专利名称：H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体或其结合活性片段及其用途的制作方法
相关申请本发明申请要求源自2006年1月26日递交的中国发明申请200610002312.1的优先权，该申请的全部内容包含于本发明申请之中。
发明领域
本发明涉及可特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之单克隆抗体，及其保守性变异体或活性片段，或其多肽或多肽类似物的相关编码序列，或产生所述单克隆抗体的细胞株，及应用该抗体或片段用于诊断与治疗的方法。
背景技术：
自H5型禽流感于1996年首先在我国广东省农场的鹅群暴发以来(Xu，X.et al.，1999，Virology)，由此病毒演生出来的另一株H5病毒在香港的禽鸟农场(1997年4月)及市场(1997年11月)暴发，引起了历史上禽流感病毒第一次直接由禽传人事件，前后共18例确诊病例中有6人死亡。2003年以来，H5病毒株在整个东亚及东南亚国家的相继暴发，WHO及流感专家预测H5禽流感病毒将最有可能成为下一次人类大流感暴发的流行株。2004年初，H5型高致病性禽流感也先后在我国十几个省暴发，并在中国香港、泰国、荷兰等发现H5型禽流感传染鸡、鸭、苍鹭、虎、猫等多种动物的事件。更令人担忧的是，在泰国已经出现疑似人传染人事件，马来西亚也有多例报道。进入2005年，罗马尼亚、俄罗斯、土耳其等欧洲国家相继发现禽类感染H5型禽流感病毒致死事件，专家认为此乃带毒候鸟迁移的结果，这使得控制高致病性H5型禽流感病毒的进一步扩散传播变得更为困难。专家预测，随着侯鸟的传播，H5型禽流感病毒有可能通过欧亚、亚非大陆桥进一步传播到卫生条件极差的非洲国家，使得H5型禽流感病毒获得和其它人流感病毒充分重组的机会和时间，届时将很可能形成一种对人类高度致命的全新流感病毒，其给人类带来的各种损失将难以估计。根据WHO统计结果，截止2006年1月19日，全球因感染H5N1病毒死亡的人类个案已达80例，给全球公共卫生安全带来极大的考验。
最新研究结果(Li，K.S.et al.，2004，Nature)表明，华南水禽(家鸭)为H5型禽流感病毒的主要携带者及传播者，H5型禽流感的爆发有明显的季节性，并伴随着生物多态型(多种基因型)的演变。然而，分子流行病学研究表明，目前鸭群种大约有30％的阳性感染并无任何症状，鸡群中也有达10％的流行且无症状带毒。这些受感染的动物又能够不断使人受到新的感染，对人类的健康构成巨大的威胁。有关专家一致认为要控制好H5型高致病性禽流感病毒在整个东亚、东南亚以及欧洲各国的流行，早期诊断是先决条件，然后才能做到早隔离、早处理，对人做到早治疗。
采用传统的病毒分离及血清诊断方法诊断禽流感病毒需时4—5天，且目前大部分人及动物疾控系统实验室缺乏三级生物安全实验室，故东南亚各国及地区对H5暴发的诊断明显滞后。常见的情况是大量鸡只死亡和扑杀行动完成后仍未有实验室的确诊报告，给控制病毒的暴发带来很大不便。另外，因少数禽类(特别是水禽，如家鸭)存在着无症状带毒情况，检疫系统又无有效的检测手段，这种情况的持续发展，引起了该病毒在多个国家地区反复暴发，迁延不断的局面。
同时，由于H5型禽流感病毒(其中Goose/Guangdong/1/96为代表株)属高致病性病毒，对目前常用的动物模型均有致死性，而采用基因工程方法表达的血凝素蛋白(HA)又不能完整取得抗原性，世界上多个著名实验室先后尝试制备针对该病毒系的单克隆抗体均未获成功。目前对该病毒抗原性分析不得不采用特异性及反应性均明显达不到诊断试剂要求的由A/chicken/Pennsylvania/1370/83(H5N2)和A/chicken/Pennsylvania/8125/83(H5N2)制备的单克隆抗体。
鉴于上述情形，目前迫切期望能有一种方便、快捷、实时的诊断方法和手段，从而及时把第一代跨种族传染的病人隔离治疗，防止病毒向人传人发展，在病毒未适应人类之前就打断其传播链，从而从根本上消除该病毒对人类的大流感威胁。
中国国内，有关抗禽流感病毒H5亚型检测研究已有文献报道。扬州大学畜牧兽医学院秦爱建等(秦爱建，邵红霞，钱琨等，中国预防兽医学报，2003，03期)研制了抗禽流感病毒H5和H9亚型血凝素特异性单克隆抗体，应用这些单克隆抗体进行间接免疫荧光试验被证明能在24小时内迅速检测出相应的禽流感病毒。北京出入境检验检疫局利用荧光RT-PCR快速检测高致病力禽流感病毒H5亚型，检测时间缩短为4小时，于2005年12月10日通过临床验证。郭元吉在“人禽流感研究现状”一文中综述了H5亚型毒株抗体检测需用微量中和实验或特异性高的ELISA(郭元吉，中华实验和临床病毒学杂志，2004，03期)，但有关利用ELISA检测H5亚型的研究性文献却未见相关报道。
国外有关利用ELISA检测H5N1抗体的研究已有报道。Rowe等报道了应用重组血凝素蛋白作为抗原包被，利用间接ELISA检测H5N1抗体，其ELISA的灵敏度为80％，特异度为62％(Rowe T.et al.，J.Clin.Microbiol.，April 1999；37(4)937-43)，但该文献并非针对H5N1亚型血凝素HA基因特异的单克隆抗体。Zhou等(Zhou，E.M.et al.，AvianDis.，1998，42(4):757-61)、Shafer等(Shafer，A.L.et al.，Avian Dis.，1998，42(1):28-34)采用竞争ELISA法检测禽流感病毒抗核心蛋白抗体，但检测对象均为A型禽流感所有H1-H16亚型的NP蛋白抗体，不能确定亚型。Lu报道了基于单克隆抗体的Dot-ELISA检测禽流感病毒(AV)，该方法直接检测AIV抗原，其特异性在于不会与其它禽类病毒发生交叉反应(Lu H.，Avian Dis.，2003，47(2)361-9)。虽然Sala等建立了基于H7亚型表面糖蛋白特异的单克隆抗体的ELISA，但其亚型为H7；单克隆抗体为表面糖蛋白特异的单克隆抗体，并非H5亚型血凝素HA基因特异的单克隆抗体(Sala G，Cordioli P，Moreno-Martin et al.Avian Dis.2003，47(3 Suppl):1057-9)。
遗憾的是，现有禽流感病毒免疫学诊断手段使用的单克隆抗体大部分针对的是核蛋白(NP蛋白)，因而其检测的是A型(也称甲型)流感病毒，但实际上A型流感病毒包括H1～H16共16个亚型，其中相当大的亚型均无致病性或有低致病性，只有H5亚型禽流感病毒为危害最大的高致病性禽流感病毒。因而现有技术远不能满足临床检测的需要。
本发明的根本目的在于克服现有禽流感病毒免疫检测技术的缺陷，所采用的单克隆抗体针对的为H5亚型的HA蛋白，因而能够特异的检测具有高致病性的H5亚型禽流感病毒。
发明内容
本发明提供了可特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之单克隆抗体，及可阻断至少50％的单克隆抗体与H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白结合活性之单克隆抗体.本发明也提供了相关的杂交瘤细胞株，分离的核酸分子和短肽，以及其含该单克隆抗体的药物组合物和医药诊断设备和试剂盒。本发明也提供了利用该单克隆抗体探测，诊断，预防，和治疗禽流感病毒，特别是H5亚型禽流感病毒的方法.
图1为金标法H5亚型流感病毒HA抗原检测试剂盒的测定结果，其中＂a＂出现两条红色线，认定为阳性；＂b＂只出现质控线，认定为阴性；＂c＂不出现红色线，则认定为无效。
图2为金标法H5亚型流感病毒anti-HA抗体检测试剂盒的测定结果，其中＂a＂只出现质控线，认定为阳性；＂b＂出现两条红色线，认定为阴性；＂c＂不出现红色线，则认定为无效。
图3为H5亚型流感病毒HA抗原检测试剂盒的测定结果，其中，“+”表示出现椭圆形显色区域，认定为阳性；“-”表示未出现椭圆形显色区域，认定为阴性。
图4为6种嵌合抗体的表达质粒图pcDNA3.1-Ak8H5、pcDNA3.1-AH8H5、pcDNA3.1-Ak10F7、pcDNA3.1-AH10F7、pcDNA3.1-Ak4D1和pcDNA3.1-AH4D1。
图5为三种嵌合抗体对Ck/HK/Yu22/02毒株的血凝抑制实验，其中，第1、2、3列PBS对照物；第4和5列10F7 cAb；第6列10F7 mAb；第7和8列4D1 cAb；第9列4D1 mAb；第10和11列8H5 cAb；第12列8H5 mAb。
图6为嵌合抗体与表达H5血凝素的细胞反应的免疫荧光检测实验结果，其中，A为cAb 4D1(DAPI)；B为cAb 4D1(FITC)；C为cAb 10F7(DAPI)；D为cAb 10F7(FITC)；E为抗-HBV cAb(DAPI)；F为抗-HBV cAb(FITC)。
图7为噬菌体多肽的ELISA检测值OD(450/620)的矩形图。
图8为pTO-T7与pTO-T7-239-123的质粒示意图。
图9为pTO-T7与pTO-T7-239-125的质粒示意图。
图10为融合蛋白(或重组蛋白)239-123纯化样品的SDS-PAGE电泳图，其中，1分子重量标签；2表达239-123的E.coli全部溶胞产物；3239-123之超声溶胞产物的上清；4缓冲液I中的239-123；52M尿素中的239-123纯化融合蛋白；64M尿素中的239-123的纯化融合蛋白；78M尿素中的239-123的纯化融合蛋白。
图11为融合蛋白239-125纯化样品的SDS-PAGE电泳图，其中，1分子重量标签；2表达239-125的E.coli全部溶胞产物；3全部溶胞产物之离心分离上清；4缓冲液I中的239-125；52M尿素中的239-125的纯化融合蛋白；64M尿素中的239-125的纯化融合蛋白；78M尿素中的239-125的纯化融合蛋白。
图12显示了239-123融合蛋白的结合特性其ELISA检测值OD(450/620)的色彩强度矩形图，其中，239-123融合蛋白结合到水平轴所标识的各种毒株上。
图13显示了239-125融合蛋白的结合特性其ELISA检测值OD(450/620)的色彩强度矩形图，其中，239-125融合蛋白结合到水平轴所标识的各种毒株上。
图14为在各种mAb稀释下，239-123融合蛋白结合到8H5mAb(三角形点线)或8C11mAb(方点线)的ELISA检测值OD(450/620)的色彩强度。
图15为pC149-mut与pC149-mut-123的质粒图。
图16为pC149-mut与pC149-mut-125的质粒图。
图17为小量表达的重组蛋白的全胞溶胞产物的SDS-PAGE电泳图，其中，1D123；2T123；3F123；4Q123；5D125；6T125；7F125；8Q125。
图18为纯化重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，1D123；2T123；3F123；4Q123；5D125；6T125；7F125；8Q125。
图19为类病毒颗粒的电镜图，该类病毒颗粒是由HBV cAg片段的融合蛋白和结合抗体的多肽组装而成的。
图20为显示融合蛋白HBc-123/125与单抗8H5之间结合亲和力的ELISA检测值OD(450/620)的色彩强度矩形图。
图21为显示融合蛋白HBc-Q123或HBc-D125与各种单抗之间结合亲和力的ELISA检测值OD(450/620)的色彩强度矩形图；结果表明，融合蛋白HBc-Q123和HBc-D125 T特异性地结合单抗8H5。
图22显示了ELISA检测HBc-123融合蛋白免疫鼠血清抗体滴度上升曲线，其中，时间为0-4周，抗体滴度通过ELISA检测。
图23显示了ELISA检测HBc-125融合蛋白免疫鼠血清抗体滴度上升曲线，其中，时间为0-4周，抗体滴度通过ELISA检测。
图24显示了免疫荧光检测免疫鼠血清与SF21细胞中表达的HA蛋白的反应。
图25为HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129重组蛋白组装的类病毒颗粒的电镜图。
图26为显示融合蛋白HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129与各种单抗之间的结合亲和力的ELISA检测值OD(450/620)的色彩强度矩形图；结果表明，融合蛋白HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129特异性地结合到单抗8H5。
图27显示了由12肽融合蛋白组装的的类病毒颗粒与H5N1病毒竞争结合8H5酶标抗体的结果，其中，纵轴是色彩强度(以OD(450/620)值表示)，水平轴是实验中所用的各种类病毒颗粒和PBS对照物。
具体实施例方式
本发明申请中涉及的有关术语的定义如下
本发明中的“血凝素”一词指禽流感病毒的包膜糖蛋白。血凝素蛋白介导流感病毒针对宿主细胞的吸附和进入。禽流感病毒的血凝素蛋白有16个血清学亚型，HA1—HA16，分别对应于16个病毒亚型，即H1—H16。
本发明中的“抗体”一词指任意一种免疫球蛋白，包括能结合特异性抗原的单抗、多抗、双特异性或多特异性抗体。一个完整的抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链含有一个可变区和第一、第二、第三等三个恒定区；每条轻链包含一个可变区和一个恒定区。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的颈部含有两条重链的第二和第三恒定区，其通过二硫键结合形成。“Y”型结构的每条臂含有其中一条重链的第一恒定区和可变区，和一条轻链的可变区和恒定区。轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3(其由Kabat等人命名，见Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition(1991)，第1-3卷，NIH Publication 91-3242，Bethesda Md)。其中，三个CDR由构架区(FR)间隔开。构架区比CDR区更保守并形成一个架子状结构支撑超变区。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类，主要是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些类还进一步分成亚类，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2等。
本发明中的“抗体”一词，除特指完整的免疫球蛋白外，也指免疫球蛋白的片段(如至少是免疫球蛋白分子的一个免疫活性区段)，如Fab、Fab＇、F(ab＇)2、Fv片段、单链抗体分子或由含有一个或多个CDR区的免疫球蛋白分子的任意片段形成的多特异性抗体。另外，本发明涉及的抗体也可以是由一个特定的人免疫球蛋白中的一个或多个CDR区结合一个或多个不同的人免疫球蛋白的构架区形成的抗体。
抗体相关的“Fab”片段是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。
“Fab"片段是指包含了部分铰链区的Fab片段。
F(ab＇)2指的是Fab’的二聚体。
抗体的“Fc”指的是第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合成的抗体的一部分。抗体的Fc段有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。
抗体的“Fv”段指的是能结合完整的抗原结合位点的抗体的最小片段。一个Fv片段包括一条轻链的可变区结合到一条重链的可变区。
本发明中的“单链Fv抗体”或“scFv”指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体(Houston 1988)。
本发明中的“单链抗体Fv-Fc”或“scFv-Fc”也包括scFv连接抗体的Fc段形成的工程抗体。
本发明中的“抗原决定簇”(或称表位)指的是抗原分子中与抗体结合的那部分氨基酸或原子基团。
发明中的“单抗”或者“MAb”或者“mAb”指的是来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除仅在少数情况下可能出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。单抗与多抗不同，多抗是包含了识别抗原上的不同表位的抗体分子。虽然传统的单抗是由杂交瘤细胞分泌的，但本发明涉及的单抗并不仅限于此制备方法。如，本发明涉及的单抗可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature，256:495，1975)，也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P4,816,567)。
本发明中的“嵌合抗体”一词指的是抗体轻链或/和重链的一部分是源自某一特定物种或属某一特定抗体类或亚类的序列相同或同源的抗体，而抗体轻链或/和重链的另一部分是源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的序列相同或同源的抗体。不管怎样，这种抗体片段仍保留了对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly et al.；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851 6855(1984))。
本申请中，“人源化抗体”一词指的是人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是有预期特异性、亲和性和反应性的小鼠、大鼠或兔抗体。另外，人源免疫球蛋白的构架区(FR)的氨基酸序列也可被相应的非人源抗体的氨基酸序列所替换。而且，人源化抗体的氨基酸残基也可以既非来源于受体抗体，也非来源于供体抗体的CDR区或构架区序列。这些人工修饰的目的是进一步完善或优化抗体性能。总之，人源化抗体是指含有至少一个、通常是两个几乎完整的可变区，其中对应的所有或几乎所有的CDR区是来自非人源抗体，其中的全部或几乎全部的FR区是来自人源抗体。理想的人源化抗体至少含有免疫球蛋白的Fc区的一部分，通常是人源免疫球蛋白的Fc区。更多详细内容请参阅Joneset al.，Nature，321:522 525(1986)；Reichmann et al.，Nature，332:323 329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2:593 596(1992)；and Clark，Immunol.Today 21397 402(2000)。
本申请涉及的“被分离”一词，指的是天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“被分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变或从天然环境下离分出该物质，或二者情况均有发生。比如，某一活体动物体内天然存在的某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为被分离。这里的“被分离”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
本发明中“载体”一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
本发明中“宿主细胞”一词指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者动物细胞如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞，或人细胞。
“中和抗体”一词指的是能清除或显著降低目标病毒抗原结合毒力的抗体或抗体片段。
“序列相同百分比”一词指的是候选序列中的核酸或氨基酸分别与对应的核酸或多肽序列中核酸或氨基酸相同性的百分比。这里涉及到的与核酸序列或者多肽序列有关的术语“序列相似百分比”定义为候选核酸序列或氨基酸残基序列分别与目的核酸序列或氨基酸序列的相似百分比。对于某一个序列，将它和目的序列进行比对，必要时可跳过突变缺口，以达到最大的基因相似百分比，而不去考虑相似序列的任意保守性突变。本领域的多种比对方法可用于确定核酸或氨基酸序列的相似性，如可用的计算机软件包括BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)等。熟悉本领域技术的工作人员懂得给比对设定合适的测量参数，包括为使用最大可比性的一些运算法则达到而全长序列的比较。
“特异性结合”一词指的是，指两分子间的非随机结合反应，如抗体和产生该抗体的抗原间的反应。此处，结合第一种抗原的抗体对第二种抗原的结合亲和力是检测不到或很弱。在某些实施方式中，一个某抗原特异性抗体是指以亲和力(KD)≤10-5M(如10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M等)结合该抗原，其中KD指解离率与结合率的比值(koff/kon)，其可以采用本领域技术人员熟悉的方法进行测定。
抗体
本发明所述单抗能够特异性结合H5亚型禽流感病毒。本发明的一个方面涉及能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单抗及其相应的抗原结合片段。
本发明所述抗H5单抗是由小鼠杂交瘤细胞株8H5，3C8，10F7，4D1，3G4和2F2所分泌的。这些单抗的名称以其相应的杂交瘤细胞株进行命名。也就是，这些抗H5单抗分别由杂交瘤细胞株8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2产生，并分别命名为8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2。单抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白。小鼠杂交瘤细胞株8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2已在2006年1月17日于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，Wuhan University，Wuhan，China)进行保藏，保藏号是CCTCC—C200607(杂交瘤细胞株8H5)，CCTCC-C200605(杂交瘤细胞株3C8)、CCTCC-C200608(杂交瘤细胞株10F7)、CCTCC-C200606(杂交瘤细胞株4D1)、CCTCC-C200604(杂交瘤细胞株3G4)和CCTCC-C200424(杂交瘤细胞株2F2)。
本发明涉及单抗还包括能阻断单抗8H5，3C8，10F7，4D1，3G4或2F2结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单抗。这些单抗结合的血凝素上的表位可以与单抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4或2F2所识别的表位相同。这些单抗所识别的表位也可以和单抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4或2F2所识别的表位在空间上有重叠。这样的单抗可以降低单抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4或2F2与H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的结合力至少50％，或至少60％，或优选至少70％，或更优选至少75％，或更优选至少80％，或更优选至少85％，或更优选至少90％，或更优选95％，或最优选99％。
可以采用常规方法如A ntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中描述的方法，测定某一未知单抗降低某一已知单抗结合H5血凝素蛋白的能力。例如，先把抗原预包被在微孔板上，然后把系列稀释的未标记的待测抗体和特定浓度的标记后的已知单抗共同加入上述预包被后的微孔板中孵育，洗涤后测定不同稀释度的待测抗体下已知抗体结合到板上的数量。待测抗体竞争已知抗体结合抗原的能力越强，已知抗体结合抗原的能力就越弱。通常，抗原是预包被在96孔微孔板上，并利用放射标记法或酶标记法测定未标记单抗阻断已标记单抗的能力。
可以采用Kohler等在Nature 256495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备单抗。首先将免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。免疫原预先藕联到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆姨酶抑制剂上，可能会有助于增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以利用福氏佐剂或MPL-TDM等。动物受免疫后，体内会有分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞产生。另外，淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞与骨髓瘤细胞并用合适的融合剂，如PEG，进行融合以获得杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103，Academic Press，1996)。
上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长，培养液中最好含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT or HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养液中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养液敏感等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21 and MC-11小鼠肿瘤衍生株(THE SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA)，和SP-2或X63-Ag8-653细胞株(American Type Culture Collection，Rockville，Md.USA)。另外也有研究报道利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
杂交瘤细胞生长的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性有免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，利用Munson等在Anal.Biochem.107220(1980)描述的Scatchard分析法可用来测定单抗的亲和力。
当杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性确定之后，目的细胞株可以通过(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103，Academic Press，1996)所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。
利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。
本发明所述单抗还可以是通过基因工程重组技术获得。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，如E.coli细胞、猿猴COS、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。转染后的宿主细胞在特定条件下培养并表达目标抗体。
本发明的抗体对H5血凝素蛋白结合具有高特异性和高亲和力。这些抗体对其它亚型的血凝素蛋白可能会有弱的交叉反应性，优选地，这些抗体对其它亚型的血凝素蛋白完全没有交叉反应性。一方面，本发明的抗体结合H5血凝素的KD值小于1×10-5M；优选地，KD值小于1×10-6M；更优选地，KD值小于1×10-7M，最优选地，KD值小于1×10-8M。
本发明的单抗可以是包含两条重链和两条轻链的传统的“Y”型结构状的抗体。另外，所述抗体也可以是保持了对血凝素蛋白亲和力的传统的“Y”型结构状的抗体上的Fab片段、Fab＇、F(ab)2、Fv、或其它类型的部分片段，其结合血凝素蛋白的亲和力可以高于或低于传统的“Y”型结构状的抗体。
本发明的抗体片段可以利用水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto et al.，J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.，Science 229:81(1985))。另外，这些抗体片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed in Hudson，Curr.Opin.Immunol.11548-557(1999)；Little et al.，Immunol.Today，21364-370(2000))。比如，Fab＇片段可以直接从E.coli细胞中获得或化学藕联形成F(ab＇)2片段(Carter et al.，Bio/Technology，10:163-167(1992))。再如，F(ab＇)2片段可以用亮氨酸拉链GCN4连接获得。另外，Fv、Fab或F(ab＇)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备抗体片段的其它技术。
抗体核酸序列
本发明涉及特异性结合H5血凝素蛋白的抗体或抗体片段的编码核酸分子。编码抗体的核酸分子可以从杂交瘤细胞中分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓利用常规技术可以测定这些分子的核酸序列。本发明涉及的抗体核酸分子也可以利用传统的基因工程重组技术或化学合成方法获得。一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列包含了抗H5抗体的重链可变区或抗体分子的部分核酸序列。另一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列也包括抗H5抗体的轻链可变区或抗体分子的部分核酸序列。另一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列还包括重链或轻链可变区的CDR序列。
本发明的一方面涉及编码单抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重链和轻链可变区序列的核酸分子。单抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重链可变区序列(VH，Vh)的核酸分子分别对应于SEQ ID NO1、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9、SEQ ID NO16、SEQ ID NO20和SEQ ID NO24。单抗8H5、3C8、10F7、4D1和2F2轻链可变区序列(VK，Vk)的核酸分子分别对应于SEQ ID NO3、SEQ ID NO7、SEQ ID NO11、SEQID NO18和SEQ ID NO26。本发明还涉及包含了单抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重链和轻链可变区序列的核酸分子变异体或类似体。
另一方面，本发明还涉及各种分离的核酸分子的变异体，其序列与如下核酸序列相同SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQID NO11、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO24或SEQ IDNO26。具体地，核酸变异体的序列与如下核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26的相同性至少达70％、优选至少达75％、更优选至少达80％、更优选至少达85％、更优选至少达90％、最优选至少达95％。
本发明还提供能特异性结合H5亚型禽流感病毒的抗体片段的编码序列的核酸分子。
本发明更进一步还涉及编码抗体重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NOs28-30、SEQ ID NOs34-36、SEQ ID NOs40-42、SEQ ID NOs46-48、SEQ ID NOs52-54和SEQ ID NOs58-60的所对应被分离的核酸分子。本发明还涉及编码抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NOs31-33、SEQ ID NOs37-39、SEQ ID NOs43-45、SEQ ID NOs49-51和SEQ ID NOs61-63的所对应的核酸分子。
本发明涉及含有所述核酸分子的重组表达载体，也涉及转化了这些分子的宿主细胞。而且，本发明还涉及利用包含了所述核酸分子的宿主细胞在特定条件下培养并分离得到发明所述抗体的方法。
抗体多肽序列
单抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重链和轻链可变区氨基酸序列可以从对应的核酸序列中推导得到。单抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO17、SEQ ID NO21和SEQ ID NO25。单抗8H5、3C8、10F7、4D1和2F2轻链可变区氨基酸序列分别是SEQID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO19和SEQ ID NO27。一方面，本发明提供的抗H5单抗包含的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQID NO10、SEQ ID NO17、SEQ ID NO21和SEQ ID NO25。另一方面，本发明提供的抗H5单抗包含的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO19和SEQ ID NO27。
另一方面，本发明提供的抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO2、SEQID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO17、SEQ ID NO21或SEQ ID NO25的序列相似性至少达70％，优选是至少75％，优选是至少80％，优选是85％，再优选是至少90％，最好的是至少95％。
另一方面，本发明提供的抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO4、SEQID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO19或SEQ ID NO27的序列相似性至少达70％，优选是至少75％，优选是至少80％，优选是85％，再优选是至少90％，最好的是至少95％。
单抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2的重链和轻链可变区的CDR的氨基酸序列确定如下
单抗8H5重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNos28-30。单抗8H5轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNos31-33。
单抗3C8重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID Nos34-36。单抗3C8轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID Nos37-39。
单抗10F7重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID Nos40-42。单抗10F7轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID Nos43-45。
单抗4D1重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID Nos46-48。单抗4D1轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID Nos49-51。
单抗3G4重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID Nos52-54。
单抗2F2重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID Nos58-60。单抗2F2轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID Nos61-63。
另一方面，本发明提供了抗H5单抗重链或片段，其含有如下CDR(i)来自SEQID NOs28-30的一个或多个CDR；(ii)来自SEQ ID NOs34-36的一个或多个CDR；(iii)来自SEQ ID NOs40-42的一个或多个CDR；(iv)来自SEQ ID NOs46-48的一个或多个CDR；(v)来自SEQ ID NOs52-54的一个或多个CDR；或(vi)来自SEQ ID NOs58-60的一个或多个CDR。在一实施方式中，抗H5单抗重链或片段含有三个氨基酸序列为SEQID NOs28-30的CDR。在另一实施方式中，抗H5单抗重链或片段含有三个氨基酸序列为SEQ ID NOs34-36的CDR。在又一实施方式中，抗H5单抗重链或片段含有三个氨基酸序列为SEQ ID NOs40-42的CDR。在又一实施方式中，抗H5单抗重链或片段含有三个氨基酸序列为SEQ ID NOs46-48的CDR。在又一实施方式中，抗H5单抗重链或片段含有三个氨基酸序列为SEQ ID NOs52-54的CDR。在又一实施方式中，抗H5单抗重链或片段含有三个其氨基酸序列为SEQ ID NOs58-60的CDR。
另一方面，抗H5单抗的重链或片段的CDR含有的氨基酸序列可能是在SEQ IDNOs28-30、34-36、40-42、46-48、52-54和58-60上出现一个或多个氨基酸的突变或增添或缺失。优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过3个氨基酸。更优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过2个氨基酸。最优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过1个氨基酸。
另一方面，本发明提供了抗H5单抗轻链或片段含有如下CDR(i)来自SEQ IDNOs31-33的一个或多个CDR；(ii)来自SEQ ID NOs37-39的一个或多个CDR；(iii)来自SEQ ID NOs43-45的一个或多个CDR；(iv)来自SEQ ID NOs49-51的一个或多个CDR；(v)来自SEQ ID NOs61-63的一个或多个CDR。在一实施方式中，抗H5单抗轻链或片段含有三个其氨基酸序列为SEQ ID NOs31-33的CDR。在另一实施方式中，抗H5单抗轻链或片段含有三个其氨基酸序列为SEQ ID NOs37-39的CDR。在又一实施方式中，抗H5单抗轻链或片段含有三个其氨基酸序列为SEQ ID NOs43-45的CDR。在又一实施方式中，抗H5单抗轻链或片段含有三个其氨基酸序列为SEQ ID NOs49-51的CDR。在又一实施方式中，抗H5单抗轻链或片段含有三个其氨基酸序列为SEQ ID NOs55-57的CDR。在又一实施方式中，抗H5单抗轻链或片段含有三个其氨基酸序列为SEQ IDNOs61-63的CDR。
另一方面，抗H5单抗的轻链或片段的CDR含有的氨基酸序列可能是在SEQ IDNOs31-33，37-39，43-45，49-51和61-63上出现一个或多个氨基酸的突变、增添或缺失。优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过3个氨基酸。更优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过2个氨基酸。最优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过1个氨基酸。
上述抗体或CDR的可变区的氨基酸发生突变、添加或缺失之后的变异体仍然保留特异性结合H5亚型禽流感病毒的能力。本发明也包含这样的抗原结合片段的变异体。
本发明的单抗变异体可以通过传统的基因工程方法获得。本领域的技术人员完全知晓利用核酸突变改造DNA分子的方法。另外，编码重链和轻链变异体的核酸分子也可以通过化学合成获得。
嵌合抗体、人源化抗体合融合蛋白
另一方面，本发明也提供了嵌合抗体，它是由鼠源单抗8H5，3C8，10F7，4D1，3G4或2F2或其变异体的重链和/或轻链完整的或部分的可变区结合人源单抗恒定区组成的。而且，本发明也包括了人源化抗体，它们是由鼠源单抗8H5，3C8，10F7，4D1，3G4或2F2或其变异体的的一个或多个CDR嫁接到人源抗体的框架上组成的。
另一方面，本发明还提供了藕联了某种分子的完全或部分含有本发明所述单抗的一种融合蛋白。
嵌合抗体、人源化抗体和融合蛋白都可以利用传统的基因工程技术获得。如，编码单抗的DNA可以通过突变的方法把人源抗体的重链和轻链的恒定区的序列替换成同源性的鼠源序列而改造成(Morrison，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.816851(1984))，或通过把整个或部分免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白编码序列进行共价藕联而获得嵌合或人源化抗体或融合蛋白。
中和抗体
另一方面，本发明提供了能够中和H5亚型禽流感病毒之病毒活性的抗H5抗体。在一实施方式中，这种中和抗体能够中和H5亚型禽流感病毒之病毒活性的至少60％，或至少70％，或优选至少75％，或优选至少80％，或优选至少85％，或优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％。
本领域普通技术人员完全知晓利用传统的技术方法可以测定抗体中和H5亚型禽流感病毒的病毒活性。如本发明的实施例1中所描述的中和试验的方法即可用于测定本发明中的某一个特定H5单抗的中和活性。
短肽
本发明还提供了一种模拟单克隆抗体识别表位的短肽。
九个含7个氨基酸的短肽由于其与单克隆抗体8H5、3C8结合而被筛选出来.其中，五个与8H5单克隆抗体结合的短肽有氨基酸序列SEQ ID NOS64-68，4个与3C8单克隆抗体结合的短肽有氨基酸序列SEQ ID NOS70-73(表14)。
七肽8H5A(SEQ ID NO64)和8H5E(SEQ ID NO68)显示了反应活性.8H5A七肽和8H5单克隆抗体结合得非常好，但与其他单克隆抗体结合得弱.8H5E七肽和8H5单克隆抗体结合得相对较差。
进一步地，本发明还提供了12个与单克隆抗体8H5结合有好而的特性的含12个氨基酸的短肽确(表16，SEQ ID NOS74-97)。
该12肽(SEQ ID NOS123，SEQ ID NOS125)可用于制成融合蛋白239-123和239-125，该融合蛋白分别和8C11及8H5单克隆抗体结合得很好.该12肽123或125可用于和HBVcAg制成融合蛋白，该融合蛋白和8H5单克隆抗体而非其他抗体结合有特性.融合蛋白HBc-122，HBc-124，HBc-128，HBc-129和8H5单克隆抗体而非其他抗体结合有特性.融合蛋白HBc-123，HBc-124，HBc-125，HBc-128，HBc-129还可模拟单克隆抗体识别表位而形成类似病毒颗粒的组装。
检测方法
本发明还提供了一种利用本发明所述单克隆抗体检测H5型禽流感病毒标本中的抗原和/或抗体的方法。
一方面，本发明提供了检测H5亚型禽流感病毒的方法，包括以下几个步骤(i)将本发明的某一株单克隆抗体或其某个片段与上述样品中的病毒结合而成抗体病毒或抗体片段病毒复合物；(ii)检测该样品复合物以确定样品中是否有病毒。
另一方面，本发明提供了一种检测样品中H5亚型禽流感病毒的方法，包括以下几个步骤(i)将第一抗体吸附到固相支持物上；(ii)在上述支持物中加入可能含有H5亚型禽流感病毒的可疑待测样品；(iii)在上述支持物中加入带有标记物的第二抗体；(iv)检测该标记物的存在从而判定H5亚型禽流感病毒是否存在。
本发明的另一个方面，提供了一种检测样品中H5亚型禽流感病毒的检测方法，包括以下几步(i)将抗体吸附到某一固相支持物；(ii)在该固相支持物中加入预混合H5血凝素标记物的可能含有H5亚型禽流感病毒的样品；(iii)检测是否存在H5血凝素标记物。
检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。利用竞争法或夹心法方式，上述检测方法可以用于检测目标抗原或抗体。
竞争法是比较样品中抗原和一种已知量的标记抗原竞争结合本发明所述单克隆抗体的数量关系。开展基于竞争法的免疫学检测是将含有未知数量的目标抗原的样品加入到事先用已知的物理或化学方法把本发明所述单抗包被到固相支持物上而得以进行的。同时加入预先定量的标记后的目标抗原进行反应。孵育后，冲洗固相支持物，检测结合到该支持物上的标记物的活性。
在夹心法中，样品中的目标抗原被夹在包被单抗和标记单抗之间，然后再加入标记物比如酶的底物，通过底物颜色的变化检测并判定抗原的存在。开展基于夹心法的免疫学检测，例如，先把含有一种未知数量目标抗原的样品加入到用物理或化学方法预先包被了本发明中所述单克隆抗体的固相支持物上进行反应。然后，加入本发明所述的标记单抗进行反应。孵育后，冲洗该支持物，再对结合到该支持物上的标记物的活性进行检测。标记物可以是放射性同位素如125碘、酶、酶的底物、发光物质如异鲁米诺和吖啶酯、荧光物质如荧光素和罗丹明、生物素和有色物质如乳胶颗粒和胶体金等。标记用的酶可以是过氧化物酶(如辣根过氧化物酶HRP)、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。对于这些反应中合适的底物有2，2＇-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)、鲁米诺-过氧化氢、邻苯二胺-过氧化氢(针对过氧化物酶)、对硝基苯磷酸盐、4-甲基磷酸伞型酮、3-(2＇-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3＂-磷酰基)苯基-1，2-二乙氧基烷(针对碱性磷酸酶)、对硝基苯-β-D-半乳糖和甲基伞形酮-β-D-半乳糖(针对β半乳糖苷酶)。其它的标记包括量子点标记、生色团标记、酶标记、亲和配体标记、电磁自旋标记、重原子标记、标记有纳米微粒光散射标记或其它纳米微粒的探针、异硫氰酸荧光素(FITC)、TRITC、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy-7、得克萨斯红、Phar-Red、异藻红蛋白(APC)、表位标记如FLAG或HA表位、以及酶标记如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、I2-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶和半抗原偶联物如洋地黄毒苷或二硝基苯酚、或能够形成配合物的结合配对如链霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗体配合物如包括兔IgG和抗-兔IgG；荧光基团如伞形三糖(umbelliferone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、绿荧光蛋白、藻红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、二苯乙烯、荧光黄、Cascade蓝、二氯三嗪基荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白、荧光镧系络合物如包括铕和铽、Cy3、Cy5、分子信标(molecular beacons)和其荧光衍生物、发光材料如鲁米诺；光散射或细胞质基因组共振材料如金或银颗粒或量子斑(quantumdot)或放射性材料如14C、123I、124I、131I、Tc99m、35S或3H；或球珠(spherical shell)，以及标记有本领域已知的任何其它信号产生标记物的探针。例如，可检测的分子包括但不限于荧光基团以及前面所述其它已知的，如在Joseph R.Lakowicz(Editor)所编的Principles of Fluorescence Spectroscopy，Plenum Pub Corp，第二版(July 1999)和Richard P.Hoagland的第六版的Molecular Probes Handbook所描述的。在某些实施方式中，标记物包括半导体纳米微晶如量子斑(即Qdots)，参见U.S.P 6,207,392。Qdots可从Quantum Dot Corporation购得。用于本发明的半导体纳米微晶包括Group II-V半导体的纳米微晶如MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe和其混合物以及Group III-V半导体的纳米微晶如GaAs、InGaAs、InP、InAs和其混合物。Group IV半导体如锗或硅的使用，或有机半导体的使用，在某些条件下可能是方便可行的。半导体纳米微晶也可以包括合金，其含有两种或多种选自于Group III-V化合物、Group II-VI化合物、Group IV元素和其组合物的半导体。
在某些实施方式中，荧光能量受体连接到检测探针作为标记物。在一实施方式中，荧光能量受体可以通过化合物与单线态氧反应形成荧光化合物而形成，或通过化合物与一辅助化合物反应并将其转化为荧光化合物而形成。这类化合物可以包括于本发明装置中的缓冲液中。在其它的实施方式中，荧光能量受体可以是包括化学发光剂或基团的化合物的一部分，例如，荧光能量受体可以包括稀土金属如铕、钐、碲等金属络合物。这些材料因其具有尖锐的发光谱带而特别具有吸引力；而且，镧系标记物如铕(III)可以提供有效的长时间的信号发射，同时不易光漂白，因而可以使得含有处理/反应样品的测试装置在需要的情况下可以放置较长一段时间。在各种异源和同源免疫测定法中，已经使用长寿命的荧光铕(III)络合物纳米微粒作为标记物，例如可以参见Huhtinen et al.Clin.Chem.2004 Oct；50(10)1935-6。但这些内部标记的纳米微粒与时间分辨荧光检测一起使用时，测定性能可以改善。在异源测定中，低浓度下测定的动态范围可以扩展；而且，通过使用检测抗体涂敷的高特异活性纳米微粒标记物，而不是使用常规标记的检测抗体，测定的动力学特性也可以改善。在同源测定中，对于荧光共振能量转移来说，铕(III)纳米微粒是很有效的供体，从而可以进行简单、快速和高效的筛选。在一实施方式中，标记物如此处披露的荧光标记物，包括与生物分子偶联的纳米微粒标记物。换句话说，纳米微粒可以用作检测或捕捉探针。例如，本发明中，可以利用连接到单抗或链霉抗生物素蛋白(SA)的铕(III)-标记的纳米微粒来检测样品中特定的分析物，如纳米微粒基的免疫测定。纳米微粒可以作为附着特定结合剂的底物，这些特定结合剂是针对分析物和检测(如标记物)或捕捉成分的。有关标记物的实例可以参见U.S.P 4,695,554；4,863,875；4,373,932；和4,366,241。U.S.P 4,313,734和4,373,932中则披露了胶体金属和染色颗粒。而U.S.P 4,954,452中则披露了如何制备和使用非金属的胶体；U.S.P 4,252,459中披露了用作标记物的有机聚合物乳胶颗粒。
把标记物结合到抗原或抗体上的方法，可以通过顺丁烯二酰亚胺法(J.Biochem.(1976)，79,233)、生物素活化法(J.Am.Chem.Soc.(1978)，100，3585)、疏水结合法、酯活化法或异氰酸酯法(＂Enzyme免疫测定techniques＂，published in 1987 by IgakuShoin)。
如果上述标记物为放射性同位素，则需使用好的防辐射的工作台面或液体防护设备。如果上述标记物为酶，需加入底物，酶的活性通过比色法或荧光计测定。如果上述标记物为荧光物质、发光物质或有色物质，测定方法可以相应的使用本领域熟知的方法进行测定。
本发明中，用于检测H5亚型禽流感病毒的样品包括但不限于动物或病人的排泄物、口腔和鼻腔分泌物、鸡胚培养中的全病毒或裂解病毒等。
检测装置和试剂盒
本发明还涉及一种检测H5亚型禽流感病毒感染的诊断试剂盒，尤其是检测样品中H5亚型禽流感病毒抗原或抗体的诊断试剂盒。本发明所述诊断试剂盒包含至少一种本发明所述单克隆抗体。本发明所述诊断试剂所使用的本发明所述单克隆抗体并不做特别限制，可以是任何一株识别H5血凝素抗原的单抗，也可以是本发明所述的具抗原特异性的任一单抗的抗体片段，如F(ab＇)2、Fab＇、Fab等。
一方面，本发明涉及两种检测H5亚型禽流感病毒的试剂盒，这些试剂至少包括一种单抗或者是它们的活性片段或者是突变体。优选地，本发明的试剂盒还包含适合检测抗原-抗体反应的检测试剂。
另一方面，本发明涉及一种检测抗H5亚型禽流感病毒抗体的试剂盒，它包括至少一种本发明所述单抗或其活性片段或其突变体。优选地，本发明中所述试剂盒包含适合检测抗原-抗体反应的检测试剂。
本发明的诊断试剂盒中涉及的固体支持物或固相支持物包括但不限于微孔板、磁微粒、免疫色谱用滤纸、聚合体例如聚苯乙烯、玻璃珠、玻璃滤器和其它不溶的载体。在一实施例中，一个包含多个隔间或区域的固相支持物中，至少有一个隔间用本发明的抗体所涂盖。优选的是，至少一个隔间(或第一个隔间)用本发明的抗体所涂盖，并且至少一个剩余的隔间(或第二个隔间)用可以和禽流感病毒除H5以外的亚型(例如，H1，H2，H3，H4，H6，H7，H9，H10，H11，H12，H13，H13，H14，H15orH16)可以特异性地结合的抗体所涂盖，优选的是亚型H1，H3，H7，H9。
本发明的诊断试剂还包含一些其它成分，包括但不限于标记用的酶、相应底物、放射性同位素、反光物质、荧光物质、有色物质、缓冲液和板条以及前面提到的诸如此类的物质。
本发明的诊断试剂中，所使用的发明单抗必须预先包被在固相支持物上。在一优选的实施方式中，对包被的单抗进行方向定位会有助于提高抗原抗体结合效率。TaeWoonCha等(Proteomics 5,416-419(2005))已证实控制预包被蛋白分子的构象及设计固相支持物表面理想的化学环境将有助于保持和提高固相化蛋白的反应活性及效价。文献已报道过多种方法能够把抗体按预定构象方向结合在固相支持物上。Shawn Weng等(Proteomics 2，48-57(2002))曾报道过利用核酸连接蛋白的方法使蛋白分子以相同的空间定位结合在某个表面上。Soellner，M等(J.AM.CHEM.SOC.125，11790-11791(2003))报道了一种能把包括抗体和抗原在内的蛋白通过Staudinger连接反应而以一种相同的方式结合到某个表面上的方法。在Staudinger反应中，叠氮化合物和磷硫酯反应形成一种氨基化合物。HairongZhang等(Anal.Chem，78,609-616(2006))报道了一种通过抗体Fab＇片段上的自由硫醇反应将镀金的磁珠上抗体定位到颗粒表面的方法，依据这个，所有抗体上的抗原结合位点都定位于一个理想的构象上。Hai Xu等(J.Phys.Chem.B，110，1907-1914(2006))曾报道将抗体吸附到亲水硅氧化物/水表面的方法。Seung-yong Seong等(Proteomics，3，2176-2189(2003))概括了定向地将蛋白固定到某个表面的方法以及在这些方法中所用到的蛋白分子。所有这些参考文献都被完整地归纳在这里。
本发明的诊断试剂盒中，所使用的单抗或抗原必须事先用上述提到的标记物标记。
本发明还涉及一种可自动化检测样品中的禽流感病毒的自动化检测装置。
现有技术中已经公开了各种利用免疫化学检测生物液样品中是否存在分析物的装置。这类装置可以利用所谓的“夹心法”测定，例如，目标分析物如抗原夹在标记的抗体和固定在固相支持物的抗体之间。通过观察是否存在结合的抗原标记的抗体复合物和/或其数量而进行测定。这类装置也可以采用竞争法免疫测定，其中，将结合于固相表面的抗体与含有未知数量抗原分析物的样品以及与同样类型的标记抗原进行接触。然后，测定结合于固相表面的标记的抗原的数量，从而为样品中抗原分析物的数量提供间接的测量。不同的测定可以利用适于测定不同分析物的装置，例如，将不同的抗体或抗原结合于测试底物的设计区或可寻址区(如吸水或非吸水膜)。由于这些方法以及下面讨论的其它的方法既可以检测抗体，也可以检测抗原，它们通常称作免疫化学配体-受体测定或简称免疫测定法.
固相免疫测定装置，无论是夹心法类型还是竞争法类型，都可以对生物液样品如血液或尿液中的分析物提供灵敏的检测。固相免疫测定装置包括固相支持物，其中，配体-受体对中的一员，通常是抗体、抗原或半抗原，结合于该固相支持物上。通常，早期的固相支持物的形式为平板、试管或聚苯乙烯珠，这在放射免疫测定和酶免疫测定中是熟知的。最近，人们采用各种多孔材料如尼龙、硝化纤维素、乙酸纤维素酯、玻璃纤维和其它的多孔聚合物作为固相支持物。人们也公开了许多自身带免疫测定的试剂盒，其采用多孔材料作为免疫化学成分如抗原、半抗原或抗体的固相载体。通常这些试剂盒在设计上可以采用纤维素试纸、流通或或迁移。本发明中可以采用任何常规的、已知的装置来完成免疫测定或特异性结合测定，以检测流感。
在某些方面，本发明包括检测由各种流感病毒或其亚型引起的感染H3的装置。在某些实施方式中，将含有一种或多种流感病毒或抗流感病毒抗体的样品送入装置中，以测定样品是否被一种或多种流感病毒或其亚型感染的主体。包含固相支持物的装置可以包括置于其上的抗流感病毒抗体或流感病毒抗原，从而可以对怀疑含有流感病毒、流感病毒蛋白或抗流感病毒抗体的样品进行测定。在许多实施方式中，本发明装置中所使用的抗体包括但不限于多抗、单抗(MAb)或其保守性或功能性变体、嵌合抗体、变形抗体、人源化抗体、其生物活性片段或这些抗体的任意组合；此处功能性抗体或其片段，从整体上讲就是指抗体。本发明的抗体可以适应任何装置，以检测流感病毒。例如，H5禽流感病毒可以通过靶定样品中的H5蛋白或抗H5亚型抗体而予以检测。在一实施方式中，H5是来自禽流感病毒(AIV)。
市场上购得的许多装置可以很容易地安装(或附加)此处所公开的抗体或抗原。这些装置可以包括检测方法中所使用的固相底物，包括但不限于微孔板、磁珠、免疫色谱用的滤纸、聚合物如聚苯乙烯、玻璃珠、玻璃滤器和其它不溶性的载体。底物通常可以是但不限于下列形状带状、板状、芯片、球状、珠状、孔状如微滴定板上的孔、或任何其它合适的形状。而且，结合其配合搭档(即抗原或抗体)的可以是任何形状，例如，微滴定盘、试管、纤维素试纸、微离心管、珠、自旋盘等等。合适的材料包括玻璃、塑料(如聚乙烯、PVC、聚丙烯、聚苯乙烯等)、蛋白、纸、碳水化合物和其它的固相支持物。其它可以使用的材料包括陶瓷、金属、metalloids、半导体材料、水泥等。在某些实施方式中，免疫测定法(如ELISA)微滴定板包括96孔、384孔板或1536孔的形式，或更多的孔，如其它商用板。
一些可以使用的装置包括纤维素试纸、侧流装置、cartridge、多重装置、微滴定板、微流装置、板或阵列或高通量的平台，如在下列美国专利中所公开的U.S.专利号6,448,001；4,943,522；6,485,982；6,656,744；6,811,971；5,073,484；5,716,778；5,798,273；6,565,808；5,078,968；5,415,994；6,235,539；6,267,722；6,297,060；7,098,040；6,375,896；7,083,912；5,225,322；6,780,582；5,763,262；6,306,642；7,109,042；5,952,173和5,914,241。例如，微流装置可以是U.S.P 5,707,799和WO2004/029221中所公开的。
纤维素试纸
在一些很平常的纤维素试纸测定中，如家用怀孕和排卵检测试剂盒中，免疫化学成分如抗体是结合在固相上。检测装置在怀疑含有未知抗原分析物的样品中蘸一下，然后保温培育。或者也可将少量的样品置于样品接受区中。然后加入标记的抗体，并检测标记物，作为感兴趣的分析物是否存在的指示。在某些情况下，标记物是酶，这样，需要加入酶标记的抗体，其可同时加入或在保温培育后加入。然后，清洗装置，并将其再插入到含有酶的底物的第二溶液中。如果存在酶标记，其会与底物发生相互作用，使得产生带色的产物，该产物要么作为沉淀物沉积到固相上，要么在底物溶液中产生可见光的变化。Baxter等在EP-A 0 125 118中公开了这样的夹心形纤维素试纸的免疫测定.Kali et等在EP-A 0282 192中公开了一种可以用于竞争法测定的纤维素试纸装置。T纤维素试纸的材料、形式以及标记物是已知的，而且可以用于流感检测中。纤维素试纸装置的实例包括U.S.P4,235,601、5,559,041、5,712,172和6,790,611中所描述的。在某些实施方式中，本发明的抗体可以置于纤维素试纸装置上。例如，可以使用固相支持物纤维素试纸，检测样品中的抗H5亚型AIV抗体，其中可以在一处或多处基质(matrix)点位安装该试纸。一处基质可附着有非特异性控制的抗体或其功能性片段。这些基质点位可以是蛋白结合位和/或抗原结合位，而且通常是由硝化纤维素制得的，但也可以使用本领域已知的任何适当的媒质，如某些尼龙和聚偏乙烯类。在某些实施方式中，可以在固相支持物附着多中基质，每一基质含有针对多种亚型流感病毒的抗原或抗体。
连续流
连续流型免疫测定装置的设计可以避免纤维素试纸测定中所需要的大量的培育和清洗。Valkirs等在U.S.P 4,632,901中公开了一种包括抗体(对目标抗原分析物具有特异性)的装置，该抗体结合于多孔性膜或滤器中，而该装置中加入液体样品。由于液体流经或连续流过膜中，目标分析物结合到抗体上。在加入样品之后，可以再加入标记的抗体。标记抗体的目视检测可以指出样品中是否存在目标抗原分析物。Korom et等在EP-A 0 299359中公开了一种在连续流装置上的改进，其中，标记的抗体附载到一膜中，该膜起到试剂传送体系的作用。这样的装置可以包括对样品中的成分起过滤器作用的层，并包括检测中所使用的试剂。当样品从一层流向另一层时，其与特定的结合试剂接触并发生反应，在某些情况下，标记体系中的组分可以提供是否存在目标分析物的指示。
免疫过滤装置
免疫过滤装置可以从市场上购得(如Pierce，Rockford，IL)，而且可以很容易地进行改造，以附载本发明的抗体。在酶联免疫流动测定法(ELIFA)中，在96孔样品板和真空室之间使用硝化纤维素膜。反应剂加到样品板上，真空使得反应剂通过该硝化纤维素膜。套管将没有结合的产物转移到收集室中。为了进行检测，在添加酶底物前，在收集室中放置一微量培养板(微孔板)。真空使得带色的产物转移到微量培养板的孔中，以便在自动化的微量培养板读取装置上进行分析。ELIFA体系包括精确切割的聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃，并带有密封垫圈，从而能够提供从一个孔到另一个孔之间恒定的流率。套管可以精确地将带色的产物转移到微量培养板的孔中，以便进行分析。本发明的捕捉抗体基本上是点在底物上(如微滴定板、膜或芯片)。施加怀疑带有流感病毒或流感病毒抗原的生物样品并进行孵育，使得捕捉抗体与其结合。随后，加入检测抗体。U.S.专利申请2003/0108949公开了一种高通量的免疫过滤装置。这样的装置可以包括起过滤器作用的层和/或包括检测中所用的试剂。当样品与特定的结合试剂发生反应，在某些情况下，标记体系中的组分就可以提供是否存在某一分析物的指示。
侧流装置
在侧流测定中，利用某些或全部的检测用试剂来浸渍膜。提供分析物检测区，并在该区检测标记的分析物。例如，可以参见Tom等的U.S.P 4,366,241和Zuk的EP-A O143 574。已知对于侧流检测装置可以进行许多改进。这类装置可以包含某些特异性结合检测中的试剂(样品在施加到侧流带之前可以与某些试剂反应，或者可以依次地在侧流带上添加额外的试剂)，或者侧流带可以包含用于特异性结合检测的所有必须的试剂。侧流装置经常包含试剂，这些试剂可以附着在彩色标记上，从而可以直接观察到检测结果，而不需要进一步添加其它物质。例如，可以参见Bernstein的U.S.P 4,770,853、May等人的WO88/08534和Ching等人的EP-A 0 299 428。这类装置通常如此构建，使其包括施加样品的位置、试剂区和检测区。此类装置通常是由吸水材料制得的，这样可以使得样品从样品施加区经试剂或反应区连续流至检测区。尽管某些反应在样品施加到带上之前可能就已发生，在某些实施方式中，反应区包括用于免疫测定的试剂。一种特异性结合试剂如抗体，其可以扩散性地结合到样品施加区或反应区的带上，使得其能够结合样品中的抗原，并与样品一起沿带流动。在检测区，可以直接用抗原或抗体的另一特异性结合搭档，捕捉抗原-抗体复合物，或者，也可以用另外的特异性结合搭档，如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白和生物素，间接地予以捕获。类似地，标记物可以直接地或间接地附着在抗原或抗体上。侧流装置的实例可参见U.S.P 4,818,677，4,943,522，5,096,837(RE 35,306)，5,096,837，5,118,428，5,118,630，5,221,616，5,223,220，5,225,328，5,415,994，5,434,057，5,521,102，5,536,646，5,541,069，5,686,315，5,763,262，5,766,961，5,770,460，5,773,234，5,786,220，5,804,452，5,814,455，5939，331和6,306,642。而U.S.P 4,703,017，6,187,598，6,352,862，6,485,982，6,534,320和6,767,714中则公开了其它的侧流装置，其可以改进，以便用于检测液体样品中的多个分析物。
常规技术中，可以在一单一的测试带中为每个分析物建立单独的检测区，从而可以检测一个样品中的多个分析物。通过使用不同的标记物或者在不同检测区检测同一标记物，可以区分不同的分析物。可以采用任何常规的装置，完成对多个分析物的测定。
免疫测定利用免疫体系的机制，其中，当存在致病的抗原或外来异物时，肌体就会作出反应，产生抗体。这些抗体和抗原，也即免疫反应物，能够彼此结合，从而产生一种高特异性的反应机制，该机制可以用来确定测试样品中是否存在特定的抗原以及其浓度。
这样的侧流装置通常包括一多孔性膜，其任选地负载于刚性材料上。一般地，该多孔性膜可由许多材料制得，其能够允许流体通过即可。例如，用于形成多孔性膜的材料包括但不限于天然材料、合成材料、或自然存在但经合成改性的材料如多糖(如纤维素材料如纸、纤维素衍生物如乙酸纤维素酯、硝化纤维素)；聚醚砜；聚乙烯；尼龙；PVDF；聚酯；聚丙烯；二氧化硅；无机材料如灭活氧化铝，硅藻土，亚硫酸镁，或其他无机微细材料，这些材料均匀地分布于多孔聚合物基体中，聚合物如氯乙烯，乙烯氯丙烯共聚物，乙烯氯乙烯醋酸盐共聚物，自然生成的织物(如棉花)或合成的(如尼龙或人造纤维)；多孔渗水胶质，如硅胶，琼脂糖，右旋糖苷和凝胶；聚合薄膜，如聚丙烯酰胺或其类似物。在一个特别实施方式中，所述多孔渗水膜有硝化纤维素和/或聚醚砜材料形成。应该理解的是所述术语“硝化纤维素”指纤维素硝酸酯，它可以只是硝化纤维素或是它与硝酸酯或其他酸酯的混和物，如带有1-7个碳原子的脂族羧酸。
这样的设备也可包括一个含有吸收衬垫的条带，此条带处于所述测试/检测或对照区的上游或下游。如本领域技术人员所熟知，所述吸收衬垫可帮助促进毛细管作用力式液体流通过所述膜。在某些实施方式中，吸收衬垫可含有可移动的免疫测定试剂(如，抗体)。当然，需要理解的是，所述可移动或固定的免疫测定试剂也可以被处理在所述测试/检测或对照区的上游的任何位置，就像在检测系统的单独组分中一样。
在许多实施方式中，有些合适的材料可被用于形成所述样品衬垫，包括但不限于，硝化纤维素，纤维素，多孔聚乙烯衬垫，纤维玻璃试纸。如果需要，样品衬垫也可包括一种或多种预处理的分析试剂，它们或共价地或非共价地结合到衬垫上。所述待测样品从样品衬垫上转移到与样品衬垫一端连通的结合衬垫上。所述结合衬垫由一种可供液体流通的材料形成。例如，在一实施方式中，所述结合衬垫有纤维玻璃形成。应当理解的是其他结合衬垫也可用于本发明。可选择地，在某些实施方式中，结合物或其他免疫试剂可被包括在一个组分内，所述组分在应用到检测带之前与样品混合。
为方便检测待测样品中被分析的存在与否，可在所述结合衬垫上应用多种检测探针。当这些检测探针在结合衬垫上，当被分析物从样品衬垫流到结合衬垫时(或在流体状态)，这些探针仍然可供被分析物结合。一旦结合到被分析物，检测探针随后被用来识别被分析物的存在与否。检测探针既可用于检测又可用于校正。但在另一个实施方式中，单独的标准探针可被应用到结合衬垫上，以与所述检测探针结合以便同时标准化并检测，所以可以消除常规分析标准系统通常导致的错误。然而，需要理解的是检测探针和校正探针可以同时或分别应用在检测中任何一个位置，并且不需要使用结合衬垫。此外，检测探针和校正探针也可以应用在相同或不同的结合衬垫上。或者，检测探针和校正探针也可以安置在诊断检测单元的不同区域，例如在自带性检测设备上，如在液体，流动水槽或擦拭子上。
在一些情况下，可能需要以某种方式修饰所述检测探针以便它们更容易结合到被分析物上。在这种情况下，所述检测探针可被特定的特异性结合元件所修饰，所述特异性结合元件粘合到检测探针上以形成结合探针。特异性结合元件一般指特异性结合配对的一个元件，如，两种不同的分子，其中一个分子化学性和/或物理性地结合于另一个分子上。例如，免疫反应性特异结合元件可包括抗原、半抗原、配合体、抗体(初级的或二级的)和它们的腐恶货物，包括那些由重组DNA方法或合成肽方法形成的物质。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，重组蛋白或它们的混和物或片断，或抗体于其他特异性结合元件的混和物。准备这样的抗体的细节及它们作为特异性结合元件使用的合适性在此公开。其他普通特异性结合配对包括但不限于，生物素和抗生物素蛋白(或其衍生物)，生物素和链锁状球菌抗生物蛋白，糖类和血凝素，补充的核苷酸序列(包括探针和在检测目标核酸序列的DNA杂交测定中使用的捕获核酸序列)，补充的肽序列，包括那些由重组方法形成的肽序列，效应分子和受体分子，激素和激素结合蛋白，酶辅因子和酶，酶抑制物和酶，等等。而且，特异性结合配对包括与原始特异性元件相似的元件。例如，被分析物的衍生物或片断，例如，被分析物类似物，都可被应用，只要它含有至少一个与被分析物相同的表位。
例如，在一实施方式中，含有检测样品的流体被运送到金标垫，在金标垫处分析物和被一种特殊结合元件修饰过的检测探针混合以形成分析物复合物。因为金标垫与多孔渗水膜之间流动畅通，所以，所述复合物可以从金标垫出转移至多孔渗水膜上的检测区。或者，可以通过整合不同抗原(如，不同流感病毒或来自不同流感病毒的病毒抗原)的特异抗体来利用多个检测区域。所述检测区域可含有固定剂，所述固定剂一般可以和分析物和/或分析物复合物(如，分析物和检测探针的复合物)形成化学或物力连接。在某些实施方式中，所述试剂可以是一种生物试剂，如本文公开的抗体。其他生物试剂已为本领域的技术人员所熟知，它们包括但不限于，抗原、半抗原、抗体、蛋白质A或G、抗生物素蛋白、链霉抗生素蛋白或它们的复合物。在某些情况，人们希望这些生物试剂具有和分析物和/或分析物与检测探针的复合物结合的能力。
这些试剂用于检测探针/分析物复合物的固定结合位点。在某些情况下，分析物，如抗体、抗原等，含有两个结合位点。一旦到达检测区，其中的一个结合位点被复合探针的特异结合元件占据。但是，分析物的未被占据的位点可以和固定剂结合。一旦和固定剂结合，复合探针就形成一种新的三重夹心式复合物。
检测或测试区一般可以提供任意数量的不同检测区域，以便使用者可以更好地决定待测样品中特定分析物的存在与否。每个区域都含有相同的试剂或含有固定多种分析物的不同试剂。例如，检测区可能包括两个或更多的不同检测区域(如，线状、点状等)。检测区域可能被处理成线状的形式，其方向与待测样品流动通过分析装置的方向实质上垂直。同样，在某些实施方式中，检测区域可能被处理成线状的形式，其方向与待检测样品流动通过分析装置的方向实质上平行。
在某些情况下，所述膜也可以确定一个对照区(未示)，它可用来给使用者一个分析正常进行的信号。例如，所述对照区(未示)可以含有一种固定剂，所述固定剂一般具有和探针或固定在探针上的试剂化学和/物理结合的能力。这种试剂包括但不限于，例如，抗原、半抗原、抗体、蛋白质A或G、抗生物素蛋白、链霉抗生素蛋白、二级抗体或它们的复合物。另外，也可能希望使用各种不同的非生物材料作为对照区试剂。例如，在某些实施方式中，所述对照区试剂可能包括一种聚合电解质，如上所述的，可能结合到未被固定的探针上。因为所述对照区的试剂只对探针是特异性的，无论分析物是否存在都会有信号形成。所述对照区可以被放置在沿着膜的任何位置，但优选位于检测区的上游。
使用这种分析装置检测某种分析物是否存在可以使用各种不同的形式。例如，在上述实施方式中，利用了一种夹心式的方式。其他利用此夹心式测定的例子参见Grubb等人的美国专利第4,168,146号，以及Tom的美国专利第4,366,241号，这些文献在此被完全饮引用。另外，也可使用其他方式，如竞争式。在竞争式分析中，标记探针通常和一个与分析物相同或相似的分子配对。所以，标记探针就和待测分析物竞争可以利用的试剂。在检测分析物如半抗原时通常用竞争式测定，每个单价半抗原只可结合一个抗体分子。竞争式免疫测定的例子参见Deutsch等人美国专利第4,235,601号，Liotta的第4,442,204号及Buechler的第5,208,535号专利，在此这些文献被完全引用。其他形式的设备参见Lambofte等人的第5,395,754号专利、Jou等人的第5,670,381号专利及Malick等人的第6,194,220号专利。这些专利文献在此被完全引用。
微流控制装置
在本发明的某些方面，本文所公开的抗体可被整合到一个微流控器件中。此设备是一个微流体流动系统，可以结合一个或更多分析物。结合上的分析物可直接在设备上分析或从设备上分离下来，例如作更进一步的分析或处理。可选择的，未结合到设备上的分析物可被收集起来，例如，作进一步的处理或分析。
示范性的设备是一种带有可供样品流通的平板通道的流动式仪器。此类设备参见美国专利第5,837,115号。样品可以通过重力、毛细管或一种主动力被转移到此设备中，如通过输液泵将一种样品如血液灌输到微流控器件中。其他已知输送方法也可以使用。微流控器件可任意地依靠设备中的一排结构体来固定分析物。所述结构体可通过多种方法制造，包括但不限于，激光照射、压纹、x光微影(LIGA)、电镀、电铸、影印石版术、活性离子蚀刻、离子束处理法、压缩模塑法、铸造、动力喷射造型法、喷射造型法、显微机械加工材料。需了解的是，制造本发明设备所使用的方法不是关键的，只要所用方法导致大量的同样的结构体和设备。而且，这种方法必须导致所述结构体的大表面积且相互排列紧密以产生一个狭窄的通道。所述通道允许分析物在液体中分散以提高在固定位点固定分析物和/或标记试剂的效率。
所述大批量生产的结构体优选由任意数量的聚合材料制成。这些材料包括，但不限于，聚烯烃类如聚丙烯、聚乙稀，聚酯如聚乙稀对苯二酸酯，含聚合物的苯乙烯如聚苯乙烯、苯乙烯丙烯腈、丙烯腈丁二烯乙烯苯均聚物，聚碳酸酯，丙烯酸聚合物如聚甲基丙烯酸甲酯和聚丙烯酸腈，含聚合物的氯化物如乙稀聚合物的氯化物和聚偏二氯乙烯，乙缩醛同质聚合物和共聚物，纤维素及其酯类，纤维素硝酸盐，含聚合物的氟化物如聚偏二氟乙烯，聚四氟乙烯，聚酰胺，酰亚胺，聚醚醚酮，含聚合物的硫化物如聚亚苯基硫化物和聚醚硫化物，聚亚安酯，含聚合物的硅化物如聚二烷基硅氧烷。另外，所述结构体可由共聚物、上述材料的混合物和/或碾压物、金属箔如铝箔、金属处理的膜或沉积在上述材料的金属制成，也可由玻璃或陶瓷材料制成。在其中的一种方法中，一种激光如受激准分子激光器可被用来照射光掩膜，以便从光掩膜穿过的光融化底层材料以在材料基层形成通道(Sercel，J.，et al.，SPIE Proceedings，Vol.998，September，1988)。
通常，微流控器件可包括一个供待测样品进入的入口。通常所述通道为毛细管，用来转移所述待测样品从进口到设备中，还包括一排结构体用来提供固定位点，以及一个通口，如排放气体的出口。另外，定制此设备时还可以增加反应槽(chambers)和额外的毛细管。通常，待测样品依靠毛细管作用力移动通过设备。另外，可以使用一个或多个毛细管带动待测样品从进口到通道中。此外，可以使用一个或多个毛细管脱离设备的结构体面积(structures area)。但是，也可使用不同压力驱动液体在设备中流动，以此来代替或增加毛细管动力。
可供液体流动的通道由相邻结构体之间产生。通道和结构体设计对于优化结构体表面和流体分子的接触是重要的。代表性地，通道的深度约从1μm到1mm。通道的平均宽度一般约从0.02μm到20μm。通道可以包括各种形状的结构体，包括菱形、六边形、环形或方形，其高度一般约从1mu.m到1mm，平均宽度约从1μm到1mm。
固定剂可以像在毛细管和/或反应槽里一样共价地或非共价地结合到结构体的表面。所述试剂可以是限时释放试剂，空间隔离试剂，或被包被和干燥于表面。放置固定剂到所述表面的技术已为本领域的技术人员所熟知。在一个实施方式中，所述固定剂是本文所公开的以流感病毒抗原(如H5 AIV)为靶标的抗体。
使用本发明设备的方法包括利用特异性结合元件。检测的方法包括与有色标记物入荧光染色剂获有色颗粒的结合。可选择地，检测步骤可包括与一种可产生有色产物的酶的结合。
本发明的设备中可以使用一个或多个代替的流动途径。毛细管从进口运输待测样品后分支成不同的通路通向结构体的主要通路和代替通路。代替通路可以允许多个固定位点的存在，且允许在单个测试位点上同时实现分析物的存在与否或多个分析物的数量。在一个优选实施方式中，在检测设备中多个分析物(不同流感亚型)被确定。
替代通路可包括混合所述试剂盒待测样品的区域。例如，反应槽可作为添加试剂的区域。另外，此设备通道中也可包括诱捕设备(trapping device)用以清除一定尺寸以上的流体成分。例如，在本发明的设备中可包括一个分离器，例如从全血中分离出血浆或血清。例如，一种疏水烧结多孔渗水材料的粘合物质(matrix)可使一种血红细胞粘合剂应用到其表面上。所述粘合物质可被放置在设备中所述结构体的前面。全血样品中的血红细胞陷入到所述粘合物质的空隙中，而实质性的血细胞自由的血浆和血清穿过所述粘合物质，并被毛细管作用力输送到设备中的结构体上。此处全盘引用美国专利第4933092号。
自动化
本发明的抗体很容易适应自动化免疫化学分析仪。为方便本发明方法的自动化，以及减少转变时间，本发明的免疫测定中的一个固定抗体需和磁性颗粒结合。
通过可获得的商业方法将抗体与这样的磁性珠结合，如Dynal公司[LakeSuccess，N.Y.(USA)]的M-280羊抗兔IgG包被的Dynabeads和目标蛋白的兔抗体，或使用Dynal公司的M-450 Tosylactivated Dynabeads，公家结合上一个相关抗体。可选择地，试剂如戊二醛可用来使目标抗体共价结合到一个固体支持物上，优选磁性珠。代表性的结合试剂可包括有机化合物如硫脂，碳化二酰亚胺，琥珀酰亚胺酯，二异氰酸酯，戊二醛，重氮苯，六亚甲基二胺。
优选的自动化的/免疫分析系统是ACS180.RTM.自动化学发光系统[美国纽约塔里敦和马萨诸塞州马菲尔德拜耳公司；包括ACS:180 PLUS系统；ACS:180 SE系统和ACSCENTAUR.RTM.系统]。ACS:180.RTM.自动免疫测定系统参见文献Dudley，B.S.，J.Clin.immunoassay，14(2)77(Summer 1991)。此系统利用化学发光标记物作为示踪剂以及顺磁性颗粒(PMP)作为固相试剂。ACS:180系统提供竞争式结合和夹心式结合两种测定方式，其中每个步骤都是自动化的。ACS:180系统使用微米级顺磁性颗粒以使可用的表面积最大化，而且提供一种不需离心就可从未结合的示踪剂中快速磁分离已结合的示踪剂的方法。试剂可被同时加入或稍后加入。其他标记物，如酶标物，也可代替如吖啶酯等化学发光标记物使用。优选用光度计检测发光信号。优选使用拜耳公司的免疫1.TM.免疫测定系统。其他可适应使用本发明的抗体的运行免疫测定法的示范性自动化设备包括美国专利第5,807,522号和第6,907,722号。
在另一个实施方式中，本发明的抗流感抗体可被整合到自动多孔板以便使用免疫测定方法。多孔分析模具(如平板)可适应于在多孔分析模具的一个或多个孔或反应槽(如，多孔分析板的孔)内的诱导的基于化学发光的测定。多孔分析板可包括几个元件，包括例如，平板顶部，平板底部，孔，工作电极，计算电极，参考电极，绝缘材料，电连接的接触面，电连接所述电极和接触面的传导通孔，粘合剂，分析试剂，识别标记或记号。平板上的孔可以是平板顶部的开口，开口的内壁可以是孔壁。平板底部可与顶部粘合在一起(可以直接粘合或借助其他成分粘合)作为孔的底部。
所述多孔分析模具(如平板)可含有任意数量、任意形状或尺寸、以任意形状或构象排列及有多种不同材料组成的孔和/或反应槽。在本发明的一个优选实时方式中，所述多孔分析板为利用工业标准生产的多孔板，具有标准形式的平板和孔的数量、大小、形状和构象。标准式样实例包括96-，384-，1536-和9600-孔板，所述孔以二维排列。其他式样包括单孔，双孔，6-孔和24-孔和6144-孔板。优选地，所述孔和/或反应槽至少有一个整合在其中的第一电极，更优选地，包括至少一个第二电极。根据优选的实时方式，所述孔和/或反应槽至少含有一个整合在其中的工作电极，更优选地也包括至少一个计算电极。根据一个特别优选的实施方式，工作电极、计算电极，和任选地，参考电极都被整合到孔和/或反应槽中。所述分析平板优选平坦的，但也可以是弯曲的(不平坦的)。
而且，孔中、反应槽中和/或分析模具的分析区域中(例如，在多孔分析板的孔中)可包含一种或多种分析试剂。例如，在微滴板的不同区域可使用含有不同流感病毒抗体或一种流感病毒多肽的不同表型抗体的分析试剂。这些分析试剂可以被固定或被放置在一个或多个孔和/或反应槽的表面(优选在电极的表面，最优选在工作电极的表面)，并且可被固定于或被放置在一个或多个分析区域中(例如，以一定式样排列的试剂被固定于或被放置在一个或多个孔和/或反应槽的表面，优选在工作电极和/或计算电极的表面，最优选在工作电极的表面)。所述分析试剂也可通过所述孔和/或反应槽的轮廓而被包含或定位在其内。例如，一定式样的绝缘材料可限定或定位流体。
在一实施方式中，本发明的仪器可被用于促使并测量在分析模具中的发光，优选的是多孔分析板。可以整合在一起的有，例如，一个或多个光子侦测器；不透光外壳；用于接触分析模具的电连接器；传送多孔分析模具进出仪器的机械装置(更具体地，是进出不透光外壳的机械装置)；联合并定位多孔分析模具和光子侦测器以及电连接器的机械装置。观察和辨别模具的装置(如，一个或多个条形码扫描器(如，一个条形码扫描器扫描平板或模具的一侧，另一个扫描平板或模具的另一侧))；方位传感器；使与模具有电连接器的机械设备，一个或多个引导在模具中发光的电源；和合适的电子装置和软件。
所述仪器也可包括储存、堆放、移动和/或分布一个或多个分析模具的机械设备(如，多孔板栈式存储器)。所述仪器可以方便地使用光子侦测器阵列(例如，光电二极管阵列)或成像光子侦测器阵列(例如，CCD照相机)以测量发光。这些探测器允许这些仪器测量从多孔(和/或反应槽)中发出的光，同时也/或使从单个孔(和/或反应槽)中发出的光的强度和空间分布成像。
优选地，所述仪器可以测量从分析模具的一个或多个区发出的光，优选的分析模具为多孔分析板。在某些实施方式中，一个区包括一群孔(和/或反应槽)，数量从一个到少于分析模具总孔(和/或反应槽)数(例如，一个多孔板中孔的一行，一列或二维子阵)。在一个优选的实施方式中，一个区包括多孔板孔数的4％-50％的孔。在一个特别优选的实施方式中，多孔分析板被分成柱状部面(例如，一个区有一行或一列孔)或方形部面(例如，一个标准尺寸的多孔板杯分成六个等尺寸的方形部面)。在某些实施方式中，一个区包括一个或多个孔并在孔中有不止一个的流体容纳区域。所述仪器，优选地，可以在一个给定的模具(优选平板)中逐步诱导ECL并/或逐步测量从所述区中而来的ECL。
所述仪器也可整合微处理器和电脑来控制器具中的某些功能，以及帮助存储，分析和显示数据。这些微处理器和电脑可位于仪器之内，或位于远处而和仪器相连(例如通过网络连接)。
膜/表面
在本发明的诸多方面，整合了流感病毒抗原或抗流感病毒抗体的设备包括一个表面或膜。多种表面或膜可以为各种普通免疫测定设备提供一个表面，在其上抗体或抗原被固定或被处理。这样，膜可以提供包括检测区域和使用免疫试剂使检测结果(例如，无论样品含一中或多种病毒)可视化的对照区域。在多种实施方式中，含有流感病毒抗原或在其上处理有抗流感病毒抗体的膜被依次处理到固体支持物上(例如侧向流动或纤维素试纸装置)。
抗原/抗体可以结合到其上的膜或表面由一种材料组成，此材料包括但不限于纤维素、硝化纤维、尼龙、带有一个四价氨基的阳离子尼龙(Zata探针)，被转换成DPT的氨苯基硫醚(aminophenylthioether，APT)试纸，叠氮衍生物(和酶检测标记物使用时不被染色)或亲水聚偏二乙烯氟化物(PVDF)(可由Mass.，Billerica，Millipore得到)。术语“消化纤维”指任何纤维素的硝酸酯。所以合适的材料可包括与纤维素的羧酸酯结合的硝化纤维。硝化纤维膜的孔径可有很大的变化，但通常是约在5-20微米，优选约8-15微米。但是，本领域技术人员可预期其他所熟知材料也可被使用。在某些实施方式中，所述测试区域包括由Millipore生产的被积压到一个光亮的聚酯薄膜背衬的硝化纤维卷制成的硝化纤维网状组件。在另一个实施方式中，此含有抗原/抗体区域(或“测试区域”)由尼龙制成。在另一个实施方式中，所述测试区域包括一种可以固定橡胶或其他可以携带另一个可特异性结合分析物的试剂的颗粒，因此可以确定一个测试区，例如压制的尼龙粉末，或玻璃纤维。在某些实施方式中，所述测试区域包括一种在干燥状态不透明而在潮湿状态透明的材料。
测试和对照区
设备可包括含有测试和对照区的膜或表面，测试区域可由上述材料的任何一种构成。通常测试区和对照区可确定测试区域的成分。在一个实施方式中，所述测试和对照区包括和测试区域相同的材料。通常，术语“测试区域”在此用来解释在设备中/上包括至少一个测试和对照区的区域。在有些实施方式中，设备使用吸水材料而在某些实施方式中，为提供非吸水性的流体，这些材料要被终止液处理以打断造成吸水膜吸水性的作用力。合适的终止液包括牛血清白蛋白，甲基化的牛血清白蛋白，动物的全血清，酪蛋白，脱脂奶粉，大量的清洁剂和聚合物，例如，PEG，PVA及其类似物。在某些实施方式中，在未处理的吸水膜上的干扰位点由于终止液的存在而完全破坏已允许费吸水性流体可以通过。如此处指出的，本发明的测试设备是一个带有多个测试和对照区的设备。
检测区域一般包括一个或多个对照区，这样对于验证样品流动是否是预期的很有用处。每一个对照区都包括一个空间上不同的区域，在此区域里常有一个特异性结合配对的固定元件，该元件可和标记的对照试剂反应。在某个实施方式中，程序上的对照区包括一个待测分析物的可靠样品，或样品的一个片断。在这个实施例中，使用了一种标记试剂，所述的液态样本携带标记试剂到达测试和对照区；没有被结合到被分析物上的标记试剂就将结合到定位在对照区的待测被分析物的可靠样品上。在另一个实施例中，对照线含有抗体，该抗体对标记试剂是特异性的或者为了固定的标记试剂而提供的。在操作中，标记试剂被限制在每一个单个的或多个的对照区，即使在待测样本中任何一个或者所有感兴趣的分析物都不存在。
在某些实施方式中，固体支持物包括一定式样的区域，所述区域包括抗原/抗体结合粘合物质领域，此领域可被设计成任何想要的形状(例如，方形，椭圆形，圆形，垂线或水平线)。例如，抗原结合粘合物质(matrix)领域被处理到一个固体支持纤维素试纸上，所述纤维素试纸可由塑料或聚酯薄膜材料制成。通过使用本发明，通过整合每个在单个测试带或单个固相支持物纤维素试纸的不同位置上含有不同特异性抗原的多个方形粘合物质，有可能在一个单独的测试中测定到多个抗H5 AIV抗体亚型。
在各种实施方式中，含有本发明的抗体并应用在免疫分析中的装置可被包括在一个试剂盒中。为了特殊的形式的免疫分析应用，该试剂盒包括了必要的反应试剂。该试剂盒包括一个纤维素试纸和单独的随其应用的试剂，其上固定了分析流感多种亚型所需的抗体的横向流动设备，或者任何带有必要试剂的常规装置。例如，通过一个纤维素试纸频繁的浸沾一系列的在试剂盒中提供的试剂的过程，在样本中有或没有特定的抗-亚型流感病毒(例如，H5 AIV抗体)或者流感病毒抗原(例如，H5抗原)可以被简单快速地确定。该试剂盒适合专家或业内人员使用。利用本发明的试剂盒可以快速进行从体液获得的流感病毒(例如，AIV)的血清诊断，体液可以是血液、尿液、唾液、精液、粪便，唾液、胆汁、脑脊液，鼻涕、泌尿生殖器的液体、鼻呼气，脊髓液，等等。
在另一实施方式中，固相的支持纤维素试纸或者横向流动装置安置在一个测试试管或者类似的容器中，该测试管或者类似容器添加了被怀疑感染了流感病毒(例如，AIV)的病人或者动物样本。样本和结合在纤维素试纸中的抗原/抗体反应。然后取出纤维素试纸并轻轻地清洗。固相支持纤维素试纸被从清洗液中取出并被放入另一个试管中，该试管含有高度稀释的，经亲和分离纯化的免疫球蛋白，该免疫球蛋白对从其中获得样本的物种是特异性的，并可和碱性磷酸酶或者其他适宜的酶结合。接着纤维素试纸从第二抗体溶液取出并放入一个带有清洗液的容器中。一旦纤维素试纸从清洗液中取出就被放入带有显色剂或者其他合适的底物溶液的最终的试管中。阳性反应可以通过简单的观测对照标准(上面的线)和阳性线(下面的线)的比较而评定出来。如果阳性线颜色比标准线深，那么检测结果就是阳性。共价连接到经亲和纯化的免疫球蛋白的酶和底物反应，所述底物在酶-底物反应的结束时产生一个有色反应产物。通过这种方式连接的密切相关的纯化的免疫球蛋白就可以很容易的检测出来，该检测显示在样品中存在对流感病毒(如，H5抗体)特异性的抗体。这个技术整合了已知的ELISA技术，在此处也有揭露。
应到理解的是，选择合适的酶和底物和合适的反应条件的技术已为本领域的技术人员所熟知。这些酶在和免疫球蛋白结合后要仍然有活性。每个酶-底物配对的化学反应都要得到一个有颜色的产物。另外，有多种可选择的配对方式，其中酶和底物都可以和经亲和纯化的免疫球蛋白结合，但是只有在纯化的免疫球蛋白已经连接到样本抗体之后，酶和底物的反应才能产生有颜色的反应产物。
当然，通过使用不同的抗体/抗原，样本可以很容易的筛选出一组不同的病毒和不同的亚型。本领域的技术人员应当明白，通过这里描述的免疫测定法需分析不同的组。参见CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY(Coligan，John E.et.al.，eds.1999)。
阵列
本发明的抗体可以很容易的被应用在设备中，用该设备检测分析物的方法是一种快速检测方法，该方法包括检测样本中的一个或多个流感病毒蛋白(例如，H5)或者一个或多个的抗-流感病毒抗体。这种方法包括抗体以含其他抗体的阵列的形式展示的实施方式，所述其他抗体其以多种不同的病毒如其他的流感病毒亚型(如，AIV)为靶标。在其他的实施方式中，抗体可以以相同的抗原为目标或者特异性的和一个既定的多肽上的不同的抗原决定基结合。
在本发明进一步的实施方式中，抗体的阵列包括底物，大量的离散排列的小片段(patch)，在底物表面部分的已知区域上，其中(i)每一个片段包括固定在底物上的抗体，其中所述既定片段中抗体可结合特定的病毒表达产物、产物的片断，或者宿主蛋白，例如抗病毒抗体，和(ii)阵列包括很多不同的抗体，每一个抗体都可以结合不同的病毒表达产物、病毒产物片断，或者宿主蛋白，如抗病毒抗体。
优选地，抗体共价地固定在阵列的片断上，可以直接固定也可以间接固定。在多数情况下，阵列至少包括10个片断。在一个优选的实施例中，阵列至少包括50个片段。在一个特别优选实施例中，阵列包括至少100个片段。在一个选择性的优选实施例中，抗体阵列可以包括超过103，104，或者105个片段。
被每一个片段覆盖的底物表面区域优选不超过0.25mm2。优选地，每个片段覆盖的底物表面区域在大约1μm2到1000μm2。在一个特别优选实施例中，每个片段覆盖的底物表面区域在大约1μm2到2500μm2。在一个可选择的实施例中，在阵列上的一个片段可覆盖底物表面的面积有2500nm2这么小，虽然如此小的片段在阵列的应用当中一般是没有必要的。
阵列中的片段可以是任何几何形状。例如，片段可以是矩形的，圆形的。阵列中的片段也可以是不规则的形状。片段也可以随意的从下层底物中间布局(median plan)开始增加。
隔开阵列上的片段的距离可以是不同的。优选地，阵列上的片段间相邻之间的距离大约1μm到500μm。典型地，如果片段的直径大于10μm，隔开阵列上片段的距离约与片段的直径或侧面长度成比例。如果片段比较小，这时隔开片段的距离一般都比片段本身的直径要大。
在阵列的一特别实施方式中，阵列的所有片段都被包含在底物表面上大约1cm2或更小的区域。因此在一个优选的阵列的实施例中，阵列在底物表面上总面积大约1cm2或更小的区域内包括了100个或更多片段。可选择地，一个特别优选的阵列在底物表面上总面积大约1cm2或更小的区域内包括了103个或更多的片段。优选的阵列在底物表面上总面积大约1cm2或更小的区域内，甚至可以随意包括104或者105或者更多的片段。在本发明的其他实施例中，所有的阵列的片段都包含在底物的表面上面积大约为1mm2或更小的区域内。
代表性地，在阵列的一个片段上只有一个抗体。如果在一个片段上不止一个的抗体，那么在那个片段上的所有的抗体必须共用一个普通的结合伙伴。例如，一个片段可包括很多种流感病毒蛋白的抗体(虽然，抗体潜在地可以结合既定流感病毒上的不同抗原决定基)。在优选实施例中，所述流感病毒蛋白/抗原是H5且流感病毒是AIV。
本发明中的阵列可以含有日呢以数量的不同的抗体。典型地，所述阵列包括至少10种不同的抗体。优选地，所述阵列包括至少50种不同抗体。更优选地，所述阵列包括至少100种抗体。可选择的优选阵列包括超过103种不同抗体或者超过104种不同抗体。所述阵列甚至可随意包括超过105种不同抗体。
在阵列的一个实施例中，阵列的每一个片段包括一种不同的抗体。例如，一个阵列包括大约100个片段可以包括大约100个不同的抗体。类似地，一个含约10000个片段的阵列溘包括大约10000种不同抗体。然而，在一个可选择的实施例中，每一个不同的抗体被固定在阵列的多个片段上。例如，每一个不同的抗体可以随意的在2-6个不同的片段中出现。因此，本发明的一个阵列，可包括大约3000抗体片段，但仅包括大约1000种不同的抗体，因为每一个不同的抗体在3个不同的片段中出现。
典型地，可被阵列上的大量不同抗体结合的不同蛋白的数量至少有10个。然而，优选地，在阵列上的大量不同的抗体可以用来结合大量数量的不同蛋白，例如，至少大约50或者至少大约100个。在进一步优选的实施例中，在阵列上大量不同抗体可以结合至少大约103个蛋白。
利用本实施例中的抗体阵列可随意包含在流动反应槽中以每25mm2表面积1-10uL液体体积的形式放置二维阵列。覆盖在流动反应槽中的阵列上的罩壳可以是透明或半透明的。在一个实时方式中，所述罩壳可包括耐热玻璃或石英玻璃。在其他的实施方式中，所述罩壳可能是检测系统的一部分，以监测固定在阵列上的抗体与溶液，如细胞抽提液中蛋白质之间的反应。所述流动反应槽应该保持含有适当的液体溶液以保护抗体。盐度、温度和其他条件优选与正常生理条件保持相似。在流体溶液中的样品可能渗入上述流动反应槽中，它们肯定和固定的抗体反应。需要提供足够的时间以允许抗体及其结合伙伴发生结合。这所需的时间取决于抗体对其结合伙伴的亲和力。流体输送到阵列中不需要专门的微流泵、阀门或混合技术。
检测方法
使用本发明的抗体适用的任何装置中，可获得很多类的检测成分来检测结合伙伴的存在。检测可以是数量上的也可以是质量上的。本发明的阵列可和光学检测方法如可视光或紫外光的吸收、化学发光和荧光(包括有效期、偏振、荧光关联能谱法(FCS)、荧光共振能量转移法(FRET))合用。而且，其他检测模式，如基于光波的，参见PCT公开文本(WO 96/26432和美国专利第5,677,196号)，基于表面胞质团共振分析技术(surfaceplasmon resonance)的，基于表面电荷传感器的，基于表面作用力传感器的都可以和本发明的许多实施方式兼容。可选择地，基于Brewster角度显微镜方法(Brewster Anglemicroscopy)(BAM)的(Schaaf et al.，Langmuir，3:1131-1135(1987))和椭圆光度法(U.S.Pat.Nos.5,141,311 and 5,116,121；Kim，Macromolecules，22:2682-2685(1984))的科技也可被应用。水晶微平衡作用(microbalances)和解吸附过程(参见例如美国专利第5,719,060号)也提供了其他适合本发明阵列某些实施方式的检测方法。参见美国专利第5,313,264号可见一种光学生物传感器系统可与本发明的一些矩阵相兼容，也可与多种未标记的检测方法如表面胞质团共振分析技术、内反射荧光显微镜(TIRF)、Brewster角度显微镜方法、光波发光模式光谱法(OWLS)相兼容。
在某些实施方式中，所述整合了本发明抗体的设备可被整合到一个系统中，所述系统包括阅读器(reader)，特别是设置在电脑中的阅读器，如基于反射和/或荧光的阅读器，以及包括一个使用数据还原(data reduction)和曲线拟合算法的数据处理软件，优选地与被训练的神经网络(trained neural network)连用以准确地确定在生物样品中分析物的存在与否及其浓度。如这里所使用的阅读器是指一种检测和/或定量数据的工具，如在包括在使用本发明抗体的测试设备中测试带(test strips)上。数据应是裸眼可视的，但不需要如此。所述方法包括在病人样品上执行免疫测定的步骤，使用基于反射和/或荧光的阅读器读取数据的步骤，使用利用数据还原的数据处理软件来处理所得数据。优选的软件包括曲线拟合算法，可任意地与被训练的神经网络连用，以确定在待测样品中被分析物的存在与否及其浓度。从阅读器中获得的数据可以被进一步地通过医学诊断系统处理输出数据以提供风险评估或医学条件的诊断。在可择实施方式中，所述输出数据可被用于输入到后续的结论支持系统，如神经网络，它可被训练以评估这些数据。
在多各种实施方式中，所述阅读器可以是反射阅读器，发射阅读器，荧光阅读器，化学生物发光阅读器，磁力阅读器或电流测定阅读器(或两个或更多的结合)，这取决于要从设备中检测的信号。而且，某些检测方法一般用于传统的免疫测定法，该法需要使用标记物，这些检测方法可应用到本发明的阵列中。这些技术包括非竞争式免疫测定法，竞争式免疫测定法，双标记物法，比值免疫测定法。这些特定的技术主要适用在当带有不同特异性的不同抗体的数目很小(约小于100)时和抗体阵列一起使用的时候。在所述竞争式方法中，结合位点的占据是间接确定的。在这种方法中，阵列的抗体被暴露在标记的显影试剂中，所述显影试剂通常是带有标记的分析物或其类似物。所述显影试剂与分析物竞争结合在抗体上的位点。显影试剂结合到单个片断的抗体上可形成在不同片断上抗体的少量占据。
在非竞争式方法中，结合位点的占据是直接确定的。在这种方法中，所述列阵的片断暴露于标记的显影液中，所述显影液可以结合到被结合的分析物上或在蛋白固定试剂中的以被占据的结合位点上。例如，所述显影液可以是与被占据位点直接对应的被标记的抗体(例如，“夹心式分析”)。可选择地，双标记法，当所述抗体被一种标记物标记，显影液背另一个标记物标记时采用比值法(Ekins，et al.，Clinica Chimica Acta.，194:91-114，1990)。在前述的技术中可以使用很多不同的标记方法，包括放射性同位素法、酶法、化学发光法和荧光法。在某些实施方式中，优选荧光检测法。检测的方法包括但不限于，颜色的改变、光吸收或光传输的改变，PH的改变，传导性的改变，荧光性的改变，物理相的变化或类似方法。
待测样品应提供检测系统的可检测成分或者这种成分可被加入。所述成分的差异很大，这取决于检测系统的性质。其中一种检测方法包括使用颗粒，颗粒被用于提供散光或改变流动速度。所述颗粒可以是，但不限于，细胞、不能融合于液体系统的多聚颗粒、橡胶颗粒、陶瓷颗粒、核酸颗粒、粘合颗粒或其类似物。颗粒的选择取决于检测方法、在流体变化时分散的分布情况和稳定性，活跃性，参与度等诸如此类。在固定位点分析物与特异性结合元件结合可通过检测设备中待测样品的压力来随意检测。例如，与待测样品连接的压力检测器进入或退出通道时将能检测到压力降低，所述压力降低是由于分析物的结合，它会导致通道内流速放缓。
例如，为确定已存在的可检测的标记物(例如，抗体结合)的量，及抗原存在的量，可以使用Hazelgrove等人的方法和仪器(参见Anal.Biochem 150:449-456，1985)。这种方法是基于与电脑连接的电视摄影机。所述标记通过电视摄影机成像而显示在一个发光盒子上，且被一种数字化平板(Techmar公司)数字化。数字化后，电脑会读取出每个标记的位置、宽度、高度和相对面积。光密度测量也用于测定蛋白质的绝对浓度。
在另一实施方式中，将包括Dot-ELISA测试的装置用于检测直接来自任何样品的目标蛋白。因而，本发明的抗体可以用于包括下列步骤的方法中 (a)提供一固相支持物，以便进行单抗的测定； (b)将怀疑带有流感病毒的样品施加到该固相支持物上； (c)将含有有机酸如柠檬酸或乳酸的溶液施加到固相支持物上； (d)将含有溶粘液剂(mucolytic agent)和去污剂的溶液施加到该固相支持物上； (e)将该固相支持物与初级单抗(primary Mab)、嵌合单抗、其变体或片段接触足够的时间，使得初级单抗、嵌合单抗、其变体或片段和H5 AIV蛋白结合在一起，形成结合抗原的初级单抗； (f)将上述与酶标记的抗-单抗缀合物(conjugate)接触足够的时间，使得该结合抗原的初级单抗便于结合到该缀合物上；以及 (g)将显色试剂施加到该固相支持物上，其中，该显色试剂被酶催化而形成带色的标志，从而使得能够目视检测样品中是否存在H5 AIV蛋白。
美国专利申请2006/0246429中公开了一种Dot-ELISA方法，此处将其整体作为对比文献。
在某些实施方式中，本发明的装置或试剂盒可以用于护理(care setting)领域，其中，可以利用显色检测系统如采用碱性磷酸酶的系统。例如，分离出若干小瓶，其含有在缓冲液、NBT或5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)中的链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物，并将其设计成可依次达到所期望的色彩，从而使其可作为试剂盒的组分。利用显色检测系统，其结果可以用肉眼观察而不需要任何设备的帮助。在一实施方式中，检测装置可以利用碱性磷酸酶定量确定存在的AIV量。当与光密度计一起使用时，这种包含碱性磷酸酶的装置可以给出准确的定量结果。
在一实施方式中，检测H5 AIV蛋白或抗H5亚型AIV抗体的试剂盒可以包括检测标记物如结合在其上的链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物；含NBT或5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)的试剂；以及参比标准。
在本申请描述的任一实施方式中，测试样品可能是来自但不限于生理来源。可以用于本发明装置的测试样品包括怀疑带有抗原或抗体的样品，这些样品可以是来自非人类的动物体或者人体；可以用于本发明装置的测试样品包括但不限于生理体液如血液、血清、血浆、唾液、眼睛分泌物、脑脊液、脓、渗出液、乳汁、汗液、眼泪、耳流出物、痰、淋巴液、尿液、粪便、口鼻分泌物；组织如肺、脾和肾；鸡胚培养中的全病毒或裂解病毒的液；以及其它怀疑含有流感病毒蛋白或抗流感病毒抗体的样品，只有其是可溶的或可悬浮于适当的流体中。测试样品可以经过预先处理，如萃取、添加、分离、稀释、浓缩、过滤、蒸馏、透析等等。除了生理液之外，也可以使用其它的液体测试样品，而且感兴趣的成分既可以是液体，也可以是固体，只要该固体能被溶解或可以悬浮于一液体介质中即可。在一实施方式中，样品取自鼻腔。本发明的装置通常带有可以附着一种或多种抗原或抗体的表面。
治疗方法和药物组合物
本发明提供了一种预防和治疗禽流感病毒相关病毒感染患者的方法，包括对患者干预一定量的包含了一种或多种本发明所述单抗的有药物活性的药物成分。本发明还提供了一种含有本发明所述的一种或多种单抗的药物成分或在此基础上得到的盐类药物。
本发明所述药物成分的干预方式可以是传统的干预途径，包括口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径，但不仅局限于此。
适合肠胃外途径注射的药物成分可能含有符合药物制备要求的无菌水或非水溶液、气雾剂、悬浮液或乳剂，可在临用时重悬成可注射的溶液或气雾剂的无菌粉剂。如适合的水性和非水性载体，工具和各种稀释液如水、乙醇、多羟基化合物(如丙烯乙二醇、聚乙烯二醇、丙三醇及其类似物)，合适的混合物，菜油(如橄榄油)，和可用于注射的有机脂，如乙烷油酸。如使用卵磷脂衣壳维持药物的合适流动性。如使用气雾剂、表面活性剂以维持合适的颗粒尺寸。
本发明所述的药物组合物还可含有一些起保护性、保湿、乳化和气雾化的佐剂，也可以含有预防微生物污染的速溶成分，如各种抗细菌试剂、抗真菌试剂，如parabens，chlorobutanol，苯酚，山梨酸及类似物。也可以包括维持渗透压的试剂，如糖、NaCI及其类似物。可使用延长吸附的试剂来延长注射用药物成分吸附时间，如单硬脂酸盐和凝胶等。
口服固相剂型包括胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等。这些固相剂型中的活性成分至少混有一种传统的惰性药物赋形剂(或载体)如柠檬酸钠、磷酸钙，或(a)填充剂或添加剂如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(b)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；(C)湿润剂，如甘油；(d)碎裂剂，如琼脂，碳酸钙，马铃薯粉或木薯粉；(e)缓凝剂，如石蜡；(f)促吸收剂，如四氨基混合物；(g)保湿剂，如十六烷基醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，如高岭土和斑脱土；(i)润滑剂，如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，硫酸十二烷醇钠，或其上述物质的混合物。在片剂和胶囊剂型中，可能还含有缓冲剂。
固相剂型可以通过做成改良释放或脉冲释放剂型，是在上述提到的各种直接释放赋形剂中添加一些能改变药物释放速率的赋形剂而形成，可以包含在剂型中也可以做成外衣的形式。速率释放改造剂包括羧丙基甲基纤维素，甲基纤维素，碳甲基纤维素钠，纤维素乙烷，醋酸纤维素，聚乙烯氧化物，黄原胶糖，异丙烯酸氨共聚物，氢化调味油，巴西棕榈蜡，石蜡，邻苯二酸醋酸纤维素，邻苯二甲酸羧丙基甲基纤维素，甲基丙烯酸共聚物或上述物质的混合物。改良释放和脉冲释放剂型可能含有一种或一组具有改良释放速率的赋形剂。
本发明所述药物成分还可由快速的雾化剂或消溶剂(FDDFs)组成，包含如下成分天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，磺胺钾，柠檬酸，croscarmellose sodium，crospovidone，抗坏血酸，乙烷基丙烯酸盐，乙烷基纤维素，明胶，氢氧基丙基甲基纤维素，硬脂酸镁，甘露醇，甲基乙丁烯酸盐，调味薄荷，聚乙二醇，气化硅胶，二氧化硅，乙醇酸淀粉钠，硬脂酸延胡索酸钠，山梨醇，木糖醇。这里用于描述FDDFs的“雾化和消溶”一词，依赖于所用药物的溶解性，如药物是不可溶的，可制成快速的雾化剂型，如药物是可溶的，则可制成快速的溶剂型。
类似形式的固相成分也使用诸如乳糖或牛奶糖或其它高分子量的聚乙二醇及类似的赋形剂制成软明胶或硬明胶的填充剂型。
诸如片剂、糖衣剂、胶囊剂和颗粒剂等之类的固体剂型可以通过诸如肠衣或其它本领域普通人员均知晓的外包衣壳的方式制成。也可以是含有乳浊剂、也可以是含有能起缓慢、延迟、控制活性药物释放的类似的成分。也可以使用多聚物和石蜡等成分进行包埋。如果合适，也可用上述一种或多种赋形剂把活性成分制成微囊的形式的剂型。
用于口服的液体剂型，包括符合药物要求的乳状剂、溶液、悬浮液、糖浆和西也剂等。除了活性成分，液体剂型也可含有本领域常用的一些惰性溶液，如水或其它溶剂，可溶性试剂和乳化剂，如乙烷基醇，异丙基醇，乙烷基碳酸盐，苯基安息香酸盐，丙稀乙二醇，1，3-丁烯乙二醇，油，特别是，棉籽油，落花生油，玉米油，橄榄油，调味油和芝麻油，甘油，氢糠基醇，聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，以及上述物质的混合物或类似的物质。
除了这些惰性稀释液，药物成分也可包括保湿剂、乳化剂、悬浮剂、糖化剂、调味剂和香味剂等佐剂。另外，药物成分还可包括乙氧基化均聚乙醇，聚氧乙烯烷基山梨醇和山梨聚糖脂，微晶纤维素，间氢氧化铝，膨润土，琼脂聚合物和黄芪胶，或这些物质的混合物之类的悬浮剂。
本发明所述药物成分也制成适合兽用治疗的混合物，或符合兽用的盐类，或符合兽用的溶剂或初成药，并根据普通兽医和兽医从业者的要求制成一种最适合某种特定动物的给药剂量和途径药物的合适剂型。
本发明所述一个或多个单抗可以结合其它抗病毒试剂用于预防和或治疗H5禽流感病毒感染相关疾病。单抗可以和这些抗病毒试剂同时、分开或连续给药。其它抗病毒试剂包括利巴韦林，金刚烷，羧基脲，IL-2，IL-12和五羧链胞酸，但不仅限于这些。
多肽筛选方法和抗体识别的多肽及疫苗
本发明提供了一种筛选本发明所述单抗识别的模拟表位多肽的检测方法。而且，本发明也提供了本发明所述单抗识别的表位模拟多肽。一方面，本发明公布的短肽含有氨基酸序列SEQ ID Nos64-68、70-73、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94和96。这些多肽能够结合本发明所述单抗。因此，这些多肽拥有和H5血凝素相同的抗原特异性。这些多肽也可用于制备H5亚型禽流感疫苗，也可以用于诊断抗H5血凝素抗体的存在。
另一方面，本发明所述的筛选方法包括如下步骤(i)在特定条件下培养一个适合多肽表达的多肽展示文库；(ii)把培养溶液和本发明的单抗混合；(iii)筛选特异性结合上述单抗的噬菌体克隆。用于筛选的单克隆抗体不仅限于单抗8H5，3C8，10F7，4D1，2F2和/或3G4。本申请实施例11-13中详细描述了一种利用噬菌体展示多肽文库成功筛选结合本发明所述单抗的短肽检测方法。
实施例
下面结合具体实施例与附图，对本发明进一步加以描述，但这些描述并不构成对本发明的限制。
实施例1抗H5亚型禽流感病毒HA基因单克隆抗体的制备
抗原的制备
以病毒株Ck/HK/Yu22/02(H5N1)(简称Yu22)，接种9天龄受精鸡胚，30℃孵育2天后，收集鸡胚液，得到扩增后的Yu22病毒。收集活病毒，在4℃下以0.03％福马林福尔马林灭活，灭活病毒经HA检测，确定灭活病毒液的滴度(注HA滴度测定和HI检测的具体方法参见WHO操作指南，我们选择HA＝1024，该病毒株由香港大学微生物系提供)。
小白鼠
6周龄雌性Balb/c鼠购自厦门大学抗癌中心，并在该中心饲养实验。
杂交瘤的制备
我们使用标准的体内免疫方式和PEG融合方法获得单克隆抗体，详细方法参见Ed Harlow et al.，“Antibodies A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory 1988.简要过程如下
小鼠免疫将上述预处理的病毒液与福氏完全佐剂(CFA)等体积混合乳化，经四肢肌肉多点注射，每只每次注射300ul。首次免疫后第15天和第29天，分别用同样剂量的病毒液加弗氏不完全佐剂(IFA)进行加强免疫。第二加强后采血检测HI的抑制效价，当效价达到1640后，取小鼠脾脏做融合。融合前72小时再次加强免疫，经尾静脉注射病毒液1次，50ul/只。制备10块融合板。
融合取血清HI滴度最高的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，先把脾脏研磨得到脾细胞悬液，然后与细胞数低十倍的处于对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合，经PEG1500作用1分钟将两种细胞融合一起，然后把融合细胞液100ml分装到10块96孔板中培养。融合培养基为含HAT和20％FBS的RPMI1640完全筛选培养基。抗原特异性克隆通过血凝抑制(HI)实验筛选，经3次克隆化后，得到稳定的单克隆抗体细胞株。
杂交瘤的筛选融合后细胞在96孔细胞板上培养10天后，吸取细胞上清做血凝抑制(HI)检测，阳性孔继续克隆化，直至细胞株所分泌的抗体能够稳定抑制Yu22株病毒与鸡血发生凝集为止。
筛选结果获得六株单克隆抗体2F2、3G4、3C8、4D1、8H5、10F7。
杂交瘤的培养稳定的杂交瘤单克隆抗体细胞株先在二氧化碳培养箱中扩增培养，经96孔转移至24孔，再转移至50ml细胞瓶经扩增培养。然后收集细胞瓶内的细胞注射到小鼠腹腔内，7—10天后从小鼠腹腔中吸取腹水。
单克隆抗体的纯化
腹水先用50％的硫铵沉淀处理，然后对PBS，pH7.2透析，之后用DEAE柱在HPLC下纯化，得到纯化后的单克隆抗体，经SDS-PAGE鉴定纯化后的单克隆抗体纯度。
单克隆抗体的血凝抑制实验活性验证
选用34株来源于越南、印尼、马来西亚、泰国、香港、中国和欧洲等地的属于不同变异亚系的(Chen et al.，PNAS，103:2845，2006)H5N1病毒和14株非H5病毒(H1～H13，鸡NDV)，利用血凝抑制试验方法(HI)鉴定所述单抗与病毒的反应性，结果如表1和2，可见5株单抗均具有很好的特异性，与非H5病毒株均无反应；而对H5病毒株的反应，不同单抗株对不同病毒株的反应性存在差异，除了3G4反应谱最小外，其余的四株单抗和病毒的反应谱基本都接近或达到100％。
表1 单抗对H5和非H5病毒的血凝抑制试验阳性反应比
表2 单抗对34株H5型病毒的血凝抑制滴度
注<，滴度小于100。
单抗对病毒的中和实验
利用微孔中和实验检测所述单抗对H5N1病毒的中和活性(Hulse-Post et al.PNAS，102:10682-7(，2005))，结果见表3，可见单抗8H5对所有H5N1病毒株均显示出很好的中和活性。
表3 单抗对H5N1病毒的中和实验滴度
注/，无数据；<，滴度小于100
实施例2H5亚型流感病毒HA抗原检测试剂盒(酶联免疫法，ELISA)的组装
本试剂盒使用双抗体夹心法检测标本中的H5亚型流感病毒的HA抗原。首先在试剂盒的聚乙烯微孔板条上预包被抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体，当裂解后的H5型流感病毒HA抗原加到微孔后，预包被的单克隆抗体能将其捕获，随后加入的酶标单克隆抗体也能与之结合，而后通过酶催化底物显色程度判断结果。当标本中不含流感病毒抗原或不是H5型流感病毒时，底物不会显色。可检测的标本包括排泄物、口鼻腔分泌物、鸡胚培养的完整病毒或裂解病毒等。
酶标板的制备
在试剂盒的聚乙烯微孔板条上预包被抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体隆抗体，单克隆抗体包被使用10mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)，在37℃下包被过夜；然后使用PBST(10mM PBS+0.05％Tween 20)洗涤一次，扣干后再加入封闭液(10mM PBS+2％明胶)，37℃封闭2小时，再扣干并真空抽干包装成成品试剂盒酶标板(8×12孔)。
试剂盒其它成分的配置
病毒裂解液组成 裂解液A(LB-A)6％CHAPS+2％Tween-20+1％Tween-80； 裂解液B(LB-B)100mM PMSF，使用异丙醇溶解，工作终浓度为2mM； 裂解液C(LB-C)10mM PBS，pH7.4。
酶标试剂以HRP标记抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体隆抗体，得到稀释度合适的酶标试剂
阳性对照使用合适滴度的H5N1—Yu22株灭活病毒作为阳性对照
阴性对照以裂解液A为阴性对照。
显色剂A液13.4g/L Na2HPO4.12H2O+4.2g/L柠檬酸.H2O+0.3g/L过氧化氢脲； 显色剂B液0.2mM/L四甲基联苯胺3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine(TMB)+20mM/L二甲基甲酰胺。
终止液2M浓硫酸
浓缩洗涤液20xPBST
封板膜2张
自封袋1个
说明书1份
检测过程
配液将50ml浓缩液(20×)用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用
编号将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步相同)。
样品处理及加样
当样品为液体时(包括原始标本、鸡胚培养标本、细胞培养标本)按每孔需要100ul LB-A+4ul LB-B预配适量的LB-A与LB-B的混合液并振荡混合。然后在微孔上每孔先加入100ul待测标本，再加入100ul配好的上述裂解液进行反应。
当样品为干拭子原始标本时取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一个标本管中，振荡溶解标本，室温静置30分钟后，重新振悬后，6000rpm离心5分钟，吸取上清检测，每孔加100ul进行反应。
当样品为干粪便原始标本时取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一个标本管中，将干粪便配置成10％(w/v)的粪悬液标本，振荡溶解标本，室温静置30分钟后，重新振悬，6000rpm离心5分钟，吸取上清检测，每孔加100ul进行反应。
每次检测均需要设置阴阳性对照孔，每孔加100ul对照液。
孵育用封口膜封板后置微量振荡器上中等速度室温(25～28℃)震荡60分钟。
洗涤小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。
加酶分别在相应孔中加入酶标试剂100ul。
孵育用封口膜封板后，置37度温育30分钟。
重复步骤6
显色每孔加入显色剂A、B液各50ul，轻轻振荡混匀，37℃避光显色30分钟。
测定每孔加终止液1滴(50ul)，轻轻振荡混匀，用酶标仪单波长450nm(需设空白对照孔)或双波长450nm/630nm测定各孔OD值。
结果判定
a)阴性对照的正常范围正常情况下，阴性对照孔≤0.1(阴性对照孔OD值若大于0.1应舍弃，如果所有阴性对照孔OD值都大于0.1，应重复实验。若阴性对照孔小于0.03，则按0.03计算)。
b)阳性对照的正常范围正常情况下，阳性对照孔OD值≥0.50。
c)临界值(CUTOFF)计算阴性对照孔OD均值+0.15。
d)阳性判定样品OD值≥临界值(CUTOFF)者为禽流感病毒H5型HA抗原反应阳性。
e)阴性判定样品OD值<临界值(CUTOFF)者为禽流感病毒H5型HA抗原反应阴性。
临床标本测定实验
利用本试剂盒检测各种H5和非H5病毒标本，结果见表4，可以看出本试剂盒具有很好的检测灵敏度和特异性。
表4 利用H5抗原ELISA检测试剂盒检测H5和非H5病毒标本
注-，不确定；a，检出阳性数量；b，检测样本数量；HA滴度是计算流感病毒滴度的标准单位。
实施例3H5亚型流感病毒anti-HA抗体检测试剂盒(酶联免疫法，ELISA)的组装
本试剂盒采用竞争法检测血清标本中的H5型流感病毒HA抗原特异性抗体。首先在试剂盒中微孔板条上一次包被抗H5亚型流感病毒HA的单克隆抗体，二次包被H5亚型流感病毒HA基因的重组表达抗原。在加入血清标本和酶标单克隆抗体后，标本中的特异性抗体与酶标单克隆抗体竞争结合酶标板上的抗原，如果加入的血清标本能明显抑制酶标单克隆抗体与抗原的结合，则表明标本中含流感病毒H5型HA抗原的特异性抗体。当标本中不含流感病毒抗体或不是H5型流感病毒抗体，不会抑制酶标单克隆抗体与抗原的反应。
酶标板的制备
在试剂盒的聚乙烯微孔板条上一次预包被抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体隆抗体，单克隆抗体包被使用10mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)，在37℃下包被过夜；然后使用PBST(10mM PBS+0.05％Tween 20)洗涤一次，扣干后再加入封闭液(10mMPBS+2％明胶)，37℃封闭2小时。扣干后进行二次包被，使用10mM PBS，pH7.4溶液稀释重组表达抗原后按每孔100ul加入到一次包被处理后的微孔板上，37℃包被2小时，洗涤一次后再37℃封闭2小时，最后扣干并真空抽干包装成成品试剂盒酶标板(8×12孔)。
试剂盒其它成分的配置
a)酶标试剂以HRP标记抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体，得到稀释度合适的酶标试剂。
b)阳性对照使用合适浓度的抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体作为阳性对照。
c)阴性对照使用100％小牛血清(NBS)作为阴性对照。
d)显色剂A液13.4g/L Na2HPO4.12H2O+4.2g/L柠檬酸水溶液+0.3g/L过氧化氢脲
e)显色剂B液0.2mM/L四甲基联苯胺3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine(TMB)+20mM/L二甲基甲酰胺
f)终止液2M浓硫酸
g)浓缩洗涤液20×PBST
h)封板膜2张
i)自封袋1个
j)说明书1份
检测过程
a)配液将50ml浓缩液(20x)用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用。
b)编号将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步相同)。
c)加样分别在相应孔中加入待测样品或阴性、阳性对照50ul。
d)加酶在相应孔中加入酶标试剂50ul。
e)孵育混匀后用封口膜封板，置37度温育60分钟。
f)洗涤小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。
g)显色每孔加入显色剂A、B液各50ul，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟。
h)测定每孔加终止液1滴(50ul)，轻轻振荡混匀，用酶标仪单波长450nm(需设空白对照孔)或双波长450nm/630nm测定各孔OD值。
结果判定
a)阴性对照的正常范围正常情况下，阴性对照孔≥0.1。
b)阳性对照的正常范围正常情况下，阳性对照孔OD值≤0.1。
c)临界值(Cutoff值)计算Cutoff值＝阴性对照孔OD均值/2。
d)阳性判定样品OD值<Cutoff值判H5型流感病毒HA抗原特异性抗体阳性。
e)阴性判定样品OD值≥Cutoff值判H5型流感病毒HA抗原特异性抗体阴性。
临床标本测定实验
利用本H5抗体试剂盒检测人血清和鸡血清标本，结果见表5，说明本试剂盒具有很好的灵敏度和特异性。
表5 利用H5抗体ELISA试剂盒测定血清标本
注-，未确定；a，检出阳性数量；b，被测样本总数量.
实施例4H5亚型流感病毒HA抗原检测试剂盒(金标法)的组装
本试纸条是采用胶体金免疫层析技术研制的新一代诊断试剂，可检测的标本包括排泄物、口鼻腔分泌物、鸡胚培养的完整病毒或裂解病毒等。本品设计精巧，一次性使用，操作简便、安全、可靠、无污染，自带质控对照，不需任何附加试剂，显示结果明确，反应迅速，整个操作时间仅需30分钟。
本试纸条分别在硝酸纤维素膜上检测区包被anti-HA的单克隆抗体，对照区包被羊抗鼠IgG。检测时样品中H5型流感病毒与标记胶体金的anti-HA单克隆抗体(Ab--Au)形成复合物(Ag-Ab-Au)，由于层析作用复合物沿膜带移动，可与包被在检测区的anti-HA的单克隆抗体形成双抗体夹心免疫复合物。如为阳性样品，则可分别在检测区及对照区各凝集形成一条红色线；如为阴性样品，则只在对照区形成一条红色线。
试剂盒测试条的制备同常规方法。
试剂盒组成测试条、裂解液、说明书。
操作过程
a)样品处理及加样
i.样品为液体时(包括原始标本、鸡胚培养标本、细胞培养标本)
按每孔需要100ul LB-A+4ul LB-B预配适量的LB-A与LB-B的混合液并振荡混合。然后在微孔上每孔先加入100ul待测标本，再加入70ul配好的上述裂解液进行反应。
ii.样品为干拭子原始标本时
取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一个标本管中，振荡溶解标本，室温静置30分钟后，重新振悬后，6000rpm离心5分钟，吸取上清检测，每孔加70μl进行反应。
iii.样品为干粪便原始标本时 取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一个标本管中，将干粪便配置成10％(w/v)的粪悬液标本，振荡溶解标本，室温静置30分钟后，重新振悬，6000rpm离心5分钟，吸取上清检测，每孔加70ul进行反应。
b)在加样处缓慢加样70ul，平置于室温。
结果判定30分钟内观察结果。
出现两条红色线，认定为阳性；只出现质控线，认定为阴性；不出现红色线，则认定为无效，结果参见图1。
实施例5H5亚型流感病毒抗·HA抗体检测试剂盒(金标法)的组装
本试纸条分别在硝酸纤维素膜上检测区包被anti-HA的单克隆抗体，对照区包被羊抗鼠IgG。玻璃纤维上冻干有anti-HA单克隆抗体标记胶体金和H5型流感病毒重组HA表达抗原，采用竞争法来检测待测样品中的H5型流感病毒anti-HA抗体。如样品中含anti-H5的抗体则与anti-HA单克隆抗体标记胶体金竞争从而阻断复合物的形成不能显色；若为阴性，则形成复合物显色。
试剂盒测试条的制备同常规方法。
试剂盒组成测试条、说明书。
检测过程
将密封袋打开，取出所需试纸条，在加样处缓慢加入血清样品70ul，平置于室温，30分钟内观察结果，超出30分钟，结果无效。
结果判定
只出现质控线，认定为阳性；出现两条红色线，认定为阴性；不出现红色线，则认定为无效，参见图2。
实施例6H5亚型流感病毒HA抗原检测试剂盒的组装
本试剂盒在渗虑检测装置的硝酸纤维素膜上的样品检测区预包被anti-H5(HA)的单克隆抗体和在对照区包被羊抗鼠IgG。加入经裂解的含H5亚型流感病毒HA标本后，预包被的单抗体将其捕获，形成抗原抗体复合物(Ab-Ag)，随后加入酶标单抗(Ab-HRP)与抗原抗体复合物结合，最终形成抗体-抗原-酶标抗体复合物(Ab-Ag-Ab-HRP)，而后通过酶催化底物显色进行结果判定。当标本中不含H5亚型流感病毒时，检测区不显色，只在对照区形成一个显色点。
渗漏检测装置的制备
硝酸纤维素膜和吸水滤纸置于一平的底部支持上。一个形状合适的盖子盖在底部支持之上，后而盖子中部有一个开口。一个形状合适盖子中部开口的流量控制单位插入开口。该流量控制单位有二个孔分别为装载样品和对照。流量控制单位的底部紧紧地被按在底部支持之上以限制样品流动使之保持在硝化纤维素膜和滤纸上。抗-H5(HA)单克隆抗体被涂在流量控制单位的测试区，而goat anti-mouse IgG被涂在流量控制单位的对照区。试纸在空气中风干1小时，然后包装在真空成为渗漏检测装置.
试剂盒组成
a)渗虑检测装置
b)样品处理装置一个瓶子由过滤器盖帽拧紧；过滤器盖帽中部包含过滤器使得溶液可以解过滤通过.
c)酶标试剂以HRP标记抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体隆抗体，得到稀释度合适的酶标试剂。
d)裂解液3％NP40+1％Triton X—100+40mM PBS，pH7.4。
e)洗涤液2％Triton X—100+20mM EDTA+0.25％ Tween 20+0.1％ Proclin300+150mM NaCl+5mM PBS，pH7.4。
f)显色液3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid底物System forMembranes。
g)终止液50mM柠檬酸水溶液
h)说明书
检测过程
a)样品处理及加样 每个样品处理装置中加入200μl待测样品，随后滴加8滴裂解缓冲液，充分混匀.然后，所有裂解样品被在样品处理器中紧压通过过滤器盖帽装入检测孔。待样品完全吸收后(约25分钟)，摘掉流量控制单位。
b)洗涤加入5滴洗涤缓冲液，使之完全吸收；
c)加酶滴加4滴酶标试剂，待酶完全渗虑干净后反应2分钟；
d)洗涤分2次洗涤，第一次滴入8滴洗涤液，洗液完全渗虑干净后再滴入5滴洗涤液，让洗涤液渗虑干净；
e)显色滴加2滴显色液，待显色液吸干后2分钟进行结果判定，超过5分钟的结果无临床意义，结果判定示意图参见图3。
临床标本测定实验利用本H5快速检测试剂盒测定临床标本，获得表6的数据结果，显示本试剂盒具有很好的灵敏度和特异性。
表6 利用H5抗原免疫渗虑法对临床病毒标本的测定
注-，未确定；a，检出阳性数量；b，受测样本总数量。
实施例7单克隆抗体轻链基因和重链基因可变区的分离
半贴壁培养107个杂交瘤细胞，吹管吹起贴壁细胞使悬浮，转移到新的4ml离心管中，1500rpm离心3分钟，收集沉淀的细胞，重悬于100ul无菌PBS(pH7.45)中，转移到一新的1.5ml离心管中。加入800ul Trizol(Roche，Germany)，轻轻颠倒混匀，静置10分钟。加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，静置10分钟，4℃ 12000rpm离心15分钟，转移上层液体至一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟。4℃12000rpm离心10分钟，弃上清，加入600ul 75％乙醇洗涤，4℃ 12000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀于60℃真空抽干5分钟。透明的沉淀溶于70ul DEPC H2O中，分装成两管。每管加入1ul反转录引物，其中一管加入的反转录引物为MVJkR(5’-CCg TTT(T/g)AT(T/C)TC CAg CTT ggT(g/C)CC-3’)，用于扩增轻链可变区基因，另一管加入的反转录引物为MVDJhR(5’-C ggT gAC Cg(T/A)ggT(C/g/T)CC TTg(g/A)CC CCA-3’)，用于扩增重链可变区基因。每管再加入1ul dNTP(上海生工)，置72℃水浴10分钟，立即放到冰浴中置5分钟，加入10ul 5x反转录缓冲液，1ul AMV(10u/ul，Pormega)，1ul Rnasin(40u/ul，Promega)，混匀后于42℃将RNA反转录成cDNA。
抗体基因可变区的分离采用聚合酶链式反应(PCR)法，使用根据Novagen公司的Ig-Prime kits合成的引物组以及另外设计合成的两条下游引物MVJkR、MVDJhR(上海博亚公司合成)，MVJkR为轻链可变区基因扩增的下游引物，MVDJhR为重链可变区基因扩增的下游引物。模板即为以上合成的两种cDNA。PCR条件为在94℃下5分钟，在94℃下40秒，在53℃下1分钟，在72℃下50秒，共35次循环，在72℃下15分钟。回收目的片段并克隆至pMD 18-T载体，送至上海博亚公司测序，序列经blast比对后确定抗体可变区序列，并推测出相应的氨基酸序列。
依上述方法从6株禽流感单抗杂交瘤细胞株中克隆出其抗体可变区基因，并推测出相应的氨基酸序列。表7所示为所用的上游引物序列，表8所示6株单克隆抗体可变区核甘酸和氨基酸序列编号。互补决定区(CDR)如表9所示。表7 扩增禽流感单抗可变区基因的上游引物序列
表8 6株单克隆抗体可变区核甘酸和氨基酸序列编号
表9 6株单克隆抗体CDR氨基酸序列
实施例8 8H5单链抗体的表达及活性检测
将8H5抗体基因的重链和轻链可变区通过(GGGGS)3短肽连接成单链抗体DNA片段。以8H5 HF1/8H5 HR1为引物对扩增出8H5重链可变区片段，以8H5 KF1/8H5 KR1为引物对扩增出8H5轻链可变区片段，引物序列见表10。分别回收两个片段，再以这两个片段互为引物及模板在新的PCR系统中进行重叠延伸，得到少量完整单链抗体片段，然后以完整片段为模板，以8H5H F1/8H5 KR1为引物进行大量扩增，回收单链抗体片段，以BamH I/Sal I酶切回收到单链抗体片段，克隆到相同酶切的pTO-T7原核表达载体中。以ER2566大肠杆菌作为表达菌株，采用常规方法表达，结果表达的蛋白质是以不溶性的包涵体形式存在。以常规方法洗涤纯化包涵体，结果单链抗体主要溶解于8M尿素中。将溶解于8M尿素中的单链抗体蛋白逐步对1×PBS透析复性，12000rpm离心10分钟去除沉淀，将最终得到的初步纯化的单链抗体溶液进行活性测定。
表10 单链抗体及嵌合抗体克隆用引物
采用竞争ELISA法检测初步纯化出的8H5单链抗体的活性。在聚苯乙烯板条的孔中包被禽流感多克隆抗体，并用BSA封闭，待测孔中加入50μl上述单链抗体溶液以及50μl禽流感H5病毒，阴性对照孔中则加入50μl 1x PBS溶液及50μl禽流感H5病毒，阳性对照孔中加入50μl禽流感多克隆抗体及50μl禽流感H5病毒，三孔重复。各孔稍混匀后于37℃反应1小时后，以HRP标记的禽流感多克隆抗体为二抗再反应半小时，加入A、B显色液于37℃显色15分钟，终止反应后用酶标仪读数。结果阴性对照平均数值为1.871，阳性对照平均数值为0.089，待测孔平均数值为0.597，说明初步纯化出的8H5单链抗体蛋白具有较高的活性。
选用26株H5N1病毒，利用血凝抑制试验方法(HI)鉴定所述8H5单链抗体与病毒的反应性。在96孔血凝板中，每孔加入25μL PBS，在第一孔中加入25ul8H5单链抗体溶液(0.08mg/ml)并混匀，取25μL到第二孔，如此向后倍比稀释。取25μl病毒加入单链抗体中，室温孵育30分钟，再加入0.5％鸡红细胞50μL，室温孵育30分钟，观察红细胞凝集。结果8H5单链抗体对其中的16株病毒都有HI活性(表11)。
实施例9 10F7、4D1单链抗体的表达及活性检测
方法如实施例8所述，将抗体基因的重链和轻链可变区通过(GGGGS)3短肽连接成单链抗体DNA片段。以10F7 VHF/10F7 VHR为引物对扩增出10F7重链可变区片段，以10F7 VKF/10F7 VKR为引物对扩增出10F7轻链可变区片段。以4D1 VHF/4D1 VHR为引物对扩增出4D1重链可变区片段，以4D1 VKF/4D1 VKR为引物对扩增出4D1轻链可变区片段。
以10F7 VHF/10F7 VKR为引物进行大量扩增重叠的10F7单链抗体片段，以4D1 VHF/4D1 VKR为引物进行大量扩增重叠的4D1单链抗体片段。以BamH I/SaI I酶切回收到单链抗体片段，克隆到相同酶切的pT0-T7原核表达载体中。同样以ER2566大肠杆菌作为表达菌株，表达过程同上，表达的蛋白质以不溶性的包涵体形式存在。超声沉淀经相同纯化过程，结果单链抗体主要溶解于8M尿素中。将溶解于8M尿素中的单链抗体蛋白逐步对1xPBS透析复性，12000rpm离心10分钟去除沉淀，将最终得到的初步纯化的单链抗体溶液进行活性测定。
选用26株H5N1病毒，利用血凝抑制试验方法(HI)鉴定所述初步纯化的10F7、4D1单链抗体的活性。方法同上，单链抗体10F7的浓度为1.06mg/ml，4D1的浓度为0.34mg/ml。结果4D1单链抗体对其中的23株病毒都有HI活性，10F7单链抗体对其中的14株病毒有血凝塑活性(表11)。
表11 三种单链抗体对25株H5N1禽流感病毒的血凝抑制实验结果
注HI滴度为稀释2的n次方，n为表中数值
采用中和实验测定初步纯化的10F7单链抗体的活性。选取7株2002年至2006年期间，在香港、印尼、青海等地，从鸡、鸭及数种野生鸟类中分离到的毒株，利用血凝抑制实验鉴定所述10F7单链抗体于病毒的反应性，结果该单链抗体对其中5株病毒都表现出了较好的中和活性(见表12)。针对Ck/HK/Yu22/02毒株，scFv经64倍稀释后仍然能够抑制病毒感染细胞。
表12 10F7 scFv中和实验结果
实施例10 嵌合抗体的表达及活性检测
将4D1、10F7和8H5单抗的重链可变区和轻链可变区基因，分别加上信号肽序列，再克隆到含有人gamma 1重链和kappa轻链恒定区序列的真核表达质粒中。其中pcDNA3.1-AH含有人gamma 1重链恒定区序列，pcDNA3.1-Ak含有人轻链kappa恒定区序列。
以8H58CHF1/8H5VHR为引物对扩增出8H5部分重链信号肽序列及可变区片段，以该PCR产物为模板，8H58CHF2/8H5VHR为引物对，扩增出带完整信号肽的8H5重链可变区序列，克隆至Bam H I/Xho I双酶切的pcDNA3.1-AH质粒，从而获得表达人鼠嵌合重链的表达质粒pcDNA3.1-AH8H5。以8H58CKF1/8H5VKR1为引物对扩增出8H5部分轻链信号肽序列及可变区片段，以该PCR产物为模板，8H58CKF2/8H5VKR1为引物对扩增出带完整信号肽序列的8H5轻链可变区片段，克隆至EcoR I/Xho I双酶切的pcDNA3.1-Ak质粒，从而获得表达人鼠嵌合轻链的表达质粒pcDNA3.1-Ak8H5。
以10F78CHF1/10F7VHR为引物对扩增出10F7部分重链信号肽序列及可变区片段，以该PCR产物为模板，10F78CHF2/10F7VHR为引物对，扩增出带完整信号肽的10F7重链可变区序列，克隆至Bam H I/Xho I双酶切的pcDNA3.1-AH质粒，从而获得表达人鼠嵌合重链的表达质粒pcDNA3.1-AH10F7。以10F78CKF1/10F7VKR为引物对扩增出10F7部分轻链信号肽序列及可变区片段，以该PCR产物为模板，10F78CKF2/10F7VKR为引物对扩增出带完整信号肽序列的10F7轻链可变区序列，克隆至EcoR I/Xho I双酶切的pcDNA3.1-Ak质粒，从而获得表达人鼠嵌合轻链的表达质粒pcDNA3.1-Ak10F7。
以4D1VH F1/4D1VHR为引物对扩增出4D1部分重链信号肽序列及可变区片段，以该PCR产物为模板，4D1VHF2/4D1VHR为引物对，扩增出带完整信号肽的4D1重链可变区序列，克隆至Bam H I/Xho I双酶切的pcDNA3.1-AH质粒，获得表达人鼠嵌合重链的表达质粒pcDNA3.1-AH4D1。以4D1VKF/4D1VKR为引物对扩增出4D1轻链信号肽序列及可变区片段，克隆至EcoR I/Xho I双酶切的pcDNA3.1-Ak质粒，从而获得表达人鼠嵌合轻链的表达质粒pcDNA3.1-Ak4D1。
图4为3种嵌合抗体的表达质粒图。
通过磷酸钙转染法将含嵌合重链和嵌合轻链的双质粒共转染293FT细胞，收集培养上清，经饱和硫铵沉淀获得初步纯化的嵌合抗体(cAb)。调整嵌合抗体和鼠单抗(mAb)的初始浓度至0.7ug/ml，用Ck/HK/Yu22/02毒株进行血凝抑制HI活性检测，结果表明，三种嵌合抗体的HI活性均与相应鼠单抗一致(图5)。
选用23株H5N1病毒，利用血凝抑制试验方法(HI)鉴定所述初步纯化的10F7、4D1嵌合抗体的活性，方法同上。结果两种嵌合抗体对这23株病毒都有HI活性(表13)。
表13 两种嵌合抗体对23株H5N1禽流感病毒的HI结果
进一步采用免疫荧光方法测定cAb的活性。在24孔细胞培养板中放置盖玻片，在其中培养昆虫细胞SF21，通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统，在SF21细胞中表达禽流感病毒的HA蛋白。表达后的细胞经过PBS洗涤，4％多聚甲醛固定，山羊多抗血清封闭后，与4D1或10F7嵌合抗体室温孵育1小时，以HBV特异的人鼠嵌合抗体为阴性对照。以荧光标记的羊抗人抗体(Sigma，St.Louis，MO，USA)为二抗，室温反应半小时，取DAPI(Sigma，St.Louis，MO，USA)染细胞核，室温10分钟，然后制片于正置荧光显微镜(Nikon)下观察。由图6的结果可知，4D1、10F7嵌合抗体均能特异地与SF21细胞中表达禽流感病毒的HA蛋白结合。
实施例11 从噬菌体7肽库中筛选模拟单克隆抗体识别表位的短肽
选用New England Biolabs公司的7肽噬菌体展示文库(ph.D.C7C peptidelibrary)筛选与单克隆抗体8H5、3C8结合的7肽，按操作说明书进行。大体如下
吸取50μl Protein A-琼脂糖介质(50％的水悬液)于微量离心管中，加1ml TBS+0.1％ Tween(TBST)溶液。轻弹管壁或温和震荡重悬介质。低速离心30秒，沉淀介质，小心吸去上清。介质重悬于1ml封阻缓冲液中，4℃作用60分钟，偶尔混匀。在此期间，用TBS缓冲液将2×1011个噬菌体粒子(相当于10μl的原始文库)和300ng抗体稀释至终体积200μl，抗体终浓度为10nM。室温作用20分钟。封阻反应后，低速离心沉淀介质，并用1ml TBS洗4次，每次均需沉淀介质。将噬菌体-抗体混合物加入洗过的介质中，温和混匀，室温作用15分钟并不时混匀。低速离心沉淀介质，弃上清，用1ml TBTS洗10次。重悬沉淀介质于1ml 0.2M的Glycine-HCl(pH 2.2)，1mg/ml BSA中，室温作用10分钟，洗脱结合的噬菌体。离心洗脱混合液1分钟，小心将上清转入另一新的微量离心管中。立即用150μl 1M Tris-HCl，pH 9.1的缓冲液中和洗脱液。取出约1μL滴定噬菌体滴度。将剩余的噬菌体溶液加入20mL对数生长前期的ER2738宿主菌液中，37℃震荡培养4.5小时。将菌液移入50mL离心管中，10000rpm离心20分钟。吸取上部80％上清，加入1/6体积的PEG/NaCl(20％PEG-8000，2.5M NaCl)溶液，4℃静置1小时。10000rpm 4℃离心15分钟。倒掉上清，用1mL PBS溶解沉淀噬菌体。4℃离心5分钟，吸取上清，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液，4℃静置1小时。10000rpm 4℃离心15分钟。倒掉上清，用200μL PBS溶解沉淀噬菌体，4℃保存。重复上述步骤，进行再一轮的筛选。
将过夜培养的ER2738宿主菌按照1:10的比例稀释到LB培养基中，并将菌液分装到培养管中(1mL/管)。每种单克隆抗体挑取10个经过3轮筛选的LB/IPTG/Xgal培养板上兰色的噬菌斑单克隆，接种到上述菌液中。37℃震荡培养4.5小时。将菌液移到1.5mL离心管中，10000g离心后，取200ul上清保存，余下的按照小量M13抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)操作手册提取ssDNA。经上海博亚生物技术有限公司测序，获知插入的7肽序列如表14。
表14 与单克隆抗体8H5、3C8结合的7肽序列(核苷酸序列SEQ ID Nos 13，14和15分别为氨基酸序列SEQ ID Nos 64，68和70的编码序列)。
实施例12噬菌体7肽的活性检测
将含有8H5A、8H5E、3C8A7肽的三种噬菌体进行大量扩增，经PEG沉淀后，溶于PBS，测定滴度为1011-1012之间。以5ug/ml浓度分别包被4种鼠单抗8H5、4A1、9N7、4D11，5％脱脂奶PBS封闭。将分别加入进行梯度稀释后的三种噬菌体，反应1小时后，洗涤5次，加入15000羊抗M13酶标抗体(Amersham Pharmarcia Biotech，UK)，反应半小时后读数。结果如表15所示，可知8H5A与8H5单抗的反应具有较好的特异性，而与其它三种单抗的反应性很弱。8H5E对8H5单抗的特异反应性较差。
表15 噬菌体7肽的特异性结合活性检测结果
实施例13 从噬菌体12肽库中筛选模拟8H5识别表位的短肽
选用New England Biolabs公司的12肽噬菌体展示文库(ph.D.12pe ptide library)筛选与单克隆抗体8H5结合的12肽，按操作说明书进行筛选。具体步骤参照实施例11。
第三轮筛选后，取出约1ul洗脱下来的噬菌体进行滴定。挑取单一噬菌体空斑至对数期的ER2738菌中，37℃培养4.5～5小时，离心收集噬菌体上清进行ELISA检测。包被10ug/ml浓度的鼠单抗8H5，以噬菌体上清为一抗，Anti-M13/HRP抗体(AmershamPhmarcia Biotech，UK)以1:5000稀释为二抗，取禽流感相关抗体4D1mAb、10F7mAb以及抗HEV E2蛋白的不相关抗体8C11mAb为鼠单抗对照。图7显示其中较好的12个噬菌体多肽的检测结果。由图中结果可知，大部分噬菌体肽针对目标抗体8H5的读值高于对照抗体3倍以上，有较好的特异性。
根据噬菌体ssDNA抽提试剂盒(Omega，USA)的常规操作抽提DNA，以该DNA模板进行测序(Invitrogen，Shanghai，China)，获得以上12株噬菌体展示12肽的核苷酸及氨基酸序列(见表16)。
表16 与单抗隆抗体8H5结合的12肽序列
实施例14.12肽123和125与239蛋白融合表达及活性检测
239-123和239-125融合表达载体的构建
本实验室在大肠杆菌中表达了HEV ORF2的一个片段(a.a.368—606)，获得的重组蛋白239可组装成为类病毒颗粒，具有良好的免疫原性。我们通过PCR方法，构建出239序列的C端融合12肽序列的原核表达载体pTO-T7-239-123(图8)和pTO-T7-239-125(图9)。首先，针对239序列和12肽序列设计引物(表17)，以239基因为模板，应用引物239-123F/239-123R1和239-125F/239-125R1进行第一轮PCR扩增。产物回收、纯化后作为模板，应用引物239-123F/239-123R2和239-125F/239-125R2进行第二轮PCR扩增，扩增出239-123和239-125片段。然后，分别回收PCR产物239-123和239-125，Nde I和EcoR I双酶切后克隆入载体pTO-T7中。连接物转化大肠杆菌ER2566，小量表达及质粒酶切鉴定，阳性克隆即为重组原核表达载体pTO-T7-239-123和pTO-T7-239-125。
表17 239-123和239-125克隆引物序列
239-123和239-125融合蛋白的表达和纯化
挑取转化pTO-T7-239-123或pTO-T7-239-125质粒的ER2566单菌落，于2mL含有Kn抗性的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.5，然后按照11000的比例转接扩大培养至500mL LB(含有Kn抗性)中，培养至OD600约1.0时，加入IPTG 500μL，37℃诱导4小时。4℃下收集菌体，8000rpm离心10分钟。弃上清，菌体沉淀用20mL/瓶的裂解液重悬。冰水浴，采用超声破碎仪处理破碎细胞。超声条件如下工作时间10分钟；脉冲打2秒钟，停5秒钟；输出功率70％。12000rpm离心10分钟，保留上清，沉淀用20mL 2％Triton重悬，震荡30分钟。12000rpm离心10分钟，保留上清，沉淀用20mL Buffer I重悬，震荡30分钟。重复Triton/Buffer I处理一次。12000rpm离心10分钟，保留上清，沉淀用20mL 2M Urea/Buffer I重悬，震荡30分钟。12000rpm离心10分钟，保留上清，沉淀用20mL 4M Urea/Buffer I重悬，震荡30分钟。12000rpm离心10分钟，保留上清，沉淀用20mL 8M Urea/Buffer I重悬，震荡30分钟。12000rpm离心10分钟，保留上清。各保留上清制成蛋白上样样品以进行SDS-PAGE分析(图10、图11)。由SDS-PAGE分析得知，蛋白主要溶解于8M Urea中，纯度可达90％。将8M Urea中的蛋白梯度透析至PBS中(8M Urea-4M Urea-2M Urea-PBS)。
239-123和239-125融合蛋白的活性检测
直接ELISA法检测
初步纯化的239-123和239-125融合蛋白以10μg/mL的浓度包被96孔板，37℃2小时。洗板1次，ED封闭液封闭非特异性结合位点，37℃2小时后4℃过夜。去封闭液后，每孔加入100μL不同的鼠单抗，包括8C11、7H8、3C8、8H5、1A6、13E1、1D8、1G2、3G41、13A2、11H8、4D1、10HD4、14H12、6CF3、7D1、7E8、10DE2、16A12、3FC1、8E2、3D2、10D122、13E7共24株单抗。其中8C11为239蛋白特异单抗，8H5为12肽筛选所用单抗，其余22株单抗为针对禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)单抗。37℃孵育1小时。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(110000)100μL，37℃孵育30分钟。PBST洗板5次，加入显色液显色10分钟，终止液终止，酶标仪读值。由图12、图13结果可知，239-123和239-125融合蛋白只与抗体8C11和8H5反应，与其它单抗均无反应。说明239-123和239-125融合蛋白的反应特异性非常好。
实施例15 12肽123和125与HBV cAg蛋白融合表达
融合表达载体的构建
利用HBVcAg的a.a.1-149在大肠杆菌中能以类病毒颗粒形式表达的性质，本实验室将该149个氨基酸插入大肠杆菌表达载体pTO-T7中，并以连接子替代HBVcAg B细胞优势表位区段的第79、80两个氨基酸，构建了突变型HBVcAg表达质粒pC149-mut。HBVcAg有着很强的T细胞免疫原性，外源多肽在HBVcAg内部MIR(mayorimmunodominant region，a.a.78-83)的融合不会改变其颗粒的多聚特性，且可使外源表位暴露于颗粒表面。
将123和125分别以1至5个拷贝插入HBcAg的第79和80位氨基酸，得到系列融合蛋白，分别统称为HBc-123、HBc-125。根据12肽序列，以及pC149-mut的载体序列，分别设计含12肽序列的正向引物及通用反向引物149MRP(表18，下划线表示插入的多肽序列)。以pC149-mut为模板，应用引物HBc123F2/HBcR和HBc123F2/HBcR进行第一轮PCR扩增。产物回收、纯化后作为模板，应用引物HBc123F1/HBcR和HBc123F1/HBcR进行第二轮PCR扩增，扩增出连有12肽序列的C149 a.a.81-149，经BgI II和EcoR I酶切后回收纯化得到片段。同时以BamH I和EcoR I双酶切载体pC149-MUT，回收载体后与片段连接。连接物转化大肠杆菌ER2566进行表达鉴定及质粒酶切鉴定，鉴定正确的质粒即插入了一个12肽，分别命名为pC149-mut-123和pC149-mut-125。此质粒再用BamH I和EcoR I双酶切得载体，与之前经BgI II和EcoR I酶切的含有12肽序列的片断连接，阳性克隆即为含有2个12肽拷贝数的重组原核表达质粒，分别命名为pC149-mut-D123和pC149-mut-D125。用类似方法，构建出分别含有3个拷贝、4个拷贝及5个拷贝数的重组原核表达载体pC149-mut-T123、pC149-mut-F123、pC149-mut-Q123和pC149-mut-T125、pC149-mut-F125、pC149-mut-Q125。构建质粒图如图15、图16所示(仅以pC149-mut-123和pC149-mut-125为例)。
表18 123、125与HBV cAg融合蛋白表达的克隆引物序列
备注下划线为12肽序列。
融合蛋白的表达及纯化
将pC149-mut-D123、pC149-mut-T123、pC149-mut-F123、pC149-mut-Q123、pC149-mut-D125、pC149-mut-T125、pC149-mut-F125、pC149-mut-Q125表达质粒表达出来的融合蛋白分别称为D123、T123、F123、Q123、D125、T125、F125、Q125。分别将含有八种表达质粒的ER2566菌种，接种于2mL含有Kn抗性的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.5，然后按照11000的比例转接扩大培养至500mL LB(含有Kn抗性)中，培养至OD600约0.8时，加入IPTG 500μL，18℃诱导20小时。4℃下收集菌体，8000rpm离心10分钟。弃上清，菌体沉淀用20mL/瓶的裂解液重悬。冰水浴，采用超声破碎仪处理破碎细胞。超声条件如下工作时间10分钟；脉冲打2秒钟，停5秒钟；输出功率70％。12000rpm离心10分钟，保留上清。经SDS-PAGE鉴定，所有融合蛋白主要表达在上清中(图17)。
由于上清表达蛋白比较杂，故需要对其进行纯化。并且此类蛋白在适宜的条件下可以自发组装形成颗粒，所以对蛋白进行纯化的同时，应考虑其自发组装形成颗粒的条件。我们采用以下方法对蛋白进行纯化以及促进蛋白自发组装形成颗粒以总体积20％的量加入饱和硫酸铵进行蛋白沉淀，冰浴反应30分钟。12000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀用含有5％β-巯基乙醇的CB Buffer吹起，37℃震荡30分钟，12000rpm离心10分钟，上清透析至PB5.8(含有300mM NaCl和50mM EDTA)的缓冲液体系中。每8小时换液一次，换液6次后收集透析液，12000rpm离心10分钟，上清样品进行SDS-PAGE鉴定纯度。此方法中，先以20％饱和硫酸铵对蛋白进行初步纯化，再以含有5％β-巯基乙醇的CB Buffer促使蛋白形成颗粒组装引发二聚体，然后在低PH值及高盐的条件下促进蛋白自发组装形成颗粒。同时此条件下，目的蛋白可以得到进一步的纯化(图18)。
以上表达的8种融合蛋白均以上述方法初步纯化后，样品用2％磷酸钨负染，直接进行电镜观察(图19)。组装成功的颗粒呈均匀的空心球形(部分颗粒为实心状)，有大小两种，直径分别约为35nm及20nm。
实施例16ELISA检测HBc-123和HBc-125融合蛋白活性
将八种融合蛋白分别以10μg/mL的浓度包被96孔板，37℃2小时。洗板1次，ED封闭液封闭非特异性结合位点，37℃2小时后4℃过夜。每孔加入100μL8H5抗体，37℃孵育1小时。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(110000)100μL，37℃孵育30分钟。PBST洗板5次，加入显色液显色10分钟，终止液终止，酶标仪读值。由图20的结果可知，八种融合蛋白均具有与8H5抗体结合的活性。
以Q123和D125蛋白为例，进行抗体特异性的检测。10μg/mL的蛋白浓度包被96孔板，37℃2小时。洗板1次，ED封闭液封闭非特异性结合位点，37℃2小时后4℃过夜。每孔加入100μL不同抗体，包括8H5、8G9、3C8、4D1、10F7、1G2、3D2、3CF1、7D1、6CF3、7H8、10DE2、13E7、16A12共14株单抗。其中8H5为12肽筛选所用单抗，其余13株单抗为针对禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)单抗，37℃孵育1小时。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(110000)100μL，37℃孵育30分钟。PBST洗板5次，加入显色液显色10分钟，终止液终止，酶标仪读值。对ELISA结果分析(图21)，Q123和D125融合蛋白只与抗体8H5反应，与其它禽流感单抗均无反应。说明Q123和D125融合蛋白的反应特异性非常好。
实施例17 HBc-123和HBc-125融合蛋白的免疫源性分析
将上述经过纯化的八种HBc-123和HBc-125融合蛋白分别与等体积的福氏佐剂混合(初次免疫时与完全福氏佐剂混合，加强免疫时与不完全福氏佐剂混合)，以肌肉多点注射的方式，免疫BALB/c小鼠，每只小鼠的免疫量为100μg蛋白，3—4只小鼠为一组。初次免疫后，每隔一周加强免疫一次，同时采取眼球血。进行抗血清分离将血悬液置37℃2小时，再移入4℃过夜，令血球凝集。4000g离心10分钟，吸取上清，即得到抗血清。存放于-4℃备用。
以1μg/孔包被239-123和239-125融合蛋白，HRP标记的羊抗鼠IgG作为酶标二抗，建立抗12肽123或125特异抗体检测的间接法ELISA，用来检测动物抗血清的123肽或125肽特异抗体与12肽反应性以及抗体产生滴度情况。HBc-123的各融合蛋白免疫血清以11000稀释后，ELISA检测结果如图22。HBc-125的各融合蛋白免疫血清以12000稀释后，ELISA检测结果如图23。
实施例18 免疫小鼠血清的免疫荧光检测
在24孔细胞培养板中放置盖玻片，在其中培养昆虫细胞SF21，通过昆虫细胞一杆状病毒表达系统，在SF21细胞中表达禽流感病毒的HA蛋白。表达后的细胞经过PBS洗涤，4％多聚甲醛固定，山羊多抗血清封闭后，与1:20稀释的T123和F125免疫鼠血清室温孵育1小时，以HBc免疫鼠血清为阴性对照。以荧光标记的羊抗鼠抗体(Sigma，St.Louis，MO，USA)为二抗，室温反应半小时，取DAPI(Sigma，St.Louis，MO，USA)染细胞核，室温10分钟，然后制片于正置荧光显微镜(Nikon)下观察。由图24的结果可知，T123和F125免疫鼠血清均能特异地与SF21细胞中表达禽流感病毒的HA蛋白结合。进一步表明123和125较好的模拟了HA的抗原表位。
实施例19 12肽122、124、128、129与HBV cAg蛋白融合表达及活性检测
4种12肽122、124、128、129，分别以两个拷贝插入HBV cAg蛋白中，得到的融合蛋白分别称为HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129。
HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白表达载体的构建方法与HBc-123、HBc-125融合蛋白表达载体的构建方法相同，所用引物如表19。第一轮的上游引物为F3，第二轮的上游引物为F2，第三轮的上游引物为F1，下游引物均为HBcR。通过3轮PCR，将目的12肽片断与C149-mut片段相连，并以Bg II和EcoR I双酶切后，与BamH I和EcoR I双酶切的pC149-mut载体连接，构建成表达质粒(具体方法详见实施例15)。
表19 HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白克隆引物序列
HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白表达和纯化与上述HBc-123、HBc-125融合蛋白的表达、纯化方法相同(具体方法详见实施例15)。HBc与12肽融合蛋白的表达情况以及颗粒组装情况如表20所示。颗粒的电镜观察图片如图25。
表20 HBc与12肽融合蛋白的表达及VLP形成
间接ELISA检测HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白活性。
HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白以10μg/mL的浓度包被96孔板，37℃ 2小时。洗板1次，ED封闭液封闭非特异性结合位点，37℃ 2小时后4℃过夜。每孔加入100μL不同抗体，包括8H5、8G9、3C8、1G2、3D2、3CF1、7D1、6CF3、7H8、10DE2、13E7、16A12共12株单抗。其中8H5为12肽筛选所用单抗，其余11株单抗为针对禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)单抗，37℃孵育1小时。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(110000)100μL，37℃孵育30分钟。PBST洗板5次，加入显色液显色10分钟，终止液终止，酶标仪读值。由图26的结果可知，HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白只与抗体8H5反应，与其它禽流感单抗均无反应，说明HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白与8H5单抗的反应特异性非常好。
实施例20 展示12肽的类病毒颗粒与禽流感病毒的竞争ELISA实验
取禽流感病毒H5N1特异鼠单抗2F2以10ug/ml包板，病毒株Ck/HK/Yu22/02以1:40稀释后加入孔板中孵育，37℃，1小时；弃去孔中病毒，将10ug初纯的类病毒颗粒与1:1000稀释的8H5/HRP共同加入孔板中孵育，37℃，30分钟。126和127并不与H5单抗结合，但同样展示于VLP上作为阴性对照，另又以PBS为不加VLP的阴性对照。结果如图27所示，上述5个待测的类病毒颗粒均能与病毒竞争结合8H5酶标抗体，进一步提示这5个12肽均有可能模拟了8H5抗原表位的部分空间结构。
序列表
<110>HX诊断公司
夏宁邵
陈毅歆
葛胜祥
罗文新
张军
<120>H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体或其结合活性片段及其用途
<130>62682.8001.WO00
<140>PCT/US2007/002491
<141>2007-01-26
<150>中国专利申请200610002312.1
<151>2006-01-26
<160>27
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>363
<212>DNA
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<212>PRT
<213>2F2 VK Amino Acid sequence
<400>2权利要求
1、一种能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体包括选自于如下一组的可变重链:
(i)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:28-30的CDR的可变重链；
(ii)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:34-36的CDR的可变重链；
(iii)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:40-42的CDR的可变重链；
(iv)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:46-48的CDR的可变重链；
(v)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:52-54的CDR的可变重链；以及
(vi)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:58-60的CDR的可变重链。
2、如权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述的可变重链包括选自于如下一组的氨基酸序列:
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:25。
3、如权利要求1所述的单克隆抗体，其进一步包括选自于如下一组的可变轻链:
(i)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:31-33的CDR的可变轻链；
(ii)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:37-39的CDR的可变轻链；
(iii)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:43-45的CDR的可变轻链；
(iv)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:49-51的CDR的可变轻链；以及
(v)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:61-63的CDR的可变轻链。
4、如权利要求3所述的单克隆抗体，其中，所述的可变轻链包括选自于如下一组的氨基酸序列:
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27。
5、如权利要求2所述的单克隆抗体，其进一步包括选自于如下一组的可变轻链:
(i)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:31-33的CDR的可变轻链；
(ii)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:37-39的CDR的可变轻链；
(iii)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:43-45的CDR的可变轻链；
(iv)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:49-51的CDR的可变轻链；以及
(v)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs:61-63的CDR的可变轻链。
6、如权利要求5所述的单克隆抗体，其中，所述的可变轻链包括选自于如下一组的氨基酸序列:
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27。
7、如权利要求6所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体为Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv。
8、如权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体为Fab、Fab′、F(ab)2或Fv。
9、如权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体结合H5亚型禽流感病毒血凝素的KD值小于1×10-5M。
10、如权利要求9所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体结合H5亚型禽流感病毒血凝素的KD值小于1×10-6M。
11、如权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体包括非-CDR区，该非-CDR区是来自不是鼠类的物种。
12、如权利要求11所述的单克隆抗体，其中，所述的非-CDR区是来自人类的抗体。
13、如权利要求12所述的单克隆抗体，其中，所述的人类非-CDR区具有一个或多个来自鼠抗体的取代氨基酸。
14、一种能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体包括选自于如下一组的单克隆抗体:
(i)杂交瘤细胞株8H5所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株8H5的保藏号是CCTCC-C200607；
(ii)杂交瘤细胞株3C8所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株3C8的保藏号是CCTCC-C200605；
(iii)杂交瘤细胞株10F7所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株10F7的保藏号是CCTCC-C200608；
(iv)杂交瘤细胞株4D1所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株4D1的保藏号是CCTCC-C200606；
(v)杂交瘤细胞株3G4所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株3G4的保藏号是CCTCC-C200604；以及
(vi)杂交瘤细胞株2F2所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株2F2的保藏号是CCTCC-C200424。
15、一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株选自于如下一组的杂交瘤细胞株:
(i)保藏号为CCTCC-C200607的杂交瘤细胞株8H5；
(ii)保藏号为CCTCC-C200605的杂交瘤细胞株3C8；
(iii)保藏号为CCTCC-C200608的杂交瘤细胞株10F7；
(iv)保藏号为CCTCC-C200606的杂交瘤细胞株4D1；
(v)保藏号为CCTCC-C200604的杂交瘤细胞株3G4；以及
(vi)保藏号为CCTCC-C200424的杂交瘤细胞株2F2。
16、一种能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体能够封闭所述的血凝素蛋白与选自于如下一组单克隆抗体相结合的活性的至少50％:
(i)杂交瘤细胞株8H5所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株8H5的保藏号是CCTCC-C200607；
(ii)杂交瘤细胞株3C8所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株3C8的保藏号是CCTCC-C200605；
(iii)杂交瘤细胞株10F7所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株10F7的保藏号是CCTCC-C200608；
(iv)杂交瘤细胞株4D1所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株4D1的保藏号是CCTCC-C200606；
(v)杂交瘤细胞株3G4所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株3G4的保藏号是CCTCC-C200604；以及
(vi)杂交瘤细胞株2F2所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株2F2的保藏号是CCTCC-C200424。
17、如权利要求16所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体封闭所述的血凝素蛋白结合活性的至少70％。
18、如权利要求17所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体封闭所述的血凝素蛋白结合活性的至少90％。
19、一种分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，而所述的抗体重链可变区则包含选自于如下一组的氨基酸序列:
(i)SEQ ID NOs:28-30；
(ii)SEQ ID NOs:34-36；
(iii)SEQ ID NOs:40-42；
(iv)SEQ ID NOs:46-48；
(v)SEQ ID NOs:52-54；以及
(vi)SEQ ID NOs:58-60。
20、如权利要求19所述的分离的核酸分子，其中，所述的重链可变区包含选自于如下一组的氨基酸序列:
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21和SEQID NO:25。
21、如权利要求20所述的分离的核酸分子，其中，所述的核酸分子包括选自于如下一组的核酸序列:
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20和SEQID NO:24。
22、一种包含如权利要求19所述的核酸分子的表达载体。
23、一种包含如权利要求22所述的表达载体的宿主细胞。
24、一种分离的核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，而所述的抗体轻链可变区则包含选自于如下一组的氨基酸序列:
(i)SEQ ID NOs:31-33；
(ii)SEQ ID NOs:37-39；
(iii)SEQ ID NOs:43-45；
(iv)SEQ ID NOs:49-51；以及
(v)SEQ ID NOs:61-63。
25、如权利要求24所述的分离的核酸分子，其中，所述的重链可变区包含选自于如下一组的氨基酸序列:
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27。
26、如权利要求25所述的分离的核酸分子，其中，所述的核酸分子包括选自于如下一组的核酸序列:
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:26。
27、一种包含如权利要求26所述的核酸分子的表达载体。
28、一种包含如权利要求27所述的表达载体的宿主细胞。
29、一种检测样品中H5亚型禽流感病毒的方法，其包括如下步骤:
a)将所述的样品与权利要求1中的单克隆抗体进行接触；
b)检测所述的单克隆抗体与所述病毒的反应。
30、如权利要求29所述的方法，其中，所述的单克隆抗体附着在固相上。
31、如权利要求30所述的方法，其中，所述的固相选自于如下一组:微滴定板、磁颗粒、胶乳颗粒和硝化纤维素膜。
32、如权利要求30所述的方法，其中，所述的单克隆抗体是按如此方向附着在所述固相上，其能够增加所述单克隆抗体与所述样品的结合效率。
33、如权利要求32所述的方法，其中，所述的单克隆抗体是通过其恒定区域而附着在所述固相上的。
34、如权利要求29所述的方法，其中，所述的反应是通过酶显色进行测定的。
35、如权利要求29所述的方法，其中，所述的反应是通过荧光进行测定的。
36、如权利要求29所述的方法，其中，所述的反应是通过化学发光进行进行测定的。
37、如权利要求29所述的方法，其中，所述的单克隆抗体为Fab、Fab′、F(ab)2或Fv。
38、如权利要求29所述的方法，其中，所述的样品来自于鸟类或人类。
39、一种药物组合物，其包含如权利要求1所述单克隆抗体在药学上可接受的盐。
40、一种药物组合物，其包含一种或多种选自于如下一组单克隆抗体的、其药学上可接受的盐:
(i)杂交瘤细胞株8H5所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株8H5的保藏号是CCTCC-C200607；
(ii)杂交瘤细胞株3C8所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株3C8的保藏号是CCTCC-C200605；
(iii)杂交瘤细胞株10F7所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株10F7的保藏号是CCTCC-C200608；
(iv)杂交瘤细胞株4D1所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株4D1的保藏号是CCTCC-C200606；
(v)杂交瘤细胞株3G4所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株3G4的保藏号是CCTCC-C200604；以及
(vi)杂交瘤细胞株2F2所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株2F2的保藏号是CCTCC-C200424。
41、如权利要求40所述的药物组合物，其进一步包括其它抗病毒成分在药学上可接受的盐。
42、如权利要求41所述的药物组合物，其中，所述的单克隆抗体为Fab、Fab′、F(ab)2或Fv。
43、一种防止或治疗由禽流感病毒感染在一主体上引发的疾病的方法，其包括向所述的主体给药有效剂量的、如权利要求39所述的药物组合物。
44、一种用于检测样品中禽流感病毒的组合物，其包括附载于固相底物上的、如权利要求1所述的单克隆抗体。
45、如权利要求44所述的组合物，其中，所述的单克隆抗体为Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv。
46、如权利要求44所述的组合物，其中，所述的单克隆抗体包含可变重链，该可变重链含有选自于如下一组的肽序列:
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21和SEQID NO:25。
47、如权利要求46述的组合物，其中，所述的单克隆抗体进一步包含可变轻链，该可变轻链含有选自于如下一组的肽序列:
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27。
48、如权利要求44所述的组合物，其中，所述的固相底物选自于如下一组:微滴定板、磁颗粒、胶乳颗粒和硝化纤维素膜。
49、如权利要求44所述的组合物，其中，所述的固相底物为测试带。
50、如权利要求49所述的组合物，其中，所述的测试带具有至少一测试区和一控制区。
51、如权利要求44所述的组合物，其中，所述的单克隆抗体是按如此方向附着在所述固相底物上，其能够增加所述单克隆抗体与所述样品的结合效率。
52、一种用于检测样品中禽流感病毒的装置，其包括固相底物，该固相底物包括复数个分隔区间，其中，一个或多个所述的分隔区间涂覆有如权利要求1所述的单克隆抗体。
53、如权利要求52所述的装置，其中，一个或多个所述的分隔区间涂覆有不同于能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的所述单克隆抗体的结合试剂。
54、如权利要求53所述的装置，其中，所述的结合试剂是能够特异性结合H1、H3、H7或H9亚型禽流感病毒的抗体。
55、如权利要求52所述的装置，其进一步包括自动化检测装置，该自动化检测装置能够检测所述单克隆抗体与H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白之间的结合。
56、一种检测样品中禽流感病毒的试剂盒，其包括如权利要求1所述的、附着于固相底物上的单克隆抗体和可检测的、被标记的第二单克隆抗体。
57、如权利要求56所述的试剂盒，其中，所述的第二单克隆抗体能够特异性地结合禽流感病毒。
58、如权利要求56所述的试剂盒，其中，所述的第二单克隆抗体能够特异性地结合禽流感病毒血凝素蛋白。
59、如权利要求56所述的试剂盒，其进一步包括控制标准。
60、一种短肽，其包含选自于如下一组的氨基酸序列:SEQ ID NOs:64-69、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94和96。
61、一种短肽，其包含选自于如下一组的核酸序列:SEQ ID NOS:75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95和97。
62、如权利要求60或61所述的短肽，其能特异性结合8H5单克隆抗体。
63、一种短肽，其包含选自于如下一组的氨基酸序列:SEQ ID NOs:70-73。
64、如权利要求63所述的短肽，其能特异性结合3C8单克隆抗体。
全文摘要
本发明提供了可特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之单克隆抗体，及可阻断至少50％的单克隆抗体与H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白结合活性之单克隆抗体。该单克隆抗体可用于探测，诊断，预防，和治疗禽流感病毒，特别是H5亚型禽流感病毒。本发明也提供了相关的杂交瘤细胞株，分离的核酸分子和短肽，以及其含该单克隆抗体的药物组合物和医药诊断设备和试剂盒。
文档编号G01N33/53GK101379397SQ200780003646
公开日2009年3月4日 申请日期2007年1月26日 优先权日2006年1月26日
发明者夏宁邵, 陈毅歆, 葛胜祥, 罗文新, 军 张 申请人:Hx诊断公司