专利名称：治疗炎症性肠病的组合物和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制胃肠道炎症和感染，且加速、刺激或促进胃肠道伤口愈合的新药物组合物的应用。本发明还包括该制剂的制备方法。
背景技术：
蛋白聚糖和葡糖胺聚糖(GAG)在体内执行许多重要功能。该葡糖胺聚糖是肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素和硫酸角质素。其它具有相似生物活性的半合成多糖被称为类肝素，例如硫酸葡聚糖。
游离的肝素和硫酸乙酰肝素激活血浆蛋白抗凝血酶，其接着抑制血液中凝血级联(coagulation cascade)的丝氨酸蛋白酶。在临床上利用这一现象并使得肝素在临床上成为最广泛使用的血液-抗凝血剂。大多数其它的葡糖胺聚糖和类肝素也显示了抗凝血活性，但它们的活性并不确切也不明显。其它报道的葡糖胺聚糖和类肝素的生物功能是它们阻止炎症反应的能力。
肝素阻止炎症的能力也被用于临床。例如，如果使用肝素治疗深部静脉血栓形成，不仅起抗凝血作用，还起抗炎作用；肿块也减小了。肝素和GAGs的抗炎作用可能归因于若干机理，但尚不清楚哪一种是最重要的。由于多糖的硫酸根和/或羧基官能团强烈的阴离子属性，带负电荷的多糖可与大量的蛋白结合。这些蛋白中的一些涉及炎症系统，例如补体因子。研究者假定内皮或血管壁内膜在炎症反应中起作用。具体地，用硫酸乙酰肝素(与肝素类似)分子包裹的内皮细胞与白血球——在炎症过程中增生的白细胞结合。在炎症过程中分泌的化学物质——细胞因子可促进这种关系。
研究者提出肝素以几种方式抑制炎症行为。由于肝素的结构与硫酸肝素相似，其干扰了炎症细胞与内皮细胞的粘连。此外，认为肝素会与一些促进炎症的细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)相互作用。
研究者还对确定肝素在修复结肠粘膜(肠内膜)损伤中的作用发生了兴趣。肝素提高了蛋白刺激细胞更新和增生的效果。这种作用促使血管壁和结肠内膜修复。文献报道的GAGs和类肝素的其它功能还有抑制微生物感染的能力。
许多微生物，例如疱疹类病毒和大肠杆菌属、葡萄球菌属以及链球菌属的细菌，以哺乳动物细胞表面的GAGs为受体。这些微生物与GAGs高度特异性结合，然后开始感染细胞。通过阻断微生物表面的GAGs-结合蛋白与GAGs或类肝素片断的结合，就可防止感染。
例如可导致急性、慢性B型胃炎和消化性溃疡病的幽门螺旋杆菌病原菌，其与上皮细胞上的肝素样GAG和硫酸乙酰肝素结合。与此结合相关的是肝素/硫酸乙酰肝素结合蛋白(HSBP)。这些凝集素样相互作用可能是造成由细菌引起的胃粘膜克隆增殖的原因，并可由于游离肝素与HSBP的结合而阻止。
炎症性肠病(IBD)术语IBD是指两种肠道疾病局限性回肠炎和溃疡性结肠炎。这些疾病看起来相似却差异显著。
这两种疾病都是肠道炎症。目前不知导致IBD中引起炎症的因素；因此这些疾病的病因尚不清楚。
最常见的IBD症状是腹泻。在溃疡性结肠炎中，正常的水重吸收功能受损，导致许多液化便。由于结肠的内膜也形成了溃疡，因此腹泻中经常包含血。
在该疾病的晚期，结肠通常变窄变短，伴随水吸收减弱、直肠急迫(urgency)以及对肠功能的控制变弱。局限性回肠炎能防止食物的正常吸收，导致腹泻以及脂肪(脂肪痢)和其它食物排泄的增加，从而导致体重减轻。此外，在局限性回肠炎中，肠道可能变窄并受阻。
溃疡性结肠炎溃疡性结肠炎(UC)包含结肠和直肠内膜的炎症，其导致直肠出血和腹泻。溃疡性结肠炎通常涉及回肠的末端(末端回肠)，约30-50％患者中还涉及大肠。当溃疡性结肠炎仅影响结肠的最低部分，直肠时，此时被称为溃疡性直肠炎(UP)。
局限性回肠炎在局限性回肠炎(CD)中，炎症一直延伸至肌肉甚至浆膜。该炎症过程造成血管因温度增加而扩张，液体渗入组织，炎症细胞的浸润，及粘膜形成溃疡。
多年来，给予了局限性回肠炎许多名称，其可被称为节段性回肠炎、末端回肠炎、肉芽肿性结肠炎或回肠结肠炎。这些名称可相互替换使用。
肠炎的治疗当病因未知时，很难取得有效治疗。然而，就IBD而言，却可研究控制疾病或诱导的疗法，诱导在医学上是指缓解，意味着病情稳定。对一位患者成功的治疗方案并不一定对其它人奏效。
已经证实皮质类固醇是治疗溃疡性结肠炎急性发作的最有效的药物，平均缓解/改善率接近70％。然而，约20-30％的患者在急性期对皮质类固醇的反应弱或无反应。尽管对溃疡性结肠炎急性期的效果有限，用柳氮磺胺吡啶(sulphasalazine)或5-氨基水杨酸治疗是有利的，而且其具有的主要优势在于长期维持缓解作用。免疫抑制剂，例如硫唑嘌呤和环孢霉素A，具有诱导作用和随后的维持缓解的作用，特别是在更为严重的病例中，但可能会伴随危险的副作用。然而，所有这些治疗都会引发不需要的副作用。因此，需要研究可替换，毒性更低疗效更高的肠炎疗法。
使用肝素治疗炎症性肠病(IBD)初看，使用肝素治疗炎症性肠病——症状中包括出血的疾病——似乎不合逻辑。然而，对IBD和肝素深入分析就会另有发现。如下是将肝素用于试验性治疗IBD的研究概述。该特征是基于Dr.Joshua R.Korzenik发表于CCFA科学期刊中的论文，炎症性肠病(InflammatoryBowel Diseases)(Vol.3，No.2)。
使用肝素治疗IBD的病例最先始于爱尔兰。Dr.Peter Gaffney，一名外科医生，将肝素给予一位腿部有血栓的患者，该患者还患有溃疡性结肠炎。他注意到该患者的结肠炎在10天内消除了。随后，Dr.Gaffney对两位没有血栓的患者试用肝素，并取得同样的成功。
至今已进行了其它几次的小样本研究，其中60位IBD患者中的51位对肝素治疗产生有益的反应。尽管这些结果令人鼓舞，但还是未确定肝素的安全性，以及治疗IBD的最佳剂量和疗程。
最近的IBD研究表明肝素在治疗IBD中具有甚至更为重要的作用。在Karolinska Institute进行的进一步的研究中，通过注射Fragmin(达肝素(dalteparin)，一种低分子量肝素)治疗患者，获得了令人鼓舞的结果。
如果将药物直接应用于炎症组织，就可以取得更为有效地肝素给药，但由于肝素用于治疗IBD时，在体内迅速降解，因此需要适宜的药物输送系统。
发明内容
根据本发明，我们提供了一种包含与生物活性多糖相结合的脱乙酰壳多糖水性组合物，其用于IBD的直肠治疗，该生物活性多糖选自肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸角质素和硫酸葡聚糖。
脱乙酰壳多糖是线性多糖，通常经脱乙酰壳多糖碱性脱乙酰化而制备。脱乙酰壳多糖本身是天然存在的多糖，其来源广泛，但通常工业规模的来源是甲壳纲动物，例如螃蟹或虾、贝。脱乙酰壳多糖由1，4-β-连接的D-葡糖胺和N-乙酰-D-葡糖胺残基组成。碱形式的脱乙酰壳多糖以及特别是高分子量和/或高度N-脱乙酰化的脱乙酰壳多糖几乎不溶于水。脱乙酰壳多糖中葡糖胺残基的平均pKa为大约6.8，脱乙酰壳多糖与酸，例如HCl和乙酸形成盐。与一价酸形成的盐在水中倾向于溶解。脱乙酰壳多糖可与有毒的以及对环境不良的(重)金属(例如Hg、Cd和Pb)和过渡金属(例如Cr，Ni，Mn和Cu)强烈结合。
这些脱乙酰壳多糖包括脱乙酰壳多糖盐，例如与具有药学上可接受的阴离子的酸形成的盐，尤其是有机酸，例如较低级烷酸如乙酸、甲酸、丙酸和丁酸。其它适宜的有机酸包括乳酸、乙醇酸、柠檬酸、抗坏血酸和氨基酸。适宜的无机酸例如是盐酸。还包括脱乙酰壳多糖衍生物，例如烷基化的、N羧甲基化的、N，O-羧甲基化的以及交联的脱乙酰壳多糖。交联脱乙酰壳多糖可经共价键或离子键交联。
脱乙酰壳多糖可以是任何的脱乙酰甲壳质；但是我们优选的脱乙酰壳多糖脱乙酰度高于50％，更优选高于约55％，尤其是高于60％。脱乙酰度优选低于100％，更优选低于95％尤其是低于90％。特别优选脱乙酰度在85％至95％之间。
我们还优选的脱乙酰壳多糖具有高达15,000mPas的粘度，优选从2至10,000，更优选从2至2,000，以及最优选从2至1000mPas，该粘度是在25℃温度下1％v/v乙酸水溶液配制的1％w/v溶液中测定的。溶液粘度是脱乙酰壳多糖平均分子量的指征，可被理解为脱乙酰壳多糖是具有可变链长度分子分布的聚合物。
该水性组合物可以是例如溶液、分散液或悬浮液。该水性组合物的pH优选为4.0至6.8，特别优选在4.5至5.5之间。
水性组合物的粘度取决于脱乙酰壳多糖和生物活性多糖成分的粘度；然而优选低于50mPas，更优选低于10mPas。
脱乙酰壳多糖与生物活性多糖之间的重量比优选为100∶1至1∶1，更优选20∶1至1∶1。具体的比例将取决于脱乙酰壳多糖的性能、其脱乙酰度和多糖的性能。优选地，脱乙酰壳多糖与生物活性多糖结合形成带净正电荷的复合物；因此，通常的比例将使得脱乙酰壳多糖和多糖的全部复合物带正电荷，特别是在弱酸性水介质中，例如在pH为从4.0至6.8的水介质中。
特别优选的生物活性多糖是肝素。低分子量肝素，例如达肝素，还可被特别提及。
例如脱乙酰度为86％的脱乙酰壳多糖与肝素复合的特别优选的比例在100∶1至1∶1之间。通过使用药学上可接受的无机酸或有机酸如HCl，适当地维持水性组合物的pH。
使用肝素-脱乙酰壳多糖复合物治疗IBD如上所述，已发现肝素可有益地用于患有某些炎症性肠病，并伴有血栓-栓塞病症例如腿深部静脉血栓形成或肺栓子的患者。在静注肝素和静注皮质类固醇治疗严重急性IBD的受控随机比较中发现，作为一线治疗的肝素与皮质类固醇在治疗UC中同样有效。而且，还发现在一些非控制的临床试验中，进一步得到肝素治疗活动性UC患者的有益效果的证据。而且，在所有这些研究中，没有记录到严重的副作用。尽管已被认为是抗凝效应，但肝素在UC中的主要作用机理仍然未知。此外，报道中证明肝素抑制白细胞募集，但不能排除这一机理还涉及肝素的保护性作用。由于IBD可能的微生物病理，肝素与多种微生物结合的能力及其抗炎效力也是有益的。
在我们的小规模试验中，肝素-灌肠剂被用作具有末梢疾病或UP的溃疡性结肠炎患者的辅助药物或选用药物。
将肝素-脱乙酰壳多糖复合物直接施用于患病位点，可避免静注肝素系统给药时的许多问题发生。例如，天然肝素在体内快速降解，而与脱乙酰壳多糖复合后这一过程被延缓。而且，由于其净正电荷，肝素-脱乙酰壳多糖复合物与活组织粘连并因此固定于肠部。
并且，静脉给予肝素还必须由医生或护士实施。相反，肝素-脱乙酰壳多糖复合物却可以由患者在家中方便地服用。
通常，可使用上述灌肠剂、栓剂或直肠瓶形式的水性组合物有效的治疗炎症性肠病。
该组合物可通过混合一种脱乙酰壳多糖的水性制剂与一种生物活性多糖的水性制剂制备。必要或需要时，可将所得组合物装入适宜的容器中，例如直肠瓶，如灌肠剂。
脱乙酰壳多糖和生物活性多糖可以以分离组分的形式装在试剂盒中，试剂盒中含有各成分的溶液，在直肠给药前即时混合。
根据本发明另一方面，提供了炎症性肠病的直肠治疗方法，其包括给予患有这种疾病的患者治疗有效量的包含与生物活性多糖相结合的脱乙酰壳多糖水性组合物，该生物活性多糖选自肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸角质素和硫酸葡聚糖。
本发明通过下述实施例进行阐述。
实施例1肝素-脱乙酰壳多糖悬浮剂的制备材料肝素购自Pharmacia Hepar Inc.，Franklin，Ohio，USA，抗Xa活性为185IU/mg。
脱乙酰壳多糖(Chitech)，由Medicarb AB，StockholmSweden提供。
制剂制备分别相当于500、2500和5000IU(抗Xa因子)的包含0.054、0.27和0.54mg肝素/mL的三种水溶液(Aqua steril ad)。通过向水中加入0.12、0.61和1.23mg/mL(Aqua steril ad)制备脱乙酰壳多糖粉末的三种溶液。加入4M的HCl保持pH值为4.7。
在混合中，将包含500、2500和5000IU的肝素溶液分别加入包含0.123、0.614和1.227mg/mL脱乙酰壳多糖的溶液中。再持续混合5分钟直至复合物看起来是“均质的”。
该悬浮剂以50mL每份分入塑料HDPE直肠瓶中，135mL PLMLangeskov，Denmark，并如表1标记。
表I脱乙酰壳多糖-肝素组合物灌肠剂IBD制剂
实施例2临床研究研究目的是筛选不同的肝素和脱乙酰壳多糖组合物以发现适于对IBD/直肠炎患者进行初期研究的制剂。制剂的重要参数和选择原则在于肝素的量、粘度、剂量和给药方式。研究的药物可从单剂量50ml直肠用软塑料管(灌肠剂)中获得。选择包含500、2500、5000IU(抗Xa因子)的三种不同浓度的肝素(表1)。
患者将每天两次接受肝素-灌肠剂，持续达四周。如果到随访2(治疗2周)时患者病情缓解，该患者从研究中退出，在治疗末进行评价。
在0天，2周(±2天)后以及4周后进行临床随访。1周后研究护士进行电话核对。
向患者询问关于灌肠剂的处理、可能的出血、依从性以及主观幸福感。在治疗开始和结束时由患者填写生活质量调查表(IBD-Q)。
患者被随机分配治疗，并以相等的概率将剂量组分配至试验中心。
个别患者主要的不同剂量包被相似地标记。
维持治疗(5-ASA，SASP，奥沙拉嗪)的患者，剂量维持不变。经口服类固醇治疗但反应不佳或没反应或在递减用药量中恶化的患者，可将泼尼松龙的用量由5mg/周逐渐降至零，并将剂量记录在CRF中。
在此研究过程中不允许其它IBD的急性治疗。
所需的用于提高患者主观幸福感的其它药物由研究者慎重给予，并记录于CRF中。如果需要，可使用扑热息痛但不可使用乙酰水杨酸。
基本的临床效能变量是对缓解的诱导率，如所测得的粗略的全部缓解率以及缓解时间。安全性通过报道的不良反应和对生命体征的追访而测定。
缓解的定义为，根据Lfberg等所用的评分体系内窥镜分数＜1，并且在没有肉眼可见的便血以及高于患者正常排便平均数＜2。
与基线相比，表现了状况改善(内窥镜分数和/或临床活性分减少)的患者被认作应答者。所有患者被分为应答者或在周2和周4不应答者。
由包括排便频率、连贯性、直肠出血、直肠或腹部疼痛以及尿急多种不同变量的临床症状指数用于评价临床活性。评价期是临床随访的前三天。
在每次随访时测量体重、脉搏和血压(5分钟静息，坐姿)以及患者常规主观幸福感评价。检查皮肤以探测出血并发症例如血肿。
在研究开始进行柔性电视内镜检查(结肠镜检查或乙状结肠镜检查)或刚性乙状结肠镜检查，在治疗2周后进行刚性乙状结肠镜检查。在研究结束的4周时进行柔性电视内镜检查或刚性乙状结肠镜检查。采用临床常规的内镜模式。
0分＝非炎性粘膜1分＝颗粒性，水肿，缺乏血管模式2分＝充血，脆弱，瘀点3分＝溃疡形成在开始和结束随访时，对非炎性粘膜(在较少广泛性UC的情况下)以及结肠和直肠的炎症部分最严重的地方进行四次常规活组织检查。
两个活组织样本置于福尔马林中，经包括常规的H&E染色处理后，由同一病理学家进行双盲评价。采用Selendrijk的分级量表确定粘膜炎症。
将来自每个位点的一到两个活组织样本立即在-70℃冷却，用以分析髓过氧化物酶活性和免疫组织白细胞粘附分子的表达。
使用为IBD患者研究的简单的生活质量调查表以评价开始以及缓解或治疗末期患者的生活质量。
临床上常规采用五个实验室功效变量血小板计数(TPK)红细胞沉降率(ESR)C-反应性蛋白(CRP)白蛋白和结合珠蛋白。
在每次临床随访时抽取血液进行分析。
在每次随访时采集用于血红蛋白、白细胞和蛋白质(U-浸渍片——如果血液显示阳性尿沉淀)分析以及U-白三烯E4分析的尿样。
监视每个患者个体基线的功效变量。以开始研究的前三天对同一变量的测定值为基线。
不良反应(AE)被定义为患者出现的任何不希望的医疗事件。该事件不必与治疗有因果关系。
此研究中不良反应的报道期自使用肝素脱乙酰壳多糖治疗开始，自停止治疗7天后结束。(在最后的研究随访后，只采集患者自发的报告。)该探索性研究的重点在于将肝素脱乙酰壳多糖复合物直肠给药用于急性UC的安全性和技术可行性，为此目的使用了描述性统计。患者以自身为对照，比较了相对于基线的治疗值。使用Wilcoxon测试比较治疗前后的平均内镜检查和组织学分数，并评价了效能实验室参数的差别。P值＜0.05被认为有显著性。
安全分析以不良反应的报道为准。
权利要求
1.包含与生物活性多糖相结合的脱乙酰壳多糖的水性组合物在炎症性肠病的直肠治疗中的用途，其中生物活性多糖选自肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸角质素和硫酸葡聚糖。
2.根据权利要求1的水性组合物的用途，其中脱乙酰壳多糖具有高于50％的脱乙酰度。
3.根据权利要求1或2的水性组合物的用途，其中脱乙酰壳多糖具有低于100％的脱乙酰度。
4.根据前述任一权利要求的水性组合物的用途，其中组合物的pH为4.0至6.8。
5.根据前述任一权利要求的水性组合物的用途，其中组合物具有低于50mPas，更优选低于10mPas的粘度。
6.根据前述任一权利要求的水性组合物的用途，其中脱乙酰壳多糖与生物活性多糖的重量比为从100∶1到1∶1。
7.根据前述任一权利要求的水性组合物的用途，其中脱乙酰壳多糖与生物活性多糖结合形成带净正电荷的复合物。
8.根据前述任一权利要求的水性组合物的用途，其中生物活性聚合物是肝素。
9.根据前述任一权利要求的水性组合物的用途，其中生物活性聚合物是低分子量肝素。
10.试剂盒，包含脱乙酰壳多糖溶液和生物活性多糖溶液，试剂盒，包含用于混合以产生局部治疗炎症性肠病的组合物，其中生物活性多糖选自肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸角质素和硫酸葡聚糖。
全文摘要
本发明公开了包含与生物活性多糖，例如肝素相结合的脱乙酰壳多糖水性组合物在炎症性肠病的直肠治疗中的应用。
文档编号A61K31/715GK1627948SQ02828982
公开日2005年6月15日 申请日期2002年4月24日 优先权日2002年4月24日
发明者O·拉姆, R·洛夫伯格, L·托克维斯特 申请人:麦迪卡博公司