专利名称：检测中期因子浓度的elisa试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明属于医学生物技术领域，涉及一种ELISA (酶联免疫吸附测定法)检测方法， 具体为一种检测样本中中期因子浓度的ELISA方法。
背景技术：
中期因子(midkine， MK)是一个由121个氨基酸组成的分子量约为14kDa的碱性蛋白 质，属于肝素结合生长因子家族，最初是从胚胎癌细胞中筛选而得。对它的深入研究发现， 中期因子一般在人胚胎中期的肝、肾和大脑中高表达，在健康成人体内表达极微弱，但在各 类癌症患者包括食管癌、胃癌、肝细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌等多种病变组织中又 可检测到中期因子的强烈表达。此外，在很多类型的癌症患者血液及尿液中也发现中期因子 的浓度升高，而且具有非常高的敏感性和特异性。中期因子在很多方面表现出与肿瘤发生相 关的活性，包括促进细胞转化和肿瘤细胞增殖，促血管生成，抗肿瘤细胞凋亡和药物作用等。 利用反义寡核苷酸链抑制它的表达能够显著抑制肿瘤的生长。这些研究结果表明中期因子在 肿瘤的发生、发展和恶化过程中扮演着极为重要的角色。
ELISA已经成为一种成熟的免疫分析方法，具有特异、灵敏和快速的特点，在临床医学 中已经得到了广泛的应用。因此，建立检测中期因子的ELISA方法，在基础研究和临床医学 检测方面都有重要的应用价值。
国内目前尚无任何有关检测中期因子浓度的方法或相关报道，更无相关专利。国外有两 家公司生产检测中期因子浓度的ELISA试剂盒产品，但成本都很高且操作繁琐、费时。国外 的试剂盒采用的方法如下兔抗人中期因子的多抗包被微孔板，加入标准品和样品与包被的 抗体孵育2小时，洗涤数次之后加入生物素标记的抗人中期因子抗体，孵育l小时之后洗涤 数次，再加入链霉亲和素偶联的HRP (辣根过氧化物酶)孵育1小时，再经过洗涤之后加入 底物显色。也就是每加入一种样品或抗体都要经过1~2小时孵育并洗涤，过程比较繁琐、费 时，而且价格很高。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测程序简便的检测样本中中期因子浓度的ELISA试剂盒及其 制备方法。
本发明的目的是通过以下方法实现的首先构建中期因子的原核表达质粒进行中期因子 蛋白的表达和纯化。用纯化的中期因子蛋白免疫新西兰大白兔制备兔抗人中期因子的多克隆 抗体。用商品化的鼠抗人中期因子单克隆抗体(上海我武生物技术有限公司，Mab-M052)包 被酶标板，封闭后加入待检样品、兔抗人中期因子多抗与HRP标记的羊抗兔IgG 二抗共孵育。
经过彻底洗涤后加入底物TMB溶液反应显色，最后用硫酸终止反应并在450nm处检测吸光 度值。通过标准样品的浓度和相应的吸光值绘制标准曲线，待检样品中中期因子的浓度就可 以通过它的吸光值并对应标准曲线得到。
本发明检测中期因子浓度的ELISA试剂盒包括以下组成
1、 包被缓冲液为磷酸盐缓冲液PBS，其成分为140mMNaCl， 2.7mMKCl， 10mMNa2HPO4， 1.8 mM KH2P04， pH值为7.4;
2、 洗涤液为含l%Tween-20的PBS，称为PBST，其成分为PBS， l%Tween-20;
3、 封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS， 1%BSA;
4、 加样缓冲液的成分为50mMTris-HCl， 0.5MKC1， 1%BSA， 0.05%Tween-20， pH值为8.4;
5、 反应终止液成分为2MH2S04。
6、 包被到酶标板上的抗体是鼠抗人MK单克隆抗体，其母液浓度为0.5 mg/ml，工作浓度为 5pg/ml，即稀释100倍使用；
7、 兔抗人MK多克隆抗体，其母液浓度为1 mg/ml，工作浓度为10 ng/ml，即最终稀释倍数 为100倍；
8、 辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体，其母液浓度为0.5 mg/ml，工 作浓度为0.5 pg/ml，即最终稀释倍数为1000倍；
9、 大肠杆菌￡.c0//中原核表达并通过亲和纯化的His-MK， N端带有6个His标签，其母液 浓度为400 ng/ml，可经过不同倍数的稀释而得到所需的不同浓度的MK标准品。
本发明检测中期因子浓度的ELISA试剂盒的使用步骤如下
1、 在酶标板中加入PBS稀释IOO倍的鼠抗人MK单克隆抗体，每孔100W， 4 'C包被24h;
2、 弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤2次，每次5min;
3、 每孔加入200W封闭液，37 。C封闭2h;
4、 重复步骤2);
5、 准备样品(标准品和未知浓度样品如血清和尿液等，可作适当稀释)、兔抗人MK多抗 (最终稀释度为100倍)和HRP标记的羊抗兔二抗(最终稀释度为1000倍)的混合液，
稀释于加样缓冲液中，每孔加入10014， 37度2h;
6、 同步骤2)，洗涤6次；
7、 每孔加入100W TMB室温反应10-30min;
8、 每孔加入50W2MH2SO4终止反应； 9 、在酶标仪中测定OD45()值；
10、 利用统计学绘图软件根据测定的值绘制四参数拟合标准曲线；
11、 通过标准曲线和未知浓度样品的OD值就可计算出未知样品中中期因子的浓度。 本试剂盒采用的是ELISA方法中检测蛋白抗原比较常用的双抗体夹心法，并对它进行了
改良。以往常规的方法是加入样品后经过孵育再洗涤，再加入兔抗人MK多抗孵育、洗涤， 之后再加入HRP标记的抗兔二抗孵育、洗涤，这样便要分别经过三次的孵育与洗涤，使检测 时间大大加长。而在上面的步骤中不难看出在对传统的方法进行改良之后，其中最主要的特 别之处是将样品、兔抗人MK多抗和HRP标记的羊抗兔二抗按一定比例混合，共同与包被在 酶标板孔中的鼠抗人MK单抗孵育，这样将三步并作一步，节省了大量的时间，但这个步骤 的实现是需要对三者的最终使用浓度和比例进行配比和优化的，过多或过少的使用比例都有 可能导致得不到理想的结果。通过对不同浓度条件的摸索，在本试剂盒中标准品浓度为0~20 ng/ml，兔抗人MK多抗工作浓度为10 pg/ml， HRP标记的羊抗兔二抗工作浓度为0.5 pg/ml， 在这个条件下，能够在保证灵敏度的前提下达到将三步并作一步的目的，还能有效降低背景 值而得到较理想的结果。
本发明具有良好的特异性、敏感性和稳定性，与已有技术相比操作时间短，成本低。 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗 原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。 在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗 涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗 原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一 定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质 的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地 放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。其中双抗体夹心法是检测抗原的最 常用的方法。
图1为中期因子ELISA检测标准曲线。
具体实施例方式
本发明中的一些术语与縮写mAb:单克隆抗体，monoclonal antibody; pAb:多克隆抗 体，polyclonal antibody; BSA:牛血清白蛋白；Tween-20:吐温20; IgG:免疫球蛋白G;
TMB:四甲基联苯胺；OD:吸光度。
试剂配方-
1.缓冲液
包被缓冲液PBS (PH=7.4)
洗涤液PBST (含l%Tween-20的PBS)
封闭液为含1XBSA的PBS
加样缓冲液(50 mM Tris-HCL+0.5 M KCL PH=8.4)+1 %BSA+0.05%Tween-20
反应终止液2MH2S04。2. 抗体
鼠抗人MK单抗(0.5mg/ml) 兔抗人MK多抗(1 mg/ml) 羊抗兔IgGHRP (0.5 mg/ml)
3. 抗原
原核表达纯化的His-MK， N端带有6个His标签。
4. 酶标板
Constar 8联孔酶标条
以下是对本发明的进一步描述。
1. 首先表达纯化获得中期因子蛋白，分别制备鼠抗人MK单抗和兔抗人MK多抗。
2. 然后对本发明的工作条件进行优化
1) 包被单抗母液浓度为0.5 mg/ml，工作浓度为5Pg/ml，即稀释100倍；
2) 标准品为His-MK蛋白，标准品的稀释液为PBS，标准品母液浓度为400 ng/ml， 标准品最高工作浓度为20 ng/ml，并从16 ng/ml开始做倍比稀释至0.5 ng/ml做 标准曲线；
3) 兔抗人MK多抗母液浓度为1 mg/ml，工作浓度为10Pg/ml，即稀释100倍；羊 抗兔IgG 二抗母液浓度为0.5 mg/ml，工作浓度为0.5化/ml，即稀释1000倍；
3. 本发明实施的具体步骤如下
1) 在酶标板中加入PBS稀释IOO倍的鼠抗人MK单克隆抗体，每孔100W， 4 °C 包被24 h;
2) 弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤2次，每次5min;
3) 每孔加入20014封闭液，37'C封闭2h;
4) 弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤2次，每次5min;
5) 准备样品(标准品和未知浓度样品如血清和尿液等，可作适当稀释)、兔抗人 MK多抗(最终稀释度为100倍)和羊抗兔HRP二抗(最终稀释度为1000倍) 的混合液，稀释于加样缓冲液中，每孔加入100W， 37度2h;
6) 弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤6次，每次5min;
7) 每孔加入100 Ml TMB室温反应10-30min;
8) 每孔加入50 14 2 M H2S04终止反应；
9) 在酶标仪中测定OD450值；
10) 利用统计学绘图软件根据测定的值绘制四参数拟合标准曲线(附图1);
11) 通过标准曲线和未知浓度样品的OD值就可计算出未知样品中中期因子的浓度。
权利要求
1、检测中期因子浓度的ELISA试剂盒，其特征在于包括以下组成(1)包被缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，其成分为140mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH值为7.4；(2)洗涤液为含1％Tween-20的PBS，其成分为PBS，1％Tween-20；(3)封闭液为含1％BSA的PBS，其成分为PBS，1％BSA；(4)加样缓冲液的成分为50mM Tris-HCl，0.5 M KCl，1％BSA，0.05％Tween-20，pH值为8.4；(5)反应终止液成分为2 M H2SO4；(6)包被到酶标板上的鼠抗人MK单克隆抗体母液，浓度为0.5mg/ml；(7)兔抗人MK多克隆抗体母液，浓度为1mg/ml；(8)辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体母液，浓度为0.5mg/ml；(9)大肠杆菌E.coli中原核表达并通过亲和纯化的His-MK，N端带有6个His标签，其母液浓度为400ng/ml。
2、如权利要求1所述检测中期因子浓度的ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于以下步骤(1) 在酶标板中加入PBS稀释IOO倍的鼠抗人MK单克隆抗体，每孔100W，4 'C包被24小 时；(2) 弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤2次，每次5分钟；(3) 每孔加入200 14封闭液，37 'C封闭2小时；(4) 弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤2次，每次5分钟；(5) 将待检样品、100倍稀释的兔抗人MK多抗和1000倍稀释的HRP标记的羊抗兔二抗的 混合液，每孔加入100 14，置于37。C湿盒中孵育2小时；(6) 弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤6次，每次5分钟；(7) 每孔加入100 W TMB室温反应10-30分钟；(8) 每孔加入50 W2MH2S04终止反应；(9) 在酶标仪中测定OD450值；(10) 利用统计学绘图软件根据测定的值绘制四参数拟合标准曲线；(11) 通过标准曲线和未知浓度样品的OD值计算待检样品中中期因子的浓度。
全文摘要
检测中期因子浓度的ELISA试剂盒及其使用方法。试剂盒包括包被到酶标板上的鼠抗人MK单克隆抗体；兔抗人MK多克隆抗体；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体；大肠杆菌E.coli中原核表达并通过亲和纯化的His-MK，N端带有6个His标签。其使用包括用商品化的鼠抗人中期因子单克隆抗体包被酶标板，封闭后加入待检样品、兔抗人中期因子多抗与HRP标记的羊抗兔IgG二抗共孵育；经过彻底洗涤后加入底物TMB溶液反应显色，最后用硫酸终止反应并在450nm处检测吸光度值。通过标准样品的浓度和相应的吸光值绘制标准曲线，待检样品中中期因子的浓度就可以通过它的吸光值并对应标准曲线得到。
文档编号G01N33/577GK101201359SQ20071016037
公开日2008年6月18日 申请日期2007年12月18日 优先权日2007年12月18日
发明者董豪杰, 虞润六, 许正平 申请人:浙江大学