专利名称：一种双链核酸精确定量的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，本发明涉及的一种利用EvaGreen 染料对双链核酸进行精确定量的方法。
背景技术：
定量检测双链核酸如基因组DNA的方法有分光光度法，检测 260nm处的吸光值，DNA含量=0026(^50昭/1111,但此方法操作比较 复杂，而且误差较大；另一种常用方法是利用溴化乙锭结合双链核酸 如基因组DNA分子，在紫外光激发下产生红色荧光，荧光强度与双 链核酸如基因组DNA量成正比，利用标准曲线，可进行双链核酸如 基因组DNA定量分析，由于溴化乙锭是致癌物质，不宜推广。
目前人们改用SYBR Green I和SYBR Gold为染料的荧光定量 检测双链核酸如基因组DNA。因为这两种荧光燃料只与双链核酸如 基因组DNA双链结合，在与DNA双链结合后发出荧光，荧光强度 与DNA双链产物量成正比，可根据标准曲线，进行双链核酸如基因 组DNA定量分析。但由于一般染料不稳定，高温降解，见光易分解, 发射光的光谱宽，光稳定性差，检测本底高，准确度较低，也不宜推 广。为此必须寻找一种能快速、高效、安全的定量检测双链核酸如基 因组DNA的方法。
EvaGreen 是绿色荧光核酸染料，当染料和双链核酸如基因组 DNA结合后，其激发和发射光谱与荧光素以及SYBR Green I相似。 这使得该染料可以直接用于配置了 488nm氩离子激光器或者此光谱 区域内任何可见光激发装置的仪器。EvaGreen 有良好的热稳定性 和水解稳定性，为常规操作提供了便利。EvaGreen 本身没有荧光， 但和dsDNA结合后能发出高亮度的荧光，这种特性使它特别适合于
常规的双链核酸如基因组DNA浓度确定。独立实验室(Litron Laboratories, Rochester, NY )进行的艾姆斯氏测试结果表明， EvaGreen 没有诱变性和细胞毒性。实验显示，EvaGreen 完全没 有细胞膜透性，这可能观察到低毒性的关键因素。与之相反，SYBRTM Green I被认为具有高效的诱变增强特性，很可能抑制了细胞内正常 DNA的修复机制。SYBRTM Green I的毒性可能和它快速进入细胞的 能力相关。然而将EvaGreen 染料用于双链核酸的检测手段仍不健 全，在实际应用中难以取得好的染色效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、快速、特异性强、灵敏度高的 能够采用EvaGreen 染料Mix定量检测双链核酸如基因组DNA的 方法。
本发明用EvaGreen 高浓度浓縮染料溶液(美国biotium公司， 产品货号31002)配成Mix与待测双链核苷酸溶液混合避光室温孵 育，检测其荧光强度，通过与标准曲线进行比对，得到待测双链核苷 酸溶液的浓度。
其中，EvaGreenTM染料溶液Mix的配制方案是
Na2HP040.005 —0.015 mol/L
NaH2P040.005 ~ 0.015 mol/L
NaCl 0.1 0.2mol/L
EDTA.2Na 2~3 mmol/L
EvaGreen 4.5 5.5拜o1/L
甘油，3 8%
最后磷酸调pH至7.1~7.5
其余为双蒸水。
所述EvaGreen 染料溶液Mix的配制优选方案为 0.01 mol/L Na2HP04 0.01mol/LNaH2PO4 0.15 mol/LNaCl 2.5 mmol/L EDTA-2Na 5jimo1/ L EvaGreen
5%甘油，
最后磷酸调pH至7.3
其余为双蒸水
可釆用Modulus多功能光度计、荧光酶标仪或实时定量PCR仪 检测荧光信号。检测波长入abAem = 500/530nm (DNA结合)。
本发明所述的双链核苷酸包括基因组DNA或其片断、质粒DNA 或其片断以及人工双链序列。
应用EvaGreen 染料Mix能对至少100^1样品的双链DNA直 接定量。Modulus多功能光度计的检测灵敏度为lOOpl样品中50 pg 的DNA。即使在核酸制备过程中引入了盐、尿素、乙醇、氯仿、去 污剂、蛋白或琼脂等常见的几种污染物，这种检测结果的线性仍能获 得。实验检测中的RNA和单链DNA产生的荧光量极小，当用 EvaGreen 染料Mix和Modulus多功能光度计进行实验时发现相 同克分子数的单链DNA和RNA对定量结果几乎没有什么影响。本 发明还提供了一种检测方法(釆用Modulus多功能光度计为例)，它 包括如下步骤
1) 将双链核酸如基因组DNA标准品和未知样品配制成系列浓 度的5(VL溶液，在每个溶液中加入50|iLEvaGreen的Mix,充分混合。
2) 在Modulus多功能光度计上选择蓝色模块，先测双链核酸如 基因组DNA标准物质的荧光值，建立标准曲线。
3) 然后对未知样品双链核酸如基因组DNA进行检测，Modulus 多功能光度计直接得出浓度值。
本发明所述方法的优点
1 )釆用EvaGreenTM染料Mix定量检测双链核酸如基因组DNA 的方法操作简单，快速，它对所有样品的双链核酸如基因组DNA定 量具有广泛的适应性。
2)釆用EvaGreenTM染料Mix定量检测双链核酸如基因组DNA 的方法具有较高的灵敏度，可以检测出pg级的双链核酸如基因组 DNA模板。
3 )釆用EvaGreenTM染料Mix定量检测双链核酸如基因组DNA 的方法对检测仪器的要求不高，只要具有荧光检测能力的普通设备如 Modulus多功能光度计、荧光酶标仪，实时定量PCR仪以及多功能 凝胶成像系统等均可以实现对双链核酸与EvaGreen 染料特异结合 所发射荧光的高效检测的目的。
图1测定小牛胸腺双链核酸浓度灵敏度曲线图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件 的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆 实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press ， 1989) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例1双链核酸基因组DNA的制备
以植物为例，釆用CTAB法提取基因组DNA,称取200mg经预 处理的试样，在液氮中充分研磨后装入液氮预冷的1.5mL或2mL离 心管中(不需研磨的试样直接加入)。加入lmL预冷至4。C的抽提液， 剧烈摇动混匀后，在冰上静置5min, 4。C条件下10000g离心15min, 弃上清液。加入600^iL预热到65"的裂解液，充分重悬沉淀，在65'C 恒温保持40min，期间颠倒混匀5次。室温条件下，10000g离心10min， 取上清液转至另一新离心管中。加入5pL RNaseA， 37。C恒温保持
30min。分别用等体积酚氯仿异戊醇(25: 24: 1 ),反复抽提两 次，再用氯仿/异戊醇(24: l)抽提一次。室温条件下，10000g离心 10min,取上清液转至另一离心管中。加入2/3体积异戊醇，1/10体积 3mol/L乙酸钠溶液(pH5.6) ,-20。C放置2-3h。在4。C条件下，10000g 离心15min,弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉 淀。加入50iiL TE(pH8.0)溶解沉淀，所得溶液即为样品基因组DNA 溶液。
实施例2 EvaGreen 染料Mix制备与使用方法
EvaGreen 染料Mix溶液的配方1如下:0.01 mol/L Na2HP04; O.Olmol/L NaH2P04; 0.15 mol/L NaCl; 2.5 mmol/L EDTA'2Na; 5)imol/LEvaGreen;5%甘油，最后辚酸调pH至7.3。
EvaGreen 染料Mix溶液的配方2如下0.005 mol/L Na2HP04; 0.005mol/L NaH2P04;0.1 mol/L NaCl;2 mmol/L EDTA.2Na; 4.5nmol/LEvaGreen;3%甘油，最后磷酸调pH至7丄
EvaGreen 染料Mix溶液的配方3如下0.015 mol/L Na2HP04; 0.015mol/L NaH2P04;0.2 mol/L NaCl;3mmol/L EDTA.2Na; 5.5pmol/L EvaGreen;8%甘油，最后嫌酸调pH至7.5。
实验时，需使用待测样品和EvaGreenTM染料Mix按1:1的比例 混合。溶液制备需用塑料器皿不能用玻璃器皿，因为试剂中某些成分 会吸附到玻璃器皿表面。用箔金纸包裹或放置黑暗处避光保存。
注溶液在制备后数小时内使用检测结果会比较好。 实施例3双链核酸DNA标准溶液、空白对照液和样品溶液的制备
标准溶液的制备。小牛胸腺DNA常用来做标准曲线，制备浓度 为2昭/ml的溶液。将等体积的小牛胸腺DNA储存液加入到的 EvaGreen Mix工作液中，充分混合，标准液最终浓度1000 ng/ml。 空白对照液的准备。加入相同体积的样品缓冲液到EvaGreen Mix工作液中，充分混合。
样品DNA溶液的准备。加入相同体积的样品到EvaGreen Mix工 作液中，充分混合。 实施例4大豆基因组DNA样品测定
1) 样品孵育
将混合好的染料和样品混合液转到100nl微量检测皿中，避光室 温孵育2-5min。
注转移过程中不要引入气泡。
2) 校准Modulus多功能光度计
以Modulus多功能光度计为例，釆用用300 ng/ml小牛胸腺双DNA 进行校准。
注单点校准精确度会更高，用一个和检测样品浓度相同或相近 的标准样优化系统，例如，若检测样品浓度在300ng/ml，要用一个500 ng/ml标准DNA样。保存这次校准以供将来使用。
3) 样品分析
样品加入100pl微量检测皿中，点击"Measure Fluorescence",样 品最终结果会显示在功能机显示屏上，采用EvaGreenTM染料Mix溶液 的配方l、配方2、配方3,测得大豆基因组DNA浓度分别为279ng/ml， 275 ng/ml， 271 ng/ml。 实施例5准确度测定
制备小牛胸腺DNA浓度为500ng/ml的溶液。将等体积的小牛胸腺 DNA储存液加入到的EvaGreenTMMix工作液中，充分混合，标准液 最终浓度500ng/ml。釆用上述方法测定，最终测得浓度(三次平均值) 为499.8ng/ml。 实施例6灵敏度测定
制备小牛胸腺DNA浓度为4ng/ml的溶液。梯度稀释成浓度为 2ng/ml、 lng/ml、 0.5 ng/ml、 0.25 ng/ml的溶液，将等体积的小牛胸腺 DNA储存液加入到的EvaGreenTMMix工作液中，充分混合，经
Modulus多功能光度计测定，得到图1曲线，灵敏度可达到0.5ng/ml(低 于0.5ng/ml，读数接近于O)。
权利要求
1、一种EvaGreenTM染料溶液Mix，其含有下列组分Na2HPO40.005～0.015mol/LNaH2PO40.005～0.015mol/LNaCl 0.1～0.2mol/LEDTA·2Na 2～3mmol/LEvaGreen 4.5～5.5μmol/L甘油 3～8％最后用磷酸调pH至 7.1～7.5其余为双蒸水。
2、 如权利要求l所述的EvaGreen 染料溶液Mix,其含有下列 组分0.01 mol/L Na2HP040.01mol/LNaH2PO40.15 mol/L NaCl2.5 mmol/L EDTA-2Na4.5~5.5)imol/ L EvaGreen5%甘油最后用磷酸调pH至7.3 其余为双蒸水。
3、 权利要求1或2所述EvaGreen 染料溶液Mix的工作液。
4、 一种双链核苷酸定量检测的方法，其包括步骤用权利要求 1 3任一项所述的EvaGreen 染料溶液Mix与待测双链核苷酸溶液 等体积混合避光室温孵育，检测其荧光强度，通过与标准曲线进行比 对，得到待测双链核苷酸溶液的浓度。
5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，将权利要求1或2 所述的EvaGreen 染料溶液Mix作为工作液，与待测双链核苷酸溶液等体积混合后壁光室温孵育。
6、 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，孵育时间为 2 5min。
7、 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，还包括将所述 待测双链核苷酸溶液配制成系列浓度的样品，然后分别与EvaGreen 染料溶液Mix混合孵育。
8、 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述标准曲线 是以小牛胸腺DNA为标准物建立。
9、 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，釆用Modulus 多功能光度计、荧光酶标仪或实时定量PCR仪检测荧光信号。
10、 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述双链核苷 酸为基因组DNA或其片断、质粒DNA或其片断或人工双链序列。
全文摘要
本发明公开了一种双链核酸精确定量的方法。该方法用EvaGreen<sup>TM</sup>染料溶液与待测双链核苷酸溶液混合避光室温孵育，利用Modulus分光光度计、荧光酶标仪、实时定量PCR仪等荧光检测仪器对染料与纯化的双链核酸结合后所产生的荧光强度进行定量检测。本发明和传统的双链核酸紫外测定法相比更快速、准确、稳定。且较一般的双链核酸荧光测定方法特异性强，灵敏度高，能够快速对双链核酸如基因组DNA进行定量检测。
文档编号G01N21/64GK101187633SQ20071017981
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月18日 优先权日2007年12月18日
发明者元延芳, 白卫滨, 罗云波, 许文涛, 黄昆仑 申请人:中国农业大学