的核苷酸线(1)，所述核苷酸线长至少20个核苷酸，并具有随机的核苷酸序列。
18.根据权利要求17的固体支持物，其中所有的核苷酸线(1)由相同的随机序列构成。
19.根据权利要求17的固体支持物，其中核苷酸线(1)序列为多随机序列。
20.根据前述权利要求17至19中任何一项的固体支持物，其中核苷酸线序列(1)中不与固体支持物表面(5)相结合的末端(5′或3′)包含能够与另一核苷酸序列(2)末端建立共价连接的反应性基团或官能团。
21.根据权利要求20的固体支持物，其中存在于核苷酸线序列末端的反应性化学基团选自醛、环氧化物和丙烯酸酯基团。
22.根据权利要求17至21的固体支持物，其中核苷酸线序列在(或邻近)其非结合末端处包含至少一个核苷酸-核糖。
23.根据权利要求17至22的固体支持物，其中在特定位置结合于固体支持物的核苷酸线(1)的密度超过10fmoles、优选100fmoles摩每cm2固体支持物表面。
24.根据前述权利要求17至23中任何一项的固体支持物，其中在固体支持物表面(5)上特定位置(6)结合的核苷酸线(1)序列提供了与核苷酸钓钩(2)的共价连接，以便在固体支持物表面(5)所述特定位置(6)上形成多核苷酸组(3)，所述核苷酸钓钩(2)具有对待检测和/或定量的一种靶多核苷酸序列(4)特异的序列，并且其中核苷酸线(1)末端和核苷酸钓钩(2)末端之间的共价连接并非磷酸二酯连接。
25.根据权利要求24的固体支持物，在其表面(5)第一部分(7)包括第一组至少3个固定的多核苷酸组(3)，其在空间上被隔开以检测第一组靶多核苷酸序列(4)，而在固体支持物表面(5)的第二部分(8)包括核苷酸线(1)，其不能与所述第一组的靶多核苷酸序列结合，但能够与对于检测第二组靶多核苷酸序列(4)特异的靶特异性核苷酸钓钩形成共价连接。
26.根据权利要求24的固体支持物，在其表面第一部分(7)包括第一组至少3个固定的标准多核苷酸序列，其被固定在未被核苷酸线(1)所覆盖的特定表面位置(9)上，并且在空间上被隔开以检测第一组靶多核苷酸序列(4)，而在固体支持物表面(5)的第二部分(8)包括核苷酸线(1)，其不能与所述第一组靶多核苷酸序列结合，但能够与对于检测第二组靶多核苷酸序列(4)特异的靶特异性核苷酸钓钩形成共价连接。
27.根据前述权利要求17至26中任何一项的固体支持物，其选自玻璃、电子装置、硅支持物、塑料支持物、硅石支持物、金属支持物或其混合物。
28.根据前述权利要求17至27中任何一项的固体支持物，其中所述固体支持物为选自载片、盘、凝胶层和微珠的形式。
29.根据前述权利要求24至28中任何一项的固体支持物，其中在特定位置结合于固体支持物的多核苷酸组(3)的密度超过10fmoles、优选100fmoles每cm2固体支持物表面。
30.用于检测、鉴定和/或定量可能存在于生物学样品或测试溶液之中的(微)生物体或其核苷酸组分的试剂盒，所述试剂盒包括根据前述权利要求17至29中任何一项的固体支持物，以及用于检测由所述微生物体或核苷酸组分获得的靶多核苷酸序列(4)的工具和介质。
31.根据权利要求30的试剂盒，其进一步包括对于待检测和/或定量的一种或多种不同靶多核苷酸序列(4)特异的核苷酸钓钩序列(2)，以及可能的用以允许在核苷酸钓钩(2)序列末端和核苷酸线(1)序列末端之间形成共价连接的试剂。
32.用于检测、鉴定和/或定量可能存在于生物学样品或测试溶液之中的(微)生物体或其核苷酸组分的装置，其包括根据前述权利要求17至29中任何一项的固体支持物，可能存在于根据权利要求30或31的试剂盒之中，所述装置进一步包括能够检测和/或定量在靶核苷酸序列(4)与固体支持物表面(5)的多核苷酸组(3)相结合的位置上形成的信号的检测和/或定量装置，可能是用于读取固体支持物表面(5)上记录的信息的阅读装置，以及用于检测携带与其对应的多核苷酸组(3)结合的靶多核苷酸序列(4)的分离区域及其位置的计算机程序，以将这些位置上检测信号的存在与(微)生物体或其核苷酸组分的诊断和/或定量关联起来。
33.根据前述权利要求30至32中任何一项的试剂盒或装置用于诊断和基因表达分析的用途。
34.权利要求33的用途，用于鉴定、检测和/或定量多种不同多核苷酸靶标，这些多核苷酸很可能通过复制步骤的遗传扩增获得，并由属于不同遗传分类组别(例如纲、科、属、种或个体)的遗传序列获得。
全文摘要
本发明涉及用于在固体支持物表面(5)构建多核苷酸组(3)的微阵列的方法，以用于检测和/或定量可能存在于生物学样品或测试溶液之中的至少四种不同的靶多核苷酸或核苷酸序列(4)，所述方法包括步骤将核苷酸线序列(1)固定于固体支持物表面(5)，所述核苷酸线(1)长至少20个核苷酸，并且具有随机的核苷酸序列；将核苷酸钓钩(2)置于包含所述固定的核苷酸线序列(1)的固体支持物表面(5)的至少4个特定位置(6)上，所述钓钩具有对于所述待检测和/或定量的至少四种不同靶多核苷酸序列(4)之一特异的序列；和使所述苷酸钓钩(2)与核苷酸线序列(1)在所述特定表面位置(6)上共价连接，以便形成对于所述靶多核苷酸序列的结合特异的多核苷酸组(3)。
文档编号G01N37/00GK1702177SQ20051006841
公开日2005年11月30日 申请日期2005年4月29日 优先权日2004年5月4日
发明者J·瑞玛考, K·贝勒瑟尔 申请人:埃佩多夫阵列技术股份有限公司