多色生物传感器的制作方法

专利名称：多色生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及光学探测领域。更具体而言，本发明涉及用于光学探测的 方法和系统，例如，所述光学探测可以是(例如)采用颗粒或荧光团对(例 如)在生物、化学或者生化分析中的定性或定量探测中采用的发光信号进 行探测，并且涉及用于改进这种探测方法和系统的手段。
背景技术：
(US6617590)描述了一种图像读取设备，其包括三个激光源、釆用发 自所述激光源的激光束进行表面扫描的扫描机构、光探测器以及用于将发 自图像载体的光导引至所述光探测器的共焦光学系统。所述设备对若干相 关探测技术作了规定，所述探测技术例如是微阵列成像、放射自显影成像、 化学发光成像等。其包括具有针孔的共焦切换构件，所述针孔具有不同的 直径并且设置在所述共焦光学系统和所述光探测器之间。上述设备的缺点 在于，忽略了共焦透镜的色差，因而将制约同时的多色探测。
荧光是生命科学研究中经常采用的现象。荧光探针和接合作用广泛用 于跟踪细胞成分和蛋白质定位的所在，并以卓越的灵敏度和选择性探测包 括活细胞的复杂生物分子组装中的特定成分，例如，生物分子。
荧光探针是一种荧光团，其被设计为在生物样品的特异性区域内进行 定位，或者对特异性激发做出响应。多色标记实验需要故意引入两个或更 多的探针，从而同时监测不同的生化功能。该技术主要应用于诸如流式细 胞术、DNA测序、荧光原位杂交(FISH)、荧光显微术、荧光光谱法、荧 光共振能量转移(FRET)、荧光漂白恢复(FRAP)等的分析技术。

发明内容
目前，同时多色探测受到现有光学探测装置的局限性或相关成本的严 格限制。借助于使多次发射的光谱分离最大化有助于信号隔离和数据分析。因 此，在多色应用中光谱带宽窄的荧光团特别有用。用于多色标记的理想染 、:斗组合应表现出在与激发波长一致时有强的吸收以及充分分离的发射光 谱。需要单种染料具有大的吸收消光系数和大波长(斯托克斯)位移的必 要组合。很难找到这些材料。此外，多波长聚焦常常意味着昂贵而复杂的 光学系统，例如成像透镜组、将样品置于诸如显微镜中的焦点中的可移动 部件、或倾斜部件。
本发明的目的是获得一种用于诸如发光信号探测的光学探测的好方法
和系统，所述光学探测例如是探测来自生物、化学或生化颗粒的发射。本
发明实施例的优点在于可以获得高效而高质量的探测。本发明实施例的优
点还在于可以在系统中仅利用单个光学元件，例如折射元件将具有不同波
，或波长范围的不同辐照束聚焦在基质上而获得高质量的探测。
本发明的具体实施例的优点在于，降低了因折射元件不能使多个波长 光聚焦在单个点而导致的球面像差和色差。
本发明的具体实施例的优点在于，无需调节所有光学元件，或仅需要 最小限度的调节，即无需校正透镜或复合透镜组即可获得更清晰的焦点。
本发明的具体实施例的优点还包括使用令所述装置更加鲁棒并且对磨 损不太敏感的固定元件(没有可移动部件)以及提供用于聚焦和收集光的 单个光学元件，例如折射元件。
本发明的具体实施例的优点还在于可以在该系统上进行很宽范围的应 ，，且由于在低像差或无像差操作中进行多波长激发和收集，因此可以使 ^很宽范围的标记。
以上目的是通过根据本发明的方法和装置实现的。
本发明涉及一种用于探测基质上的发光位点的探测系统，该探测系统 包括辐照单元，其用于产生至少一个激发辐照束以激发所述基质上的发 光位点；第一光学元件，例如第一折射元件，其适于接收至少两个具有不 同波长或波长范围的辐照束，所述至少两个辐照束为要聚焦在基质上的激 发辐照束和/或要从所述基质上的受激发发光位点收集的发光辐照束；以及 光学补偿器，其用于对所述至少两个具有不同波长或波长范围的辐照束中 的至少一个进行调节，以便至少部分补偿光学像差。所述调节可以是选择
7性调节。所述光学像差可以是由第一光学元件，例如第一折射元件引起的 像差。其可以是激发辐照束和/或发光辐照束的任意一种或两者中的色差， 每一种辐照束具有在特征不同波长或特征不同波长范围下的辐照。两种辐 照束可以是单个激发辐照束和所要收集的发光辐照束。根据本发明的具体 实施例的优点在于，获得了一种系统，由此实现了借助于相同的光学元件
(例如相同的折射元件)对具有不同波长或波长范围的辐照束进行折射， 其中像差被降低，甚至避免。获得所述系统的操作允许利用标准和/或廉价 的光学元件，例如折射元件以将至少一个激发辐照束聚焦在基质上，来提 供所述系统。所述探测系统还可以包括探测单元，所述探测单元至少具有 用于将发光辐照束聚焦到至少一个探测器元件上的第二光学元件，例如第
二折射元件。所述探测单元可以包括像素化探测器(piexlated detector)。根 据本发明的具体实施例的优点在于，在利用标准和/或廉价光学元件，例如 折射元件的同时可以降低辐照束的像差。第一光学元件，例如第一折射元 件可以是所述系统的物镜透镜。
所述辐照单元可以适于产生至少两个具有不同波长或波长范围的激发 辐照束，并且所述第一光学元件，例如第一折射元件可以适于接收至少两 个激发辐照束。根据本发明的具体实施例的优点在于，可以在探测系统和 方法中使用具有不同辐照波长的多个激发，由此降低在不同波长或波长范 围下进行的不同辐照发生的像差量。这可以实现复用，即，利用多种标记 操作，从而获得时间和经济上的成本降低。这还可以实现多色激发、具有 高灵敏度的无像差或低像差探测。根据本发明的实施例的优点是获得了适 用于各种标记的方法和系统，例如可以成功探测出具有较小斯托克斯位移 的标记。所述第一光学元件，例如折射元件可以适于通过其位置接收至少 两个激发辐照束。
光学补偿器可以至少在辐照束之一中弓I入相移。光学补偿器可以是相 位板。
光学补偿器可以至少在激发辐照束之一中引入相移以将激发辐照束聚 焦在基质上的相同焦点。本发明的具体实施例的优点在于，仅利用单个光 学元件就生成了用于至少两个具有不同波长或波长范围的辐照束的适当光 路。光学补偿器和第一光学元件(例如折射元件)可以是分立元件。这样 就能够成本有效地生产探测系统，因为可以从现有的大量生产的低成本光 学拾取单元集成出最大的现有部件，且可以使用市场上能买到的透镜。光 学补偿器可以并入第一光学元件，例如第一折射元件中。本发明的具体实 施例的优点在于，该探测系统可以是鲁棒的。所述探测系统可以适于选择 所述至少两个辐照束中要在某一时刻使用的一个。本发明的具体实施例的 优点在于，可以选择最适当的激发波长来探测基质上的发光位点。
所述辐照单元可以适于同时产生所述至少两个激发辐照束中的至少两 个。本发明的具体实施例的优点在于，同时激发和探测减少了总的分析时 间或允许在固定时段内提高灵敏度。可以在显著不同的期间内接收辐照束。
所述探测系统还可以包括探测单元，所述探测单元至少具有探测器元 件和光学元件，所述光学元件用于将至少两个发光辐照束作为平行发光辐 照场而聚焦在探测器元件上。本发明的具体实施例的优点在于，每个辐照 束可以靠近诸如第二折射元件的第二光学元件的光轴通过诸例如第二折射 元件的第二光学元件，即，每个辐照束与诸如第二折射元件的第二光学元 件的光轴之间的平均距离小。
所述探测系统还可以包括探测单元，所述探测单元至少具有探测器元 件和光学元件，所述光学元件用于将至少两个发光辐照束作为呈一条线排 列的相邻发光辐照场而聚焦在基质上。本发明的具体实施例的优点在于， 可以从不同的发光辐照场同时获得显著不同的发光信息。
所述探测系统可以包括探测单元，其适于同时探测来自发光位点的不 同发光辐照束，所述不同发光辐照束的每一个具有基本不同的波长。本发 明的具体实施例的优点在于，可以实现复用，即可以同时使用多种标记， 由此降低探测的经济和时间成本。
所述至少两个激发辐照束为平均波长分别可以处于760nm到800nm、 640nm到680nm以及380nm到420nm波长范围内的第一、第二和第三辐照 束。
本发明的具体实施例的优点在于，可以从现有的大量生产的低成本光 学拾取单元获得生物传感器的各部件，从而允许以成本有效的方式获得探 测系统。本发明还涉及一种用于对至少两个具有不同波长或波长范围的入射辐 照束中的至少一个进行调节的光学补偿器，所述光学补偿器适于利用相同 的光学元件，例如折射元件将所述至少两个入射辐照束聚焦于基质上的相 同焦点。
所述调节可以是选择性调节。
所述光学补偿器可以受非周期相位结构的调节。本发明的具体实施例 的优点在于，为了制造光学补偿器，在设计光学补偿器之后可以使用公知 的技术。
所述光学补偿器可以是具有不同非周期相位结构的相位轮，至少两个 辐照束布置成通过所述相位轮。
本发明还涉及一种用于探测基质上的发光位点的方法，该方法包括 产生至少一个激发辐照束以激发所述基质上的发光位点；对至少两个具有 不同波长或波长范围的辐照束进行引导，例如进行折射，所述至少两个辐 照束为要聚焦在基质上的激发辐照束和/或要从所述基质上的被激发发光位
点收集的发光辐照束；以及对所述至少两个具有不同波长或波长范围的辐
照束之一进行调节，以便至少部分补偿光学像差。
产生至少一个激发辐照束的所述步骤可以包括产生至少两个激发辐照 束，对至少两个辐照束进行引导，例如进行折射的所述步骤可以包括将至
少两个激发辐照束聚焦在基质上；并且对所述至少两个辐照束之一进行调 节的所述步骤可以包括对所述至少两个激发辐照束中的至少一个进行以在 所述基质上产生公共焦点。
本发明还涉及一种用于设计光学补偿器的基于计算机的方法，该方法 包括获取有关至少两个具有不同波长或波长范围的辐照束中每一个的波
长或平均波长的信息，获取有关用于聚焦所述至少两个辐照束的诸如折射
元件的光学元件的位置和光学特性的信息；以及考虑到要为由诸如单个折 射元件的单个光学元件聚焦的所述至少两个辐照束获得相同焦点，确定光 学补偿器的最佳特征参数，使得降低所述至少两个辐照束的光学像差。
本发明还涉及一种执行用于设计光学补偿器的基于计算机的方法的计 ^机程序产品，该方法包括获取有关至少两个具有不同波长或波长范围 的辐照束中的每一个的波长或平均波长的信息，获取有关用于聚焦所述至少两个辐照束的诸如折射元件的光学元件的位置和光学特性的信息；以及 考虑到要为由诸如单个折射元件的单个光学元件聚焦的所述至少两个辐照 $获得相同焦点，确定光学补偿器的最佳特征参数，使得降低所述至少两 _+辐照束的光学像差。
本发明还涉及一种存储如上所述的计算机程序产品的机器可读数据存 储装置和/或这种计算机程序产品通过局域或广域电信网络的传输。
借助于下文所述的一个或多个实施例提供本发明的这一和其他目的及 优点。
在独立和从属权利要求中给出了本发明的特定和优选方面。在适当的 情况下，从属权利要求的特征可以与独立权利要求的特征组合以及与其他 从属权利要求的特征组合，并非仅仅如权利要求中所明确给出的那样。本 发明的教导允许设计用于生物传感器中进行多波长聚焦的改进方法和设 '备。
本发明的以上及其他特性、特征和优点将从下文结合附图的详细描述 中变得明显，附图作为举例示了本发明的原理。仅出于举例的目的给出该 说明书，并不限制本发明的范围。下文援引的参考图是指附图。


图1是根据本发明的第一个方面的实施例的探测系统的示意图； 图2是根据第一实施例的探测装置的光学系统的示意图，其采用了三 个激发辐照束，从而最多同时激发三个标记；
r 图3示出了可以在图2所示的光学探测系统中采用的示范性滤光器组 的透射特性；
图4是根据第一实施例的探测装置的替代光学系统的示意图，其采用 了两个激发辐照束，从而最多同时激发两个标记；
图5是根据本发明的第一方面的第二实施例的探测装置的光学系统的 示意图，其采用了单个激发辐照束和两个发光辐照束，以实现FRET测量;
图6是根据本发明的第一方面的第三实施例的探测装置的光学系统的 示意图，其能够使两个发光辐照束在相同的像素化探测器上成像；
图7是根据本发明的第三方面的实施例的沿光学补偿器的半径的示范
11性非周期相位结构的示意图8是可以用于执行根据本发明的第四方面的另一个实施例的光学补 偿器的设计方法的处理系统的示意图。
在不同的附图中，相同的附图标记表示相同或类似的元件。
具体实施例方式
将参考具体实施例并且参照特定的附图来说明本发明，但是本发明不 限定于此，其仅由权利要求限定。权利要求中的任何附图标记都不构成对 发明范围的限制。所描述的附图只是示意性的而非限制性的。在附图中， 为了举例说明的目的， 一些元件的尺寸可以被放大并未按比例绘制。在本 说明书和权利要求书中采用术语"包括"的地方，其不排除其他元件或步 骤。当用不定冠词或定冠词表示单数名词例如"一"、"所述"时，其包括 多个该名词，除非有其他特别的说明。
此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等被用于相似元 件之间的区分，并不一定被用于描述前后或时间的次序。要明白所用的术 语在合适的情况下是可以互换的，本文所述的本发明的实施例能够按不同 于本文所述或图示的其他次序进行操作。
在此单独地提供了下面的术语或定义，以有助于理解本发明。这些定 义不应当被解释为具有比本领域人员所了解的定义更小的范围。术语"辐 照"或"发光"通常是指UV辐照、可见光辐照或红外辐照，但是本发明 不限定于此，也可以采用其他类型的电磁辐照。所提及的辐照束的波长可 以是所述辐照束的平均波长，也可以是获得最大发射所处的波长。如在本 文所使用的，术语"基质"描述了必须将辐照束聚焦到其上，并且从其上 议集发光辐照束的区域。根据本发明设想进行探测的发光位点是基质上发 射至少一个发光束的区别的位点或样点，所述发光束具有至少一个发光束 波长或者至少一个中央发光束波长。可以设想有任何发光信号，例如，反 射、散射、荧光、化学发光、电发光、生物发光或其他发光。发光位点还 可以由对光进行散射或反射的表面的结构特征提供。发光位点可能涉及基 质上的受到占据的位点，例如，受到具有发光标记的耙颗粒占据的位点。 将在接近分析物分子或者与之结合时发射光或者改变其光输出，例如，熄灭或者至少部分熄灭所发射的光或者改变所发射的光的颜色的分子称为
"光学可变分子"。发自于基质的发光包括远离和/或穿过基质透射的光；或
者所述发光是由放置于基质上的元件，例如，微阵列内的在受到适当波长
的光激发之后发出荧光光的荧光标记建立的；或者所述发光是由诸如光散 射光栅的基质表面的结构特征建立的。所述基质可以是任何适当的基质， 例如，载玻片、微阵列、硅芯片、诸如尼龙膜的膜、诸如尼龙滤光器的滤 光器、微流体装置、粗糙化金属基质、诸如含有染色的DNA或蛋白质的琼 脂糖凝胶的凝胶或者任何具有用于提供发光位点的适当表面的其他装置。 如本文所使用的，术语"样品"涉及包括感兴趣分析物的组合物。如本文 所使用的，术语"分析物"是指有待通过本发明的方法探测的物质。分析 物可以是固有发光提供者，也可以是通过施加标记而实现发光的。如本文 所使用的，术语"标记"是指能够产生可探测信号的分子或材料。可以使 标记直接附着至分析物，或者可以使标记通过诸如带标记探针的连接部分 附着至分析物。这些作用在于与分析物发生特异性结合的探针是通过能使 与分析物发生特异性结合或者对应于分析物的至少(特异性)部分的化合 物与标记连接而获得的。分析物特异性探针的性质将由所要探测的分析物 的性质决定。就最为一般的情况而言，基于与分析物的特异性相互作用设 计所述探针，所述特异性相互作用例如可以是但不限于抗原-抗体结合、互 补核甘酸序列结合、碳水化合物-凝集素结合、互补肽序列结合、配体-受体 结合、辅酶-酶结合、酶抑制剂-酶结合、等等。
根据第一方面，本发明提供了一种用于从基质探测发光位点的探测系 统。例如，这样的探测系统可以例如是用于探测(例如)具有颗粒形式(但 是本发明不限于此)的化学、生物或生化分析物的探测系统。典型地，这 样的探测系统包括辐照单元，所述辐照单元生成至少一个用于辐照基质的 ，发辐照束。典型地，这样的至少一个激发辐照束可以导致基质上的发光 ^点的激发，从而导致至少一次发光辐照的发射。所述探测系统典型地可 以包括第一光学元件，例如第一折射元件，其适于接收至少两个具有不同 波长的辐照束，由此所述至少两个辐照束为由所述辐照单元生成的激发辐 照束。将采用所述第一光学元件，例如第一折射元件将这些束聚焦于所述 基质上，和/或将要借助于所述第一光学元件，例如第一折射元件收集来自所述基质上的受激发的发光位点的发光辐照束。因此，根据第一方面，所 述探测系统还包括光学补偿器，所述光学补偿器用于对所述至少两个辐照 束中的至少一个进行，以便降低或者至少部分补偿由单个光学元件，例如 单个折射元件引起的光学像差。典型地，这样的光学像差可能是由用于对 具有不同波长的辐照束进行引导，例如进行折射的单个第一光学元件，例 如折射元件引起的，例如，所述辐照束可以是不同激发辐照束、 一个激发 辐照束和一个发光辐照束或者不同的发光辐照束。图1通过举例说明的方 式示出了包括基本部件和任选部件的探测系统100的示意性概图。探测系
统100适于探测样品6上的光发射位点。如图1所示，探测系统100包括 辐照单元102、适于接收至少两个具有不同波长的辐照束的诸如折射元件 25的光学元件25以及用于降低或校正由所述诸如折射元件25的光学元件 25在所述辐照束内引入的光学像差的光学补偿器。在下文中将对图1所示 的示范性探测系统的上述部件以及额外的或者任选的部件做更为详细的进 一步说明。
如上所述，探测系统100典型地包括具有至少一个辐照源的辐照单元 102。所述至少一个辐照源可以是任何适于在探测系统中使用的辐照源，例 如，光源。所述至少一个辐照束具有至少一个预定波长人。所述至少一个辐 照源可以是包括诸如激光器的辐照源的照明阵列，其发射具有处于波长、、 X2、X3......^下的辐射的激发辐照束，或者发射处于预定波长范围内的辐射，
以辐照基质。所述辐照源还可以包括白光源，其可以被滤波成若干具有处 于特定波长下的辐射或者具有处于特定波长范围内的辐射的辐照束。所述 辐照源还可以包括一个或多个单色或准单色光源，例如激光器或放电灯或 光发射二极管。所述光源可以包括氩激光器、二极管激光器、氦激光器、 染料激光器、钛蓝宝石激光器、Nd:YAG激光器等。例如，所述辐照单元可 以包括可调谐辐照源，例如可调谐半导体激光器，其用于依次提供至少一 个辐照束，或者所述辐照单元可以包括至少一个半导体激光器，从而同时 或者连续提供至少一个辐照束。因而，所述至少一个辐照源可以是多个辐 ;^源，例如两个或三个辐照源。典型地，所述多个辐照源允许进行多路复 用。所述至少一个辐照源适于发射处于预定波长或预定波长范围内的辐射， 例如光，所述辐射适于激发或辐照发光位点，例如像荧光位点这样的发光
14位点。例如，这样的位点可以包括存在于样品内的光学可变颗粒。例如， 在所生成的辐射是荧光辐射的情况下，所述激发辐射的光波长通常可以处
'于(例如)200nm到2000nm的范围内，或(例如)处于400nm到1100nm 的范围内，但是本发明不限于此。在优选实施例中，所述辐照单元102可 以适于采用所生成的至少一个辐照束扫描所要研究的基质。所述至少一个 辐照束的激发场可以是单个样点、细长样点或者一行部分重叠的样点。采 用至少分段的细长样点允许激发基质的不同区域，如果要进行明显不同的 探测，则这种做法将得到对不同结合位点的占据的同时探测。因此，通过 所述至少分段的细长样点可以得到经济有效的探测方法。
探测系统100还包括第一光学元件25，例如第一折射元件25，其被定 位成使之接收至少两个具有不同波长的辐照束。这样的辐照束可以是由辐 照单元102生成的激发辐照束、从基质上的发光位点收集的由所述激发辐 照束激发的发光辐照束、或者一个或多个激发辐照束和一个或多个发光辐 照束的组合。这样的第一光学元件25可以是折射元件25，例如，常规或标 准折射元件，例如，光存储装置中采用的物镜透镜。典型地，所述第一光 学元件25，例如第一折射元件25可以是所述探测系统中用于将(一个或多 个)激发辐照束聚焦到基质上的物镜透镜。但是，所述光学元件也可以是 抛物面反射镜以及若干其他适于接收至少两个具有不同波长的辐照束的屈 光、反射和折反射成像机构，包括棱镜。如上所述，作为替代，或者除此 之外，可以采用所述第一光学元件25，例如第一折射元件25，从而既实现 ^发辐照在基质上的聚焦，又实现对来自基质的发光辐照(如果存在的话) 的收集。典型地，针对一个具体的波长对共同用于不同辐照束的探测系统 100，更具体而言，对所述光学元件25 (例如第一折射元件25)进行优化。 对于具有多个波长的辐照束而言使用相同的第一光学元件25，例如第一折 射元件25引起光学像差，例如色差，因为光学元件，例如折射元件通常适 用于第一预定波长，如果具有其他预定波长的辐照束通过所述光学元件， 例如折射元件25，则将导致像差。
所述探测系统还包括光学补偿器5，其用于降低或者至少部分补偿因将 单个光学元件，例如单个折射元件用于具有不同波长的辐照束而引起的光 琴像差，通过设置所述光学补偿器的位置，使得具有不同波长并且穿过所述单个光学元件，例如单个折射元件的辐照束同样在其光路上遇到所述光 学补偿器。 一般而言，所述光学补偿器通常将针对不同的辐照束引入不同 的光路距离(OPD)差，以校正由所述的用于具有不同波长的不同辐照束 的光学元件，例如折射元件引起的光学像差。此外，还可以校正由其他光 学元件引起的光学像差。例如，可以通过引入相移而引入光路距离差。这 种相移可以是这样的，即对于所述辐照束之一而言相移(对27l取模)可以 基本为零，或者对于所设计的所有辐照束而言其可以基本不为零。所述光 学补偿器可以至少部分补偿，即，其可以降低由多个具有不同波长的辐照 束引起的平均光学像差。如果将若干具有不同波长的激发辐照束与单个光 学元件，例如单个折射元件一起使用，则所述降低或补偿可以使所述不同 的激发辐照束聚焦到基质上的相同焦点上。换言之，所述光学补偿器可以 降低或至少部分补偿光学像差，从而使不同的波长进入共同的焦点。本发 明的实施例的优点在于，可以将光学补偿器与来自光学拾取单元的光学元 哗结合使用，从而以经济有效的方式运行若干相关的生物测定。所述光学
补偿器可以是任何适当的允许至少部分校正这种光学像差的光学补偿器5， 例如相位板。例如，所述光学补偿器5可以是衍射元件，其对辐照束进行
衍射，从而使波长最短的辐照束被引入基本为零的相位变化(对27T取模)，
同时根据一级衍射使其他辐照束中的至少一个发生衍射。光学补偿器的另 一个例子可以是(例如)接近闪耀衍射光栅的具有台阶状剖面的衍射元件， 其中，为波长最短的辐照束选择零级衍射，为其他辐照束中的至少一个选
择一级和/或更高级的衍射。例如，所述光学补偿器5还可以是包括非周期 相位结构(NPS)的用于降低或者至少部分补偿所述辐照束中的至少一个的 波前像差的光学元件，其中，所述相结构包括双折射材料，并且具有非周 期台阶状剖面。典型地，将所述双折射材料与所采用的光的不同偏振状态 结合使用。光学补偿器5的另一个例子是以提供了与额外的径向表面轮廓 相叠加的跨越其宽度引入了恒定相位的基本径向区轮廓的非周期相位结构 (NPS)为基础的，其中，所述非周期相位结构引入了可变相位。在这一示 范性光学补偿器中，由所述光学补偿器引入的相位改变可以对于所有辐照 束而言不为零，因而有可能对一个辐照束引入小的像差，但是在考虑针对 所有辐照束的光学像差时，则改善了平均像差量。需要注意的是，只是通
16过举例说明的方式提供了上述光学补偿器的例子，本发明不限于此。可以 采用的光学补偿器的另一个例子是基于液晶材料的使用的光学补偿器，可 以根据所施加的电压对所述光学补偿器进行切换，以改变补偿性态，由此 能够根据所选择的波长优化补偿。本发明的具体实施例的优点在于，所采 用的光学补偿器不依赖于根据不同辐照束的不同衍射级的衍射，因而不会 在所要校正的不同像差之间带来任何关联。所述光学补偿器可以同时为不 ,司的辐照束降低或者至少部分补偿像差，或者所述光学补偿器可以包括不 同的部分，通过调节每一部分来降低或至少部分补偿具有特定波长或波长 范围的辐照束的像差。例如，所述光学补偿器可以(例如)是包括不同部 分的相位轮，其中的每一部分用于补偿或降低具有不同波长或不同波长范 围的不同辐照束的光学像差。可以为不同光学补偿器，例如相位轮或基于 液晶材料的光学补偿器提供控制机构，所述控制机构适于根据选定的辐照 束选择所述光学补偿器的给定部分，并使之进入辐照束路径。
典型地，所述探测系统还可以包括探测单元iio，其用于探测和定量测
量通过收集来自基质的发光辐照束而获得的发光响应。这样的探测单元可 'M包括至少一个探测器，所述探测器例如为光探测器、电荷耦合器件
(CCD)、电荷注入器件(CID)、互补金属氧化物半导体(CMOS)、光电 倍增管、雪崩光电二极管、固态光学探测器件、显微镜或摄像机。所述至 少一个探测器可以是若干个适于探测从基质收集的不同发光辐照束的探测 器。所述至少一个探测器可以是像素化探测器或者一行多个单像素探测器。 例如，这样的探测器可以是电荷耦合器件(CCD)探测器或CID、 一排光 子管倍增器、 一排雪崩光电二极管或者其他包括独立探测像素阵列的辐照 探测器。典型地，优选将所述至少一个探测器的宽度，或者在采用像素化 探测器的情况下，将所述至少一个探测器的探测器元件的宽度设置为，可 以针对基质上的空间上明显不同的区域发生探测，其中，所述空间分立的 区域使得，在检査过程中，几乎总是最多有一个被占据的结合位点出现在 单个像素探测到的区域内。所述空间分立的区域允许数字探测方式，艮P， 允许探测给定结合位点是否被占据，由此将得到二元判定。由单个像素探 测到的典型区域的大小可以介于0.01nm2和100^112之间，优选介于0.1pm2 和25jnm2之间，例如，ljxm2。在具体实施例中，可以提供评估单元lll，其用于确定发光位点的浓度或分布，和/或用于对所获得的探测结果进行统计 处理，从而(例如)使两个不同测量相互关联，以检验轻微结合的发光颗 粒是否对探测结果造成了影响。这样的评估机构可以包括诸如微处理器的 处理机构，和/或用于存储所获得的和/或经过处理的评估信息的存储器部 件。此外，也可能存在典型的输入/输出机构112。可以采用适当的软件或 专用硬件处理机构控制所述评估单元111来执行所述评估步骤。因而，可 以通过任何适当的方式，例如，通过专用硬件或适当编程的计算机、微控
制器或诸如微处理器的嵌入式处理器、诸如PAL、 PLA或FPGA的可编程 n阵列等实现所述评估机构111。可以将所述结果显示在任何适当的显示机 构112上，例如，显示在可视显示单元、绘图机或打印机等上。评估机构 111还可以具有与局域网或广域网的连接，以便将所述结果传输至远程位 置。
探测系统100的其他任选部件可以是诸如聚焦伺服系统的聚焦控制机 构113和诸如跟踪伺服系统的跟踪控制机构114，所述机构用于控制激发束 的聚焦，以及控制(例如)特定轨道上的激发束的位置。所述聚焦控制机 构可以以不同的聚焦方法为基础，例如，所述方法可以是但不限于Foucault 楔聚焦法。典型地，可以将跟踪控制机构114用于控制获得准确的空间探 测所需的跟踪。这样的系统可以包括致动器。探测系统100还可以包括高 频控制机构和诸如电荷耦合器件(CCD)的辅助探测器，可以采用所述辅 助探测器优化跟踪和聚焦功能。
除了通常作为用于将激发束聚焦到样品上的物镜元件的第一光学元件
25，例如第一折射元件25之外，所述探测系统还可以包括其他光学元件，
例如，诸如偏振选择或二向色分束器的分束器103、 二向色滤光器104、用
于将来自激发辐射源112的光朝向样品引导和从样品引导的透镜和/或反射
镜105等。如果存在若干个辐照源，并且每个适于提供具有不同预定波长
或者不同预定波长范围的激发辐照束，和/或如果将采用不同的探测器探测
若干个不同的发光辐照束，那么尤其需要引入这样的额外部件。可以采用
二向色滤光器或者二向色分束器阻挡不需要的激发辐射，避免其入射到所 述至少一个探测器元件上。可以将所述光学元件划分到辐照光学系统106内。现在，将通过若干具体实施例和实例说明本发明的第一方面，但是本发明不限定于此。
根据第一方面的第一具体实施例描述了上文针对第一方面描述的探测系统，其中，具有不同波长并且被布置为穿过相同的光学元件25，例如，
相同的折射元件25的多个辐照束为激发辐照束。换言之，在本实施例中，所述探测系统采用单个光学元件，例如，折射元件将至少两个具有不同波长的激发辐照束聚焦到基质上。可以采用的激发辐照束的数量不受限制，例如，其可以是两个、三个、四个等。可以同时采用激发辐照束，即，将激发辐照束的激发场同时聚焦到基质6上，或者可以从所述多个激发辐照束中选择一个或多个激发辐照束来使用。也可以顺次选择所述激发辐照束。，实施例包括用于对至少两个具有不同波长的激发辐照束中的至少一个进行调节的光学补偿器5，从而降低或者至少部分补偿由单个光学元件，例如单个折射元件引发的光学像差。所述光学补偿器5可以具有与上文所述的相同的特征和优点。其可以适于降低或者至少部分补偿具有不同波长的不同激发束的光学像差，从而将不同的激发束聚焦到基质上的相同焦点上。因而，根据本发明的实施例的优点在于，可以将激发辐照束适当地聚焦到基质上，从而得到准确有效的系统。因而，将通过若干个例子来说明本实施例。
在第一个例子中，探测系统包括多个激发辐照束，其能够实现采用三个不同的每者具有不同波长的激发辐照束实施激发。换言之，第一辐照束具有第一预定波长、、第二辐照束具有不同的第二预定波长、、而第三辐照束具有不同的第三预定波长M。在本例子中，第三波长^短于第二波长、，而第二波长？12短于第一波长、，但是本发明不限于此。在一个具体的设置中，所述第一、第二和第三波长、、、、、的波长范围分别是，^位于大约770到810nm的范围内，、位于大约640到680nm的范围内，、位于大约为400到420nm的范围内，所述三个波长优选分别是基本785nm、基本660nm和基本405nm。如果所采用的三个不同的波长是光学拾取单元中经常采用的三个不同波长，则典型地可以在所述探测系统中应用这种系统中的若干部件，这为获得这样的探测系统提供了经济有效的方法。例如，l采用典型的光学元件，例如，光存储系统中采用的典型折射元件25时，
19所述第一、第二和第三辐射束可以分别具有大约0.5、 0.65和0.85的数值孔径(NA)。如上所述，可以同时执行采用具有不同波长的辐照束的激发，即，同时在基质上提供辐照束，或者可以选择一个或多个具有特定激发波长的辐照束来使用。图2以举例的方式示出了采用三个激发辐照束的系统。#为举例，本发明不限于此，图2所示的探测系统还示出了若干用于收集所生成的发光辐照束的探测器。在本例子中，描述了一种用于探测三个不同发光辐照束的探测单元，但是所述探测单元可以适于探测更少或更多的不同发光辐照束。此外，在当前例子中，所示的探测系统适于采用单个光学元件25，例如单个折射元件25，同时完成将激发辐照束聚焦到基质上的操作和收集发光辐照束的操作，但是本实施例也可以设想采用其他光学部件完成对发光辐照束的采集的探测系统。在图2所示的示范性探测系统中，通过在不同的波长下工作的三个辐照源l、 2、 3，例如，三个不同的激光器生成三个激发辐照束。在图2所示的示范性探测系统中，采用三个分束器Al、 12和13使所述不同的辐照路径部分重叠。在本例子中，透镜21将所述激发辐照束进行准直，但是本发明不限于此。采用二向色分束器31使不同辐照束的辐照朝向光学补偿器5发射，之后，采用第一光学元件，例如，第一折射元件25 (例如，物镜透镜)将所述光聚焦到基质6上。光学补偿器5适于降低和/或补偿因将相同的光学元件，例如折射元件用于以不同波长或不同波长范围发射的激发辐照束而发生的光学像差，从而在基质6上得到所述激发辐照束的共同焦点。基质6可以具有固定厚度，例如，0.6mm的厚度，但是本发明不限于此。典型地，所述基质包括发光位点。响应于所述激发，可以从基质上的发光位点生成发光辐照。换言之，可以响应于所述激发生成至少一个发光辐照束。在本例子中，由具有不同波长的激发辐照束激发的发光辐射包括具有不同波长的不同发光辐照束。在本例子中，所述发光辐照束通过诸如折射元件25的光学元件25和第一二向色滤光器31而抵达探测单元。在图2所示的特定例子中，可以通过长通(longpass)二向色滤光器32反射波长最短的发光輻射，例如，绿光发射，并借助带通滤光器41对所述光进一步过滤，进而用透镜22将其聚焦到第一探测器51上。之后，再次借助二向色反射镜33将通过二向色滤光器32的荧光分开。可以再次借助二向色滤光器33来反射所述最短的波长，其将通过带通滤光器42，并用透镜23聚焦到探测器52上。其余荧光也将通过带通滤光器43，并用透镜24聚焦到第三探测器53上。由于存在三个用于激发的不同波长和其中的荧光必须被探测的三个不同波段，因而所采用的滤光器优选具有非常特异性的反射和透射特性。例如，第一二向色滤光器31对于405、 650和780nm激光线必须是反射性的，但是对于所引起的荧光必须是辐射可透过的。例如，可以从Omega滤光器(www.omegafilters.com)获得这样的多波段二向色滤光器。图3描绘出适于本实施例的例子的典型的标准二向色滤光器的一些光谱131、 132、 13和典型的标准带通滤光器的一些光谱141、142、 143。需要指出的是，只是作为举例提供出这些光谱，并且可以对所述滤光器的滤光器特性进行调谐，以便使所述滤光器与特定应用最佳匹配。需要指出的是，聚焦到基质上的激发辐照的一部分被所述基质反射并且被二向色滤光器31反射。可以借助透镜21将经反射的辐照聚焦到用于聚焦和跟踪的聚焦和跟踪机构113、 114 (图2中未示出)的探测器4上。由于可以采用多个激光器同时激发样品，因而可以在聚焦和跟踪探测器4的前面放置滤光器，以确保仅采用单个激光器就能实现适当的跟踪，从而生成跟踪信号。
根据第二个例子，上述探测系统仅借助两个不同的诸如激光器的辐照源2、 3工作。图4所示的示范性探测系统还包括两个用于探测两个分立的发光辐照束的探测器51、 53。需要指出的是，在本例子中，根据所要探测的发光辐照束的数量以及所采用的探测器的功能性，也可以采用更多或更少的探测器。对于大多数生物测定而言，釆用两种不同的标记，并由此仅采用前述例子中采用的三个诸如激光器的辐照源中的两个就足够了。由于在典型情况下只需探测两个荧光波段，因而其简化了整个系统。具体而言，对用于适当引导辐照束的滤光器31、 32的要求不是十分严格。波长的不同组合可能是有利的。将辐照束与较短的波长结合将允许在样品上探测到较小的探测样点，因为衍射极限通常随波长成比例变化。例如，具有(例如)基本405nm和基本650nm的波长的辐照束得到的发光事件的可分辨性要高于采用具有(例如)基本650nm和780nm的波长的辐照束得到的发光事件的可分辨性。另一方面，由于通常更多的物质在受到短波长的激发时发出荧光，因而采用较短的波长可能导致更大的背景信号。例如，可以采用具有较大波长的辐照束，例如，波长(例如)基本为650nrn和780nrn的辐照 束来减轻后一问题。
根据本发明的第一方面的第二实施例涉及上述探测系统，其中，仅采 用了单个激发辐照束，但是其中，还采用用于将所述单个激发辐照束聚焦 到基质上的诸如折射元件的光学元件25来收集至少一个与所述激发辐照束 具有不同波长的发光辐照束。因此，所述探测系统包括用于针对由诸如折 射元件的光学元件引起的光学像差而对所述激发辐照束或所述发光辐照束 中的至少一个进行的光学补偿器。将采用例子对第二实施例进行说明，但 是本发明不限于此例子。根据第二实施例的示范性探测系统，如图5所示， 采用单个激发辐照束来激发样品6，并从样品6探测至少一个(例如，两个) 不同的发光辐照束。例如，可以在荧光共振能量转移(FRET)实验中采用 这一构造。在FRET中，采用单个激光器来激发供体染料。这一染料能够 在第一探测器51探测的第一波长区域内发出荧光。但是，如果受体染料处 于附近(距离小于5nm)，并且其吸收光谱与供体染料的发射重叠，那么就 能够使能量发生转移。之后，所述受体染料将在第二探测器53探测的第二 红移波长区域内发出荧光。通过监测两个通道之间的比率，有可能测量两 种染料之间的距离，由此能够得到(例如)实时PCR中的重要信息。采用 了所述特定配置(其中一个波长激发要与多个波长探测相结合)的替代例 子同样可以用于其他情况下，例如，在采用能够以一个共同的波长激发的 但是将得到在频谱上分立的发光(例如，其例子例如为量子点)的荧光物 质的组合时。可以在UV内对这些荧光物质进行激发，从而得到处于不同 的相当窄的荧光间隔内的荧光。
在第三实施例中，本发明涉及上述探测系统，例如，根据第一或第二 实施例的探测系统，但是其中，所述探测系统适于采用相同的像素化探测 器探测至少两个不同的具有不同波长的发光辐照束。这样的探测系统可以 每次仅采用单个激发辐照束工作，从而(例如)实现荧光共振能量转移 (FRET)，或者其可以同时采用两个激发辐照束工作。典型地，所述探测 系统将所述激发辐照束聚焦到基质上，以激发样品。所述基质上的激发场 可以具有任何适当的形状。在优选实施例中，其可以具有至少分段的细长 形状，由此，与中高数值孔径物镜的受衍射限制的样点相比，所述基质上的激发场可以充分大。典型地，本实施例的探测系统采用了能够实现两种 颜色探测的滤光器布置，从而可以实现并行读出方案。作为举例，将针对 在基质上生成具有至少分段的细长形状的激发场的探测系统对本实施例进 行说明，但是本发明不限于此，也可以采用其他的基质上的激发场的形状。 ^这样的探测系统中，典型地，可以将相位板或柱面透镜放到激发辐照束 ^3路径内，其在激发辐照束上添加了额外的相结构，从而采用上述标准物 镜在样品上建立了至少分段的激发场，例如，激发点构成的线或细线。根 据本实施例，可以将所得到的来自激发场的发光响应成像到探测单元上， 从而能够并行读出信息。由此，收集来自样品的发光辐照束，并将其引导 到至少部分不同的光学路径上，从而将不同的发光辐照束成像到像素化探 测器的不同区域上。可以将不同的发光辐照束作为并行的发光辐照场一个 叠一个地聚焦到所述像素化探测器上。后面这样做的优点在于，所得到的 每一发光辐照束与用于将发光辐照束聚焦到探测器上的第二光学元件(例 如，折射元件)的平均距离小。后面这样做的有利之处还在于，对第二光 学元件(例如，折射元件)的要求不那么高。或者，可以将发光辐照束作 为按一条线排列的相邻发光辐照场聚焦到像素化探测器上。后面这样的操 作对于降低有可能在对两个并行分隔的发光场执行发光探测时产生的拖影
(smear)是有利的，即，可以由不同的发光辐照束获得同时存在的区别的 发光信息。但是，其对用于将发光辐照束聚焦到探测器上的第二光学元件
(例如，折射元件)提出了更为严格的要求，因为这时采用了更宽的透镜 视野，并且在与光学元件的光轴的距离更大时往往产生更大的像差。将针 对图6所示的示范性探测系统对本实施例进行说明，图6示出了探测系统 的照明收集部分。采用二向色反射镜31将从样品6收集的发光辐照束与经 反射的激发辐照分隔开。所述发光辐照束通过二向色反射镜31，并可使用 任选滤光器67进一步提纯，以剔除(例如)激发光，并提高信噪比。之后， 可以采用二向色反射镜60将发光辐照束分成两个辐照束，每一辐照束具有 特定波长或波长范围。在本例子中，第一发光辐照束被反射，并且在任选 通过带通滤光器62之后，被倾斜反射镜61引导至像素化2D探测器。倾斜 反射镜61相对于二向色反射镜60稍微成一角度。在被所述反射镜61反射 之后，所述光再次由二向色反射镜60进行反射。然后所述光相对于光轴以
23第一小角度进入第二光学元件(例如折射元件)，即聚焦透镜65，使得所述
光将被稍微偏离光轴地聚焦在像素化传感器66上。第二发光辐照束通过二 向色反射镜60并可以借助光学带通反射镜63进行过滤。然后该光被放置 成小角度的反射镜64反射，之后再次通过二向色反射镜60。其相对于光轴 以第二小角度进入第二光学元件(例如折射元件)，即聚焦透镜65，所述第 二小角度与第一小角度不同，因此其被聚焦在摄像机上稍微不同的位置处。 为了减小激发辐照的影响，可以在位置67处使用单个滤光器，其允许两个 发光辐照束通过而不允许激发辐照束通过，或者可以在位置62和63处设 置处于不同波段的两个分立滤光器。第一种选择的优点是仅在容易接近的 位置需要单个滤光器，而第二种选择实现了对两个发光辐照束的较好分离。 需要指出的是，如果仅使用二向色反射镜60来分离两个发光辐照束，则二 向色反射镜的性能通常不如好的带通滤光器，从而产生较大的串扰。这种 设置的缺点是可能难以处理滤光器的位置。需要注意的是，上述设置仅是 示范性的，很多不同设置可以产生根据本实施例的可能的并行读出方案。 这种布置允许在相同的摄像机上对两个具有不同波长或波长范围的不同辐 照束成像。图6的插图示出了两种可能的布置。在图6 (a)中描绘出第一 优选实施例。在摄像机上对具有至少分段细长形状的发光辐照场进行水平 方向成像。在这种布置中，反射镜60、 61和64的取向是这样的，即将来 自两个发光辐照束的线彼此相邻，其平行且相邻或成一直线。这种布置的 优点是在读出期间，两个发光辐照场将不会通过探测器的相同区域。因此 可以连续地照射样品。缺点可能是需要较大数量的水平方向像素。此外， 由于信息散布于较大面积上，因此第二光学元件(例如折射元件)，例如聚 焦透镜65应当具有大的视野以防止边缘上的像差。
图6 (b)中所示的第二种布置借助平行且堆叠地设置两个发光辐照场 (不成一条直线)克服了这些问题。因此，它们都距聚焦透镜65的光轴较 近，从而减小了像差。缺点是在阵列读出期间，第一发光辐照束的信息将 会通过聚焦第二发光辐照束的区域。为了防止拖影，人们必需要将所述数 据快速移动通过该区域或短暂地遮挡激发光。这些方案可能会干扰甚至防 碍样品的连续读出和移动。
根据第二方面，本发明提供了一种探测基质上发光位点的方法，该方法包括针对至少两个通过相同光学元件(例如折射元件)的具有不同波长 的辐照束进行光学像差校正，所述至少两个具有不同波长的辐照束将要聚 焦在基质上或将要从基质进行收集。这种探测发光位点的方法通常包括产 生至少一个激发辐照束以激发基质上的发光位点。所述至少一个激发辐照 束可以是多个激发辐照束，例如为两个、三个或更多激发辐照束以允许激 发不同的标记。可以同时生成多个激发辐照束，或者，可以选择具有最适 当激发行为，例如最适当的激发波长或波长范围的激发辐照束以供使用。 该方法还包括利用单个光学元件(例如折射元件)对至少两个具有不同波 长的辐照束进行引导(例如进行折射)，其中所述两个辐照束可以是要聚焦 在基质上的激发辐照束、要从基质上的受激发的发光位点收集的发光辐照 束、或其组合。通常为至少两个具有不同波长的不同辐照束使用单个光学 元件(例如折射元件)，从而在至少一个辐照束中引起光学像差。因此，根 据本发明的方法还包括对至少两个具有不同波长的辐照束之一进行以便减 少，或如果可能的话完全补偿光学像差。通常，对至少两个具有不同波长 的辐照束之一进行的所述步骤可以包括在至少两个具有不同波长的辐照束 的至少一个中提供光路差。可以借助于在至少两个具有不同波长的辐照束 的至少一个中引起相移来获得这样的光路差。后面这种做法可以采用光学 补偿器来实现。对至少两个辐照束之一进行调节的所述步骤可以包括选择 光学补偿器的特定部分以便借助于使光学补偿器的特定部分处于辐照束路 径之中进而校正特定的辐照束。例如，可以响应于选择特定的激发辐照束 而选择光学补偿器的特定部分。或者，对至少两个辐照束之一进行调节的 所述步骤可以包括使辐照束同时通过光学补偿器，由此所有辐照束都受到 光学补偿器影响，但对于至少两个辐照束而言影响效果不同。换言之，可 以对不同的辐照束，例如不同的激发辐照束同时进行调节。可以利用在本 发明的第一方面中所述的探测系统来有利地执行根据本发明该方面的探测 方法。在根据第二方面的一个实施例中，本发明涉及如上所述探测基质上 发光位点的方法，其中，产生至少两个激发辐照束，且其中，将至少两个 辐照束进行折射的所述步骤包括将至少两个激发辐照束聚焦在基质上或由 将至少两个激发辐照束聚焦在基质上构成。在本实施例中，对辐照束的至 少一个进行的所述步骤可以是进行如下方式的调节，即在基质上使两个激发辐照束达到公共焦点。
根据第三方面，本发明提供了一种光学补偿器，在使用不同波长探测 基质上的光发射位点时，该光学补偿器用于降低或至少部分补偿光学像差。 更具体而言，将光学补偿器设计成对至少两个具有不同波长或波长范围的 入射辐照束中的至少一个进行调节(例如进行选择性调节)，由此所述光学 补偿器允许调节至少一个辐照束，使得可以利用相同的光学元件(例如折 射元件)将至少两个辐照束聚焦在表面(例如基质)上的相同焦点。这种 表面可以是将要偶合样品的基质的表面，或者，例如是用于探测发光辐照 束的探测器的表面。换言之，所述光学补偿器可以降低或至少部分补偿光 学像差，从而实现具有不同波长或波长范围的辐照束进入公共焦点。通常， 这种光学补偿器针对不同的辐照束引入光路距离(OPD)差，以便校正由 具有不同波长的不同辐照束使用的光学元件(例如折射元件)所引起的光 学像差。此外，也可以对由其他光学元件所引起的光学像差进行校正。例 如可以借助于引入相移而引入光路距离差。这种相移可以是这样的，即对 于辐照束之一而言相移(对27T取模)可以基本为零，或者对于所设计的所 有辐照束而言其可以基本不为零。所述光学补偿器至少部分可以补偿，即 可以降低由多个具有不同波长的辐照束引起的平均光学像差。本发明实施 例的优点是可以与来自光学拾取单元的光学元件接合使用所述光学补偿 器，以便以经济有效的方式运行若干相关的生物测定。所述光学补偿器可 以是任何能够至少部分校正这种光学像差的适当光学补偿器，例如相位板。 例如，所述光学补偿器可以是衍射元件，其对辐照束进行衍射，从而使波
长最短的辐照束被引入基本为0的相位变化(对2tu取模)，而根据一级衍
射使其他辐照束中的至少一个发生衍射。光学补偿器的另一例子可以是(例 如)接近闪耀衍射光栅的具有台阶状剖面的衍射元件，其中，为波长最短 的辐照束选择零级衍射，为其他辐照束中的至少一个选择一级和/或更高级
的衍射。例如，所述光学补偿器5还可以是包括非周期相位结构(NPS)的 用于降低或至少部分补偿所述辐照束中的至少一个的波前像差的光学元 件，其中，所述相结构具有双折射材料且具有非周期性台阶状剖面。光学 补偿器5的另一个例子是以提供了与额外的径向表面轮廓相叠加的跨越其 宽度引入了恒定相位的基本径向区轮廓的非周期相位结构(NPS)为基础的，
26其中，所述非周期相位结构引入可变相位。在这一示范性光学补偿器中， 由光学补偿器引入的相位变化可以对于所有辐照束而言不为零，因而有可 能对一个辐照束引入小的像差，但是在考虑针对所有辐照束的光学像差时， 则改善了平均像差量。再一种光学补偿器可以是基于液晶的使用。需要注 意的是，只是通过举例说明的方式提供了上述光学补偿器的例子，本发明 不限于此。可以以与光学补偿器补偿的光学元件分离开(例如与物镜透镜 分离开)的元件的形式提供光学补偿器。需要注意的是，也可以将光学补 偿器直接放置在光学元件的本体(例如透镜本体)上。本发明的具体实施 例的优点在于，所用的光学补偿器不依赖于根据不同辐照束的不同衍射级 的衍射，因而不会在所要校正的不同像差之间带来任何关联。
该光学补偿器可以同时为不同的辐照束减轻或至少部分补偿光学像 差，或者所述光学补偿器可以包括不同的部分，通过调节每一部分来降低 或至少部分补偿具有特定波长或波长范围的辐照束的像差。例如，所述光 学补偿器可以(例如)是包括不同部分的相位轮，其中的每一部分用于补 偿或降低具有不同波长或不同波长范围的不同辐照束的光学像差。可以为 一些光学补偿器，例如基于液晶的光学补偿器或相位轮提供控制机构，所 述控制机构适于根据选定的辐照束选择所述光学补偿器的给定部分，并使 之进入辐照束路径。
在特定例子中，.作为举例示出了根据本发明第三方面的光学补偿器， 但本发明不限定于此。所提供的光学补偿器允许降低三个具有不同波长或
波长范围的激发束的光学像差。所述光学补偿器典型地包括平坦的基底基
质，在所述基质上形成非周期相位结构(NPS)。 NPS包括一系列具有不同 高度的环形区域，每个环形区域都被高度受到控制的离散台阶分隔开。NPS 的这些区域在整个区域中引入恒定的相位，并且以这样的方式选择这些区 域，即在台阶位置处，所述区域对于例如三个辐照束中选定的一个的波长 而言基本不可见。换言之，可以找到这样的台阶，其对于所述波长中的一 个而言增加了相位，所述相位(对2兀取模)等于零。选择区域的宽度和台 阶的高度以为其他两个波长提供期望的像差补偿。将这种区域的高度hj (区 摔j在基质的基底表面上方的高度)设计成等于其中，mj为整数，人为波长，m为制造NPS的材料在该波长下的折射率。 在NPS与空气交界的情况下，上述等式成立；该界面也可以介于两种不同 材料之间，在这种情况下分母变为(n厂ri2)。在另一个例子中，NPS结构的 每个区域除了基本径向区域剖面之外还包括叠加在NPS的每个区域之内、 或至少一些区域之内的基本区域剖面上的额外径向表面剖面，以增加可变
相位。区域的这一额外径向表面剖面在其径向宽度范围内提供区域内的高 度变化。该额外径向表面剖面是非衍射的。区域内每个高度变化都远小于 各区域之间的高度变化，可以将区域平均高度与其相邻区域平均高度之间 的高度变化用作所述各区域之间的高度变化。区域内的每个高度变化通常 最多为区域平均高度与其相邻区域平均高度之间高度变化的一半。所述额 外径向表面剖面具有如下效果，即进一步降低具有不同波长的辐照束中的 至少一个(更优选两个)的残余像差(典型为球面像差)，同时为通常针对 其优化透镜设计的一个波长引入可接受的像差。或者，透镜设计可能对于 任何波长都不是最优的。在每个区域中额外径向表面剖面可以相同或不同。 结果，每个波长的峰峰残余光路差(OPD)优选小于0.5个波长，更优选小 于0.4个波长，更优选小于0.333个波长。此外，至少两个波长的最大残余 OPD优选小于0.333个波长，更优选小于0.2个波长。然而，每个波长还有 残余的高级像差。因此，每个波长的峰峰残余OPD通常至少为0.05个波长， 可以至少为0.1个波长，甚至至少为0.2个波长。在另一个例子中，将每个 NPS区域之内的表面制作为非球面，以便进一步降低具有所述波长的至少 一个(更优选为两个)的残余像差，同时为针对其优化光学元件(例如透 镜)设计的一个波长引入可接受的像差。在这种情况下，由额外径向表面 剖面提供的径向高度变化包括逐渐变化的高度变化，其从区域最内部分处 的零点开始，结束于区域最外部分处最大的高度变化量。最大高度变化的 大小远小于各区域之间的高度变化。例如，在利用针对^优化的透镜来补 偿具有波长^<X2<a3的辐照束的系统中可以使用的典型台阶高度可以处于 如下范围内
28= m氺H--^
"1 -1 ，其中-0.4〈A〈0.4 (2)
其中，in为整数。作为举例，图7示出了可能的非周期相位结构的径向剖 面，可以将其用于降低三个具有不同波长的不同辐照束的光学像差，在该 例子中波长为408nm、 660nm和790nm。需要指出的是，为了计算每个区 域中使用的额外径向表面剖面，可以使用评价函数(merit fUnction)。分别 针对每个径向位置确定最佳的局部区域高度。为了实现这个目的，改变局 部区域的高度并针对每个局部区域高度确定评价函数。具有最低评价的局 部区域高度具有最高质量，并被选作该半径的最佳局部区域高度。 一个波 长(^， X2， X3)是在残余OPD接近零的时候质量高，然而，评价函数考 虑到了每个波长的质量，并对各质量进行平衡以提供由评价函数测量的最 高总体质量。从必需要校正的OPD减去因区域高度造成的OPD，并取该值 的小数部分，从而计算残余OPD，使得所有残余OPD介于一0.5个波长和 十0.5个波长之间。可以使用的评价函数例子如下
评价=(f^ * )+ (f^ * wo尸z)义)+ (『a *及o尸z)义) (3 )
在方程(3)中，ROPDu、 ROPDu和ROPDw为不同辐照束的残余OPD。 将它们增大到给定的正偶次幂，在该例子中为4次幂，以确保一个波长下 的高残余OPD在结构的光损失方面比其他波长下的低残余OPD差得多。 利用加权因子Wn，可以对每个辐照束的贡献进行加权。评价函数选择最优 解，使得每个波长、或至少两个波长的峰峰残余OPD优选小于0.5个波长、 更优选小于0.4甚至更优选小于0.333个波长。
根据第四方面，本发明提供了一种设计光学补偿器的方法，该方法使 得光学补偿器能够降低至少两个具有不同波长或波长范围的入射辐照束中 的至少一个中的光学像差，所述入射辐照束将要在用相同的光学元件(例 如折射元件)聚焦时聚焦于基质上的相同焦点。换言之，本发明提供了一 种设计根据本发明的第三方面光学补偿器的方法。通过设计光学补偿器从 而引入这种特征，由此使至少两个入射辐照束的光路差是这样的，即使在 由单个光学元件(例如折射元件)聚焦时所述辐照束有公共的焦点。这样 的特征例如可以是在相位板中引入的非周期相位结构，由此可以考虑到对 于至少两个入射辐照束而言光路不同，考虑到在由单个光学元件(例如折射元件)聚焦时辐照束的公共焦点，，来优化这些特征的高度。通常，这种
方法包括获取有关辐照束波长或平均波长的信息；获取有关用于聚焦辐照 束的光学元件(例如折射元件)的位置和光学特性的信息；以及计算光学 补偿器的最佳特征参数，使得考虑到要为由单个光学元件(例如折射元件) 聚焦的辐照束获得相同焦点的情况下降低辐照束的光学像差。可以借助于 利用预定算法、利用神经网络、或以任何其他适当方式进行仿真来获得最 佳特征参数。可以以自动和/或自动化的方式进行。
根据本发明的第四方面的上述设计方法可以被实现为诸如图8中所示 的处理系统700。图8示出了处理系统700的一种配置，其包括至少一个耦 合到存储器子系统705的可编程处理器703，所述存储器子系统705包括至 少一种形式的存储器，例如RAM、 ROM等。可以包括存储子系统707，其 具有至少一个盘片驱动器和/或CD-ROM驱动器和/或DVD驱动器。在一些 实现中，可以包括显示系统、键盘和指点装置，作为提供给用户进行手工 输入信息的用户接口子系统709的一部分。还可以包括用于输入和输出数 据的端口。可以包括更多元件，例如网络连接、与各种装置的接口等，但 图8中未示出。可以用各种方式耦合处理系统700的各种元件，所述方式 包括经由图8中所示的总线子系统713，为简单起见图8中为单个总线，但 本领域的技术人员应当理解，其包括至少一条总线的系统。存储器子系统 705的存储器有时可以保持一组指令的部分或全部(在711所示的任一种情 况下)，所述指令在处理系统700上执行时实现本文所述的设计方法的各步 骤。于是，尽管如图8所示的处理系统700为现有技术，但是包括实现用 于设计光学补偿器的方法的各方面的指令的系统不是现有技术，因此图8 未被标注为现有技术。
需要指出的是，处理器703或各处理器可以是通用或专用处理器，且 f以包括在例如具有执行其他功能的其他部件的芯片的装置中。因而，可 以在数字电子电路或计算机硬件、固件、软件或其组合中实现本发明的一 个或多个方面。此外，可以在计算机程序产品中实现本发明的各方面，该 计算机程序产品确实嵌入在承载供可编程处理器执行的机器可读代码的载 体介质中。术语"载体介质"是指任何参与向处理器提供指令以进行执行 的介质。这种介质可以采取很多形式，包括但不限于非易失性介质和传输介质。非易失性介质例如包括光盘或磁盘，例如作为海量存储器的一部分 的存储装置。易失性介质包括海量存储器。易失性介质包括动态存储器，
例如RAM。计算机可读介质的普通形式例如包括软盘、柔性盘、硬盘、磁 带或任何其他磁性介质、CD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡、纸带、 任何其他带孔的图案的物理介质、RAM、 PROM、 EPROM、闪速EPROM、 任何其他存储器芯片或盒式磁带、如下文所述的载波、或任何计算机可以 从其读出内容的其他介质。在承载一个或多个包括一个或多个指令的序列 以供处理器执行期间可以涉及到各种形式的计算机可读介质。例如，最初 :口了以在远程计算机的磁盘上承载所述指令。所述远程计算机可以将所述指 令加载到其动态存储器中并利用调制调解器通过电话路线将所述指令发送 出去。计算机系统本地的调制调解器可以接收电话路线上的数据并利用红 外线发射机将数据转换成红外信号。耦合到总线的红外线探测器可以接收 红外信号中承载的数据并将数据置于总线上。总线将数据输送到主存储器， 处理器从主存储器检索和执行指令。可以任选地将主存储器所接收的指令 在处理器执行之前或之后存储在存储装置上。还可以经由网络中的载波传 输指令，所述网络例如为LAN、 WAN或因特网。传输介质可以采取声波或 光波的形式，例如在无线电波和红外数据通信期间产生所述声波或光波。 》输介质包括同轴电缆、铜线和光纤，包括包含计算机中的总线的线。
本发明的应用可以在分子诊断领域中临床诊断、即时诊断、高级生 物分子诊断研究、生物传感器、基因和蛋白质表达阵列、环境传感器、食 品质量传感器等。本发明允许在成本有效的封装中进行大量有用的生物测 定。
还可以将多种显色标记用于微阵列技术，流式细胞计，由于两种显色 染料分子的电子激发态之间的相互作用而发生的基于荧光共振能量转移 (FRET)的探测，诸如实时核酸探测和实时PCR定量的基于分子信标的探 测技术，诸如表面增强拉曼光谱法(SERS)、表面增强荧光(SEF)或表面 增强共振拉曼光谱法(SERRS)的表面增强探测技术，微流体探测等。
在优选实施例中，本发明的探测系统为落射荧光(epi-fluorescence)生 物传感器，这意味着光从上方入射到表面上，但它也可以是透射生物传感 器，这意味着光从下方入射并透射通过微阵列。如上所述，本发明的实施例提供或使用用于探测方法的光学补偿器， 该探测方法涉及到多个要聚焦到公共焦点的波长。在当前的高吞吐量分子 诊断中，需要同时探测多个标记，本发明为其提供了一种成本有效的方案。 这些可激发标记产生的波长位移会产生多个一般与辐照束不同的波长，如 果目标是对单独的标记进行敏感性探测，则对于辐照束而言像差校正很关 键。
本发明的具体实施例的优点在于，可以同时使用和探测不同的标记， 因为目前借助于提供经恰当设计的光学补偿器降低或至少部分补偿了多波 长探测系统通常会发生的光学像差。
对于本领域的技术人员而言，用于实现体现本发明的进行多波长聚焦 的物镜的其他布置是显而易见的。应当理解的是，尽管本文针对根据本发 明的装置和方法讨论了优选实施例、特定构造和配置以及材料，但是在不 脱离本发明范围和精神的情况下可以做出各种形式和细节上的改变和修 正。
权利要求
1、一种用于探测基质(6)上的发光位点的探测系统(100)，所述探测系统(100)包括-辐照单元(102)，其用于产生至少一个激发辐照束以激发所述基质(6)上的发光位点，-第一光学元件(25)，其适于接收至少两个具有不同波长或波长范围的辐照束，所述至少两个辐照束为要聚焦在基质上的激发辐照束和/或要从所述基质(6)上的受激发发光位点收集的发光辐照束，以及-光学补偿器，其用于对所述至少两个具有不同波长或波长范围的辐照束中的至少一个进行调节，以便至少部分补偿光学像差。
2、 根据权利要求1所述的探测系统(100)，所述辐照单元(102)适 于产生至少两个具有不同波长或波长范围的激发辐照束，所述第一光学元 件(25)适于接收所述至少两个激发辐照束。
3、 根据权利要求1所述的探测系统(100)，所述光学补偿器(5)至 少在所述辐照束之一中引入相移。
4、 根据权利要求2所述的探测系统(100)，其中，所述光学补偿器(5) 至少在所述激发辐照束之一中引入相移以将所述激发辐照束聚焦于所述基 质上的相同焦点。
5、 根据权利要求1所述的探测系统(100)，其中，所述光学补偿器(5) 和所述第一光学元件(25)为分立元件。
6、 根据权利要求1所述的探测系统(100)，其中，所述光学补偿器(5) ，并入所述第一光学元件(25)中。
7、 根据权利要求2所述的探测系统(100)，所述探测系统适于选择要在某一时刻使用的所述至少两个辐照束之一。
8、根据权利要求1所述的探测系统(100)，其中，所述辐照单元(102) 适于同时产生所述至少两个激发辐照束中的至少两个。
9、 根据权利要求8所述的探测系统(100)，其中，所述探测系统还包 括探测单元，所述探测单元至少具有探测器元件和光学元件，所述光学元 件用于将所述至少两个发光辐照束作为平行发光辐照场而聚焦在所述探测 器元件上。
10、 根据权利要求8所述的探测系统(100)，其中，所述探测系统还 包括探测单元，所述探测单元至少具有探测器元件和光学元件，所述光学 元件用于将所述至少两个发光辐照束作为呈一条线排列的相邻发光辐照场 而聚焦在所述基质(6)上。
11、 根据权利要求1所述的探测系统(100)，所述探测系统包括探测 单元，其适于同时探测来自所述发光位点的不同发光辐照束，所述不同发 光辐照束的每一个具有基本不同的波长。
12、 根据权利要求2所述的探测系统(100)，所述至少两个激发辐照 朿为平均波长分别处于760nm到800nm、 640nm到680nm以及380nm到 420nm的波长范围内的第一、第二和第三辐照束。
13、 一种用于对至少两个具有不同波长或波长范围的入射辐照束中的 至少一个进行调节的光学补偿器(5)，所述光学补偿器适于利用相同的光 学元件将所述至少两个入射辐照束聚焦于基质上的相同焦点。
14、 根据权利要求13所述的光学补偿器(5)，所述光学补偿器(5) 受非周期相位结构的调节。
15、 根据权利要求13所述的光学补偿器(5)，其中，所述光学补偿器 (5)为具有不同非周期相位结构的相位轮，所述至少两个辐照束布置成通过所述相位轮。
16、 一种用于探测基质(6)上的辐射位点的方法(200)，所述方法(200) 包括产生至少一个激发辐照束以激发所述基质(6)上的发光位点， 对至少两个具有不同波长或波长范围的辐照束进行引导，所述至少两个辐照束为要聚焦在所述基质上的激发辐照束和/或要从所述基质(6)上的受激发发光位点收集的发光辐照束，对所述至少两个具有不同波长或波长范围的辐照束之一进行调节，以便至少部分补偿光学像差。
17、 根据权利要求16所述的方法(200)，其中 产生至少一个激发辐照束的所述步骤包括产生至少两个激发辐照束， 对至少两个辐照束进行引导的所述步骤包括将至少两个激发辐照束聚焦在所述基质(6)上，以及对所述至少两个辐照束之一进行调节的所述步骤包括调节所述至少两 个激发辐照束中的至少一个以在所述基质(6)上产生公共焦点。
18、 一种用于设计光学补偿器(5)的基于计算机的方法(300)，所述 方法(300)包括-获取有关至少两个具有不同波长或波长范围的辐照束中每一个的波长 或平均波长的信息，-获取有关用于聚焦所述至少两个辐照束的光学元件的位置和光学特性 的信息，以及-考虑到要为由所述单个光学元件聚焦的所述至少两个辐照束获得相同 焦点，确定光学补偿器的最佳特征参数，使得降低所述至少两个辐照束的 光学像差。
19、 一种计算机程序产品，其用于执行根据权利要求18所述的方法。
20、 一种机器可读数据存储装置，其存储根据权利要求19所述的计算 机程序产品。
21、 根据权利要求19所述的计算机程序产品通过局域或广域电信网络 的传输。
全文摘要
描述了一种用于探测基质(6)上的发光位点的探测系统(100)。所述探测系统(100)通常包括辐照单元(102)，其用于产生至少一个激发辐照束以激发基质(6)上的发光位点。所述至少一个激发辐照束可以是多个激发辐照束。所述探测系统(100)还包括第一光学元件，例如折射元件(25)，其适于接收至少两个具有不同波长或波长范围的辐照束，所述至少两个辐照束为要聚焦在基质上的激发辐照束和/或要从所述基质(6)上的受激发发光位点收集的发光辐照束。所述探测系统(100)还包括光学补偿器，其用于对所述至少两个具有不同波长或波长范围的辐照束中的至少一个进行调节，以便降低或补偿光学像差。本发明还涉及一种对应的探测方法、一种相位板和一种用于设计这种相位板的方法。
文档编号G01N21/64GK101490533SQ200780027374
公开日2009年7月22日 申请日期2007年7月5日 优先权日2006年7月20日
发明者E·M·H·P·范戴克, M·I·博安法, R·温贝格尔-弗里德尔 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司