专利名称：：一种对痕量蛋白质或多肽靶上原位除盐和富集的方法
技术领域：
：本发明属生化分析领域，涉及一种痕量样品除盐和富集的方法。具体涉及利用具有微观相分离结构的嵌段聚合物涂层，对多肽和蛋白质样品进行耙上无需洗脱的原位除盐和同步富集，能避免样品损失，并对所富集的样品直接进行基质辅助激光解析离子化质谱的分析和鉴定的方法。
背景技术：
：随着人类基因组全序列测定的完成，后基因组时代中，生命科学的研究重心将从基因组学转移到蛋白质组学(Proteomics)。蛋白质组研究己成为21世纪生命科学的焦点之一。人类蛋白质组已成为新世纪最大的战略资源之一，是国际生物科技的战略制高点和竞争焦点，将直接关系到未来整个生物技术及相关产业的发展空间和市场份额，对蛋白质组有限资源的争夺将是各国国力世纪性的主要"战场"。蛋白质组比基因组复杂的多，蛋白质组学的发展不仅需要包括数据库整合在内的新技术的发展和新实验战略的建立，而且还需要学科转移和跨学科合作的精神。蛋白质组学研究主要包括样品或组织中的蛋白质分离和鉴定两个关键步骤。生物质谱随着新的软电离方式一一基质辅助激光解析离子源(MALDI)的广泛应用已经成为蛋白质组学技术平台中最为重要的技术手段。日本科学家田中耕一先生正是因为发明了MALDI而荣获2002年诺贝尔化学奖。因为蛋白质组是一个在时间和空间动态变化着的整体，样品体系及其复杂，蛋白质动态分布范围非常广，在样品预处理过程中必须加入一些表面活性剂、去垢剂、尿素等溶剂来增加蛋白的溶解度，随之带来的问题是这些杂质或盐分会大大降低蛋白或肽段的质谱信号，使质谱收集不到足够的样品鉴定信息，所以除盐是蛋白质组学研究，尤其是痕量蛋白质研究中非常重要的处理步骤。另外，蛋白质组样品中高中低丰度蛋白分布广泛，低丰度蛋白又往往担负着生物体内各种重要的生理功能，其极低的含量给后续的分析和检测带来困难，限制了人们对它们的研究和认识，因此低丰度蛋白质的有效浓縮是实现其准确分析和鉴定的重要条件之一。除盐同时不因操作步骤的繁琐和额外的洗脱带来样品的损失，因此在寻找富集低丰度蛋白质有效方法的同时需要简化步骤以减少器皿内壁对蛋白质样品的吸附，这是目前提高低丰度蛋白质检测灵敏度的有效手段。蛋白质组研究的进一步拓展和深入，尤其是对低丰度蛋白质的分析鉴定已经对MALDI技术提出越来越高的要求。现有的MALDI技术由于仅依靠有机基质辅助样品离子化，这样由于溶剂扩散程度的不同、金属靶板表面的微区多样性、溶剂挥发时间不同、基质和样品的溶解性不同、以及盐和其它无机杂质的干扰等因素而导致质谱检测样品灵敏度低和重复性差，这给低丰度蛋白质的检测造成了屏障。早期的做法是用色谱柱作为吸附固定相，利用蛋白质或多肽和固定相之间的强相互作用，利用洗液把盐冲洗走，最后再通过溶剂将蛋白质或多肽洗脱下来送质谱检测。这样虽然可以消除盐和表面活性剂的干扰，但是由于色谱固定相对蛋白质或多肤的吸附能力不同，会导致不对样品的歧视性；同时，这样的冲洗和洗脱过程通常比较繁琐，并且容易引起样品的丢失不符合低丰度蛋白质的检测要求。另一传统的做法是用涂层方法在金属靶的非点样金属表面自组装上一层非极性分子，而在点样金属表面涂覆极性聚合物，或者直接在靶板上点覆疏水性聚合物涂层，把多肽样品点覆在聚合物涂层上，而后再用水洗掉表面活性剂和盐，最后再点加基质。这样不但水洗过程需要一定的经验技术，否则会照成盐洗脱不充分或由于过量洗脱而导致样品也被洗脱，不但影响了检测灵敏度还影响了分析过程的高通量和高速度，不太适合蛋白质组学规模化的应用。
发明内容本发明的目的在于提供一种操作简单、高灵敏度、高重现性、高通量、经济、省时、适应于蛋白质组学研究要求的、对痕量样品除盐和富集的新方法，具体涉及一种利用微观相分离结构的嵌段聚合物涂层对痕量蛋白质或多肽进行耙上原位免洗除盐和同步富集并直接进行质谱分析的新方法。为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案1.选择微观相分离结构的嵌段聚合物作为基质辅助激光解析离子源耙涂层；2.利用制作的微观相分离结构的嵌段聚合物微印迹涂层进行痕量蛋白质或多肽的靶上除盐和富集工作；3.无需额外洗脱也无需点覆过量体积的基质溶液除盐，富集除盐后的样品可以直接进行基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-TOF-MS)分析和鉴定。具体条件如下1.将0.5微升微观相分离结构的嵌段聚合物溶液(0.5mg/mL，溶于四氢呋喃)点覆于每个靶板点上，溶剂迅速挥发，MALDI靶板每个样品池内形成均匀的嵌段聚合物涂层；2.将0.5微升含盐或其他污染物的蛋白质或多肽样品溶液点覆于涂层上，室温自然干燥；3.将0.5微升有机基质溶液例如2-氰基-4-羟基肉桂酸(a-CHCA)点覆在样品表面，室温自然干燥；4.—直接激光激发样品表面进行MALDI-TOF-MS测定。本发明的微观相分离结构的嵌段聚合物涂层MALDI样品制备技术，可以非常有效的实现样品无需洗脱而得以除盐和富集的效果，无需额外的水洗过程，也无需点覆过量体积的基质溶液就能达到提高检测肽段和蛋白质灵敏度的目的。本发明采用的嵌段聚合物，其结构中具有亲水和疏水的两端，在点覆样品溶液后，由于疏水端不溶解在样品溶剂中，而保持嵌段聚合物在金属上的膜稳定性；亲水端则可以溶解在样品溶剂中并对盐和一些污染物具有强的吸附作用，因而在样品溶剂挥发的过程中，盐和其它污染物被牢牢地包裹在聚合物内部。点覆基质溶液后，由于盐和一些污染物被牢牢抓住，不再进入到基质的溶剂中，而肽段和蛋白质会再次溶解在基质中并和基质形成结晶；同时，由于嵌段聚合物总体的疏水性，使得以样品溶液存在强的表面张力，从而保证蛋白质或肽段溶液被收縮在聚合物表面，从而实现了样品无需洗脱就实现除盐与富集的技术。将靶板直接送入MALDI-MS分析，用激光激发样品表面即可获得高灵敏度、高重现性的质谱信号。本发明由于样品的样点面积相比传统方法縮小了，而且在平整的聚合物表面上样品分子与基质分子更容易形成细小、均匀的共结晶，这样在每次脉冲激光的激发下样品分子更容易被大批量的解析离子化，从而提高体系的灵敏度和重现率。本发明使用了具有微观相分离结构的嵌段聚合物作为靶板涂层，是世界上首次将这种结构的聚合物应用于MALDI-MS靶板涂层。这样的结构既能够利用亲水端对盐和一些污染物的吸附，达到免洗脱步骤的原位除盐；又能够利用其整体疏水性达到对样品的富集，大大简化了样品制备步骤，实现了同步除盐和富集。图1为本除盐和富集方法流程示意图，按流程顺序分别为1为192样品池MALDI靶板；2为一个放大的样品池中的微观相分离结构的嵌段聚合物涂层；3为点覆含盐样品溶液在涂层表面；4为室温自然干燥，该过程为除盐的主要过程；5为点覆基质溶液在涂层表面；6为室温自然干燥；7为送至MALDI-MS质谱分析。图2为0.5pL50fmol/uL马心肌红蛋白酶解肽段样品的MALDI-T0F-MS谱图，其中，(a)，(c)，(e)，(g)是分别添加了100mMNH織，25mMNa线，0.2%SDS,0.1%CHAPS通过传统不锈钢光板得到的；(b),(d)，(f)，(h)是肽段中分别添加了100mMNH4HC03，25mMNa线，0.2%SDS,0.1%CHAPS点覆在微观相分离结构的嵌段聚合物涂层得到的；传统方法(a)，(c)，(e)，(g)在光靶上几乎得不到肽段的信息，而(b),(d)，(f)，(h)则可以得到很好的信噪比。图3为0.5uL10fmol/uL含50mMNH4HC03的马心肌红蛋白酶解肽段样品的MALDI-TOF-MS谱图，其中，(a)是该样品直接点覆在光靶上得到的；(b)是样品通过zip-tip除盐得到的；(c)是样品点覆在微观相分离结构的嵌段聚合物涂层上得到的；(a)图表明不经过除盐的低浓度样品在光靶上几乎得不到任何肽段信息；(b)图表明尽管有盐的存在可以通过zip-tip除去，但其需要的洗脱过程会造成样品的损失，对于低浓度肽段溶液是不可行的；(c)图表明通过同步的免洗原位除盐和富集过程，可以得到较好的信噪比；即在大浓度盐的干扰下，传统方法根本测不到痕量的受污染的肽段，而微观相分离结构的嵌段聚合物涂层却可以得到非常好的信号。图4(a)是用50%乙腈、50%水、0.1%三氟乙酸的溶液从点覆有lng/nL马心肌红蛋白酶解肽段样品微观相分离结构的嵌段聚合物涂层上多次润洗后收集到的溶液点在光靶上得到的质谱图；(b)是1ng/uL马心肌红蛋白酶解肽段样品在PSF-b-PEO涂层上得到的质谱图；对比表明，由于微观相分离结构的嵌段聚合物对盐的强吸附作用，多次的润洗可以将肽段洗脱下来，而盐却很少被洗脱下来。图5是来自大鼠肝脏蛋白经过2D-gel分离并经考马斯亮兰染色后，取其中10个点，其中，点的标号根据其染色深浅由深至浅分别用1至10表示，然后用胰蛋白酶trypsin进行酶解。具体实施例方式下面的实例是对本发明提出的利用微观相分离结构的嵌段聚合物微印迹技术进行低丰度蛋白靶上除盐与富集过程的进一步说明。实施例1来自大鼠肝脏蛋白经过2D-gel分离并经考马斯亮兰染色后，取其中IO个点，其中，点的标号根据其染色深浅由深至浅分别用1至IO表示(图5)，然后用胰蛋白酶trypsin进行酶解。先用微观相分离结构的嵌段聚合物对MALDI靶板上的圆盘进行涂层'，聚合物圆点膜形成后，将0.5微升酶解肽段样品溶液(溶剂为50%乙腈、50%水、0.1%三氟乙酸)点覆于涂层圆点上，另外0.5微升相同的酶解肽段样品溶液点覆于光靶圆点上，室温自然干燥；最后将体积为0.5微升的有机基质溶液(2-氰基-4-羟基肉桂酸(a-CHCA)，溶剂为50%乙腈、50%水、0.1%三氟乙酸)点覆在样品表面，室温自然干燥；将制备好的样品送入MALDI-T0F/T0F质谱(4700ProteomicsAnalyzer,AppliedBiosystems)检测。质谱条件激光器为Nd-YAG激光器，波长355nm，激光脉冲频率200Hz，加速电压20kV，正离子模式，反射式TOF检测。表1所示的是得到的检测结果。结果表明，对于蛋白质含量较高的点l，2，传统样品制备方法和本发明的方法没有太大差别；对于蛋白质量稍低的点—3，4,5本发明得到了相对于传统样品制备方法较高的蛋白质鉴定得分对于蛋白量含量更低的点6-10，本发明的方法具有很大的优势，蛋白质鉴定得分明显提高，说明同步的除盐和富集对于低丰度蛋白质的鉴定具有很重要的意义。其中，[a]蛋白来自于大鼠肝脏提取的全蛋白。搜库参数数据库，NCBInr(Version:July122005);酶胰蛋白酶trypsin;最大漏切位点1;肽指纹质量误差80ppm;串级误差0.5Da。AppliedBiosystemsGPSExplorer软件(Version2.0)，Mascot检索分析。检索采用肽质量指纹图结合串级质谱图联合分析。[b]蛋白质检索得分大于62分(p〈0.05)认为鉴定结果可靠。[c]提取肽段溶液在37。C下用氮气吹干，再用1.5的50%乙腈、50%水、0.1%三氟乙酸溶液溶解，分别取0.5pL的样品溶液点在光靶和微观相分离结构的嵌段聚合物涂层圆点上。(A)在光靶上得到的结果；(B)在微观相分离结构的嵌段聚合物涂层上得到的结果。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1.一种对痕量蛋白质或多肽靶上原位除盐和富集的方法，其特征是利用微观相分离结构的嵌段聚合物涂层对痕量蛋白质或多肽进行靶上原位免洗除盐和同步富集后直接进行质谱分析；所述的微观相分离结构的嵌段聚合物具有疏水端和亲水端；所述的方法包括下述步骤(1)用微观相分离结构的嵌段聚合物溶液在基质辅助激光解析离子源靶板样品池内形成涂层；(2)将含盐或其他污染物的蛋白质或多肽样品点覆在聚合物涂层上，室温自然干燥；(3)将有机基质溶液点覆在带有上述样品的聚合物涂层上，室温自然干燥后，涂层表面形成样品和基质均匀细致的结晶；(4)被富集的样品无需洗脱除盐，直接用激光激发涂层表面进行MALDI质谱分析。2、按权利要求l所述的对痕量蛋白质或多肽靶上原位除盐和富集的方法，其特征是所述的嵌段聚合物溶液为0.5mg/mL，溶于四氢呋喃。3、按权利要求l所述的对痕量蛋白质或多肽靶上原位除盐和富集的方法，其特征是在基质辅助激光解析离子源靶板上的每个样品池中形成聚合物涂层。4、按权利要求3所述的方法，其特征是所述的基质辅助激光解析离子源靶板样品池的直径为1400微米。5、按权利要求1所述的方法，其特征是所述的有机基质溶液为2-氰基-4-羟基肉桂酸溶液，溶剂为50%乙腈、50%水、0.1%三氟乙酸。6、按权利要求l所述的方法，其特征是所述的方法其中，在点覆样品溶液后，所述的微观相分离结构的嵌段聚合物的疏水端不溶解在样品溶剂中，保持嵌段聚合物在金属上的膜稳定性；其亲水端溶解在样品溶剂中并对盐和污染物吸附，所述的盐和污染物包裹在聚合物内部。7、按权利要求l所述的方法，其特征在于步骤4)中，可直接在均匀聚合物涂层表面激发样品得到样品的离子信号，进行质谱分析。8、按权利要求1或7所述的方法，其特征在于步骤4)的质谱分析中质谱条件激光器为Nd-YAG激光器，波长355nm，激光脉冲频率200Hz，加速电压20kV，正离子模式，反射式T0F检测。全文摘要本发明属生化分析领域，涉及一种利用具有微观相分离结构的嵌段聚合物涂层，对多肽和蛋白质样品进行靶上无需洗脱的原位除盐和同步富集，能避免样品损失，并对所富集的样品直接进行基质辅助激光解析离子化质谱的分析和鉴定的方法。本发明无需额外的洗脱除盐步骤也无需点覆过量体积的基质溶液就可实现除盐，并可直接进行MALDI质谱分析；本发明不仅首次成功实现了样品靶上原位免洗除盐与富集的特性，而且具有灵敏度高、重现性高、通量高、耐盐能力强、经济和省时等特点。可广泛用于蛋白质组学领域，同时也大大拓展了聚合物涂层技术的应用范围。文档编号G01N27/64GK101368890SQ20071004504公开日2009年2月18日申请日期2007年8月17日优先权日2007年8月17日发明者莹张,杨芃原,陆豪杰申请人:复旦大学