评估类风湿性关节炎患者疾病进展的风险的制作方法

专利名称：：评估类风湿性关节炎患者疾病进展的风险的制作方法评估类风湿性关节炎患者疾病进展的风险本发明涉及帮助进一步评估患有类风湿性关节炎患者的体外方法。该方法特别用于评价RA患者是否处于疾病进展的风险中。该方法例如通过分析生化标记物实施，包括测定样品中至少c-反应蛋白(CRP)和白介素-6的浓度并将测定的浓度与RA潜在的快速进展形式的可能性相关联。处于快速进展疾病的高风险中的患者可以是需要治疗或者如果已经治疗还需要不同的和更有效治疗的患者。本发明还涉及包含C-反应蛋白和白介素的标记物组在评估患有类风湿性关节炎的患者中的用途，以及教导了分别用于实施本发明方法的蛋白阵列装置和试剂盒。类风湿性关节炎("RA")是慢性、炎性、全身性疾病，其最突出的表现产生于受侵袭的关节，特别是手和脚的关节。类风湿性关节炎的发病可以緩慢发生，从数周到数月，或者症状可以急性方式快速显现。RA具有世界性的分布并且涉及所有的种族群体。虽然疾病可以发生于任何年龄，但患病率随着年龄增加并且发病率高峰在40岁到60岁之间。北美人口患病率估计从0.3%到1.5%不等。如今，仅在美国超过2,500,000个体被诊断患有类风湿性关节炎，某些统计显示650万到800万的人可能患有该疾病。通常受侵袭的女性比男性多2-3倍。类风湿性关节炎的早期症状主要是关节特异性的，例如伴有关节肺胀或压痛的疼痛的关节，但也可以包括诸如僵硬、发热、皮下结节和疲劳的非特异性表现。非常的特征是关节的对称性受累。最常受侵袭的是手、脚、膝和腕的关节，最终累及髋、肘和肩。随着疾病的进展，任何类型的运动都变得非常疼痛和困难，最终导致受累关节的功能的丧失。类风湿性关节炎更严重的情况会导致剧烈疼痛和关节破坏。为了緩解疼痛和与关节炎有关的关节破坏导致的运动丧失每年实施300,000例骨和关节置换术。最广泛使用的分类RA的体系是美国风湿病学会于1987年修订的用于RA分类的标准(Arnett,F.C.,等，ArthritisRheum.31(1988)315-324)。根据这些标准(称为ARA标准)，如果患者满足下列七个标准中的至少四个，其中标准1-4必须存在至少6周，则患者被诊断为患有RA:l)晨僵至少一小时，2)3个或更多关节部位的关节炎，3)手关节的关节炎，4)对称性关节炎，5)类风湿性结节，6)血清类风湿因子("RF"),和7)放射学改变。这些标准具有大约90%的灵敏度和特异性。RA的组织学改变不是疾病特异性的，但主要取决于所涉及的器官。初期的炎性关节损伤累及滑膜。如通过电镜法证实的，最早期的改变是滑液的微脉管系统损伤，伴有内腔闭塞、内皮细胞肿胀以及内皮细胞间隙。这个阶段通常伴有表皮衬细胞层的轻度增殖。两种细胞类型构成滑膜衬里骨髓衍生型A滑膜细胞，其具有巨噬细胞特性，和间质型B滑膜细胞。两种细胞类型均导致滑膜增生，暗示这两种细胞类型之间的旁分泌相互作用。这个阶段的炎症与充血、水胂和纤维蛋白渗出有关。细胞浸润发生于早期疾病并且开始主要由T林巴细胞组成。由于炎症，滑膜因血管和滑液成纤维细胞增殖和滑液衬层的增加和增大而变得肥大。肉芽组织延伸至软骨称为血管翳。该组织在滑膜和骨的边缘积极地侵袭并破坏关节周围的骨和软骨，称为侵蚀性RA。RA的关节表现可以分为两类与炎性滑膜炎有关的可逆的征兆和症状以及滑膜炎引起的不可逆的结构性损伤。这种概念不仅对疾病分期和决定预后是有用的，对选择药物和手术治疗也是有用的。典型的患者中的结构性损伤通常开始于疾病第一年和第二年间的某些时间(丽derHeijde,D.M.，等，Br.J.Rheumatol.34,S叩pl.2(1995)74-78)。虽然滑膜炎往往遵循波动的方式，但结构性损伤随着在先滑膜炎的量的线性函数进展。RA中早期症状的病因学仍然难以确定。如今自身免疫部分已被广泛接受但其它因素仍然存在争议。已经极力推行了细菌或病毒感染的可能性。所有通过分离、电镜法或分子生物学将传染原与RA相联系的努力都失败了。可能没有RA单一的原发性诱因，不同的机制会导致初期的组织损伤并促成滑膜炎症。滑膜炎的临床征兆可以是敏感并且常常是主观的。发热的、肿胀的、明显发炎的关节通常只能在炎性滑膜炎最活跃的阶段观察到。软骨损伤和关节周围骨的侵蚀是结构性损伤的特征。与结构性损伤相关的临床特征的标志为功能上和解剖上的进行性退化。关节的结构性损伤是不可逆的和累加的。纵向临床和流行病学研究的数据为治疗提供了指导。这些研究强调l)需要早期诊断，2)预后因素的鉴别，以及3)早期有力地治疗。更早的诊断和治疗，优选在症状出现后的前几个月，可以帮助预防不可逆的关节损伤。类风湿性关节炎的有效治疗通常包括药物的组合、运动、休息和适当的关节保护治疗。非甾体抗炎药、皮质激素、金盐、曱氨喋呤和全身性免疫抑制剂被广泛地用于减少炎症和关节破坏。但是，类固醇和免疫抑制剂的应用在毒性和对可能的致命症状的易损性方面具有显著的风险和副作用。最近基于"生物制剂"的治疗引入到RA治疗中。这种疗法，例如，是对抗显著减少炎症的TNF-a的可溶性受体或抗体。虽然非常具有前景，但由于高昂的成本生物制剂仍处于有限的使用中。建立诊断或评估疾病进展的风险的理想方案是单一事件或病变会引起各自的疾病的情况，例如在感染性疾病中。在其他所有情况中正确的诊断是非常困难的，尤其是当疾病的病因学没有被完全理解的时候，如针对RA的情形。因此在RA中，通常不同的临床症状和生物学标记物会一起考虑用于RA的诊断或评估疾病进展的风险。用于帮助RA诊断的第一种生化标记物并且唯一广泛接受的标记物(参见上述ARA-标准)是血清中检测到的类风湿因子(RF)。最近已经引入新的称为抗-CCP的标记物。已经证实在许多独立的研究中环瓜氨酸肽的自身抗体(抗-CCP)代表了用于RA的诊断的高敏感性和特异性标记物。在过去的几年中几组研究人员对抗-CCP进行了深入的研究(参考，例如，WO98/08946;WO98/22503;WO99/28344;WO99/35167;WO01/46222;和WO03/050542)。最近Schdlekens和同事(Schellekens，G.A.，ArthritisRheum.43(2000)155-163)报道与使用线性肽的相同测定相比，基于特异性环瓜氨酸肽(CCP)的ELISA-试验对于RA诊断准确度显示优越的性能特性。对抗CCP的自身抗体，即最可能与患者血清中的瓜氨酸多肽循环反应的和在体外测定中结合CCP的抗体称为"抗-CCP"。VanVenroji等的专利申请(WO98/22503)描述了某些瓜氨酸肽并证实环化导致自身抗体对这些肽提高的反应性。与相应的线性肽的36%相比，通过使用改善的CCPs作为抗原用于检测抗-CCP抗体，灵敏度可以提高到63%。98/22503中建议了肽的组合以进一步改善测定。许多研究小组近来显示并证实与RF相比，抗-CCP是建立RA诊断更敏感和特异性的标记物。抗-CCP自身抗体对RA是高度特异性的(约97%特异性)，具有可与RF(65-80%)相比的灵敏度(Lee,D.M.和Schur,P.H.,Ann.Rheum.Dis.62(2003)870-874;Pruijn,G丄M.,等，Curr.Rheumatol.Rev.l(2005)1-7;Vallbracht,I.，等，Ann.Rheum.Dis.63(2004)1079-1084)。此外具有额外诊断价值的是抗-CCP可以在显著比例的血清反应阴性的RA患者中检测到(vanPaassen,P.,等，BestPract.Res.Clin.Rheumatol.17(2003)475-494;Vallbracht,I.,等,Ann.Rheum.Dis.63(2004)1079-1084;Schellekens,G.A.，等，ArthritisandRheumatism43(2000)155-163)。这意味着抗-CCP自身抗体存在于显著比例的对RF(血清)阴性的患者中。如上文讨论的，建立RA诊断和决定最佳的治疗选择不是容易的任务。个体RA患者中病程显著不同。迄今为止对RA中差结果没有唯一的和广泛接受的指标。与预后不良有关的指标包括，例如累积关节炎症、高ESR或CRP水平、RF阳性、早期放射学侵蚀、更差的功能分数和不利的社会经济状况。使情况更加复杂的是，评估RA的预后还缺乏清楚的和广泛接受的疾病进展的定义。为了评估RA中的治疗反应开发了一些评分-根据临床症状、影像改变或者身体功能。但是，大多数评分仅用于临床试验设置，而很少或完全不用于风湿病学实践中。实例是美国风湿病学会(ACR)和欧洲防治风湿病联盟(EULAR)设计的不同反应标准(Felson，D.T.,等，ArthritisandRheumatism38(1995)727-735;vanGestel,A.M.,等，ArthritisandRheumatism39(1996)34-40)。ACR改善标准和EULAR反应标准都广泛地用于临床试验设置，但没有用于临床实践中。对用于根据Sharp或Larsen及其迄今可得到的一些变体的放射学改变的评估的评分系统情况也是如此。虽然X-射线被用于每隔一定间隔监测放射学疾病进展，它们只是与以前的X-射线比较但不评分。此外，在欧洲DAS(疾病活性评分)及其简化版(DAS28、SDAI、CDAI)广泛地用于处于治疗中的疾病监测。DAS包括触痛和肺胀的关节计数、ESR或CRP和疾病活性的整体评估(使用VAS-直观类比标度)。在很小的程度上躯体功能的评估在疾病状态的监测中也起作用。这些是基于不同患者的问巻调查-RA中最广泛使用的是HAQ(健康评估问巻)(Bruce，B.和Fries,J.F.,HealthQualLifeOutcomes1(2003)20)和SF-36(简表36)(Talamo,J.，等，BriU.Rheumato1.36(1997)463-469)。但是，上文提及的工具远不是最佳的。它们费时并且受到主观评定的影响，例如，在HAQ或触痛/肿胀的关节计数的情况中。最近，已经进行了尝试通过在这种评估中包括更多的生化标记物以进一步评估RA不同的方面，或者甚至将这种评估基于生化标记物。Coste,J.等(TheJournalofRheumatology24(1997)28-34)研究了二十个临床和实验室参数预测RA中关节破坏的能力。发现铁、CRP、ESR和al-酸糖蛋白与疾病进展的统计学显著相关性。但是，相关性不是非常强并且只存在于随访的前6个月。Aman，S,等Rheumatology39(2000)1009-1013研究了RA中疾病进展是否可以通过标记物IC丁P、RF和CRP预测。他们发现对于个体标记物优势比为2.6-3.9,最好的标记物比率具有9.1的优势比。该优势比在77%的灵敏度下转化为71%的特异性。但是，71%的特异性是相当低的，因为在临床常规中需要至少80%,或优选甚至至少90%的特异性。Vissse，H，等ArthritisandRheumatism46(2002)357-365，提出了"持续性(侵蚀)关节炎的预测模型"。他们的模型由包含7个变量的发展预测模型组成初诊时症状持续时间、晨僵^1小时、23处关节的关节炎、跖趾关节两侧压迫性疼痛、类风湿因子阳性、抗环瓜氨酸肽抗体阳性以及侵蚀(手/脚)的存在。可见两种生化标记物，RF和抗-CCP，形成他们的算法一部分。最近,Meyer,O,等(ArthritisResearchandTherapy8/2(2006)R40),提出在随访五年后使用抗-CCP自身抗体的系列测定来预测放射学结果。他们证实在基线处抗-CCP测定不是疾病进展的充分预测因子。但是，在基线处进展预测中的帮助正是从业医生所需要的。然而RF和抗-CCP都是建立RA诊断的重要工具，它们似乎不是7预测未来病程中的有力帮助。已经提出了许多标记物或许多组标记物，但是迄今所获得的优势比还不充分或者基于太多种类的生化和临床参数而不能满足临床常规需要。因此，存在对特别是基于生化参数，帮助评估RA患者是否处于疾病进展的风险中的方法的巨大的需要。现已惊奇地发现CRP和白介素-6两种标记物互相补充并因此导致在患者经历更严重RA病程的风险评估中的改善。通过提供体外评估RA患者是否处于疾病进展的风险中的方法和试剂，预期本发明至少部分克服评估RA患者是否处于疾病进展的风险中的领域中存在的问题。发明概述本发明涉及帮助评估患有类风湿性关节炎(RA)的患者疾病进展的风险的方法，该方法包括获得液体样品、测定所述样品中C-反应蛋白(CRP)和白介素-6以及4壬选的一种或多种其^f也标记物的浓度、以及将测定的CRP和白介素-6以及任选的一种或多种其他标记物的浓度与疾病进展的风险相关联的步骤。还/>开了包括至少CRP和白介素6的标记物组在评估患有RA的患者疾病进展的风险中的用途。进一步地本发明涉及实施帮助评估患有类风湿性关节炎的患者疾病进展的风险的方法的试剂盒，如本发明公开的这种试剂盒包括分别特异性测定CRP和白介素-6所需的试剂，以及任选的实施测定的辅助试剂。还公开了用于评估患有类风湿性关节炎的患者疾病进展的风险的，包括至少合适的用于CRP和白介素-6测定的特异性结合配偶体(partner)以及任选的合适的一种或多种其他标记物的特异性结合配偶体的蛋白阵列装置。发明详述在第一个优选的实施方案中本发明涉及帮助评估患有类风湿性关节炎(RA)的患者疾病进展的风险的方法，该方法包括步骤a)获得液体样品，b)测定所述样品中C-反应蛋白(CRP)和白介素-6以及任选的一种或多种其他标记物的浓度，和c)将步骤(b)中测定的浓度与疾病进展的风险相关联。如本文使用的，每一个下列术语具有在本部分中与其相关的含义。本文使用的冠词"一种(个)"是指一种(个)或多于一种(个)(即至少一种(个))该冠词的语法对象。例如，"一种标记物"是指一种标记物或多于一种标记物。本文使用的术语"标记物"是指生化以及临床标记物。术语标记物和参数可以互换使用。本文使用的"生化标记物"或"生物标记物"是指作为目标用于分析患者测试样品的生物分子。这种分子目标的实例是核酸、蛋白或多肽本身以及存在于样品中的抗体。在本发明的意义上"临床标记物"是指RA患者的标准化临床评估。优选的临床标记物是例如疾病活性评分和/或放射学评分的评分。在本发明中用作标记物的蛋白或多肽是意在包括所述蛋白的任何变体以及所述蛋白或所述变体的碎片，特别地，患者体液中存在的免疫可检测的碎片。本领域技术人员会认识到细胞释放的或者存在于受损的细胞外基质中的蛋白，例如，在炎症期间，可以降解或者裂解成这种碎片。以非活性形式合成某些标记物，其随后通过蛋白水解作用被活化。本领域技术人员可以理解，蛋白或其碎片也可以作为复合物的一部分存在。在本发明的意义上这种复合物也可以用作标记物。标记物多肽的变体可以通过相同的基因编码，但它们的PI或MW不同，或者两个都不同(例如，选择性mRNA或mRNA前体加工的结果，例如，可变剪接或有限蛋白酶解)，此外，或者可选择的，可以来源于差异翻译后修饰(例如，糖基化、酰化和/或磷酸化)。如上文所示，本发明的术语标记物也涉及存在于样品中的抗体。在本案中，即，在RA中，这些抗体是自身抗体。自身抗体是患者样品中的抗体，其结合于存在于患者自身细胞内、或细胞上，或由患者自身细胞产生的抗体。本文中使用的术语"样品，，是指为了体外评估而获得生物样品。在本发明的方法中，样品或患者的样品优选可以包括任何体液。优选的测试样品包括血液、血清、血浆、尿、唾液和滑液。优选的样品是全血、血清、血浆或滑液，血浆或血清是最优选的。样品仅用于本发明的体外诊断方法，剩余的样品材料不会转移回患者体内。一旦分析完成即丢弃样品。术语"帮助"评估疾病进展的风险是指本发明的方法(与其他变量一起，例如，临床参数或从属权利中公开的参数)会帮助医生评估患有类风湿性关节炎的患者疾病进展的风险。本发明涉及评估患有类风湿性关节炎(RA)的患者疾病进展的风险的体外方法，该方法包括a)获得液体样品，b)测定所述样品中C-反应蛋白(CRP)和白介素-6和任选的一种或多种其他标记物的浓度，以及c)将步骤(b)中测定的浓度与疾病进展的风险相关联的步骤。该方法将会成为医生考虑的一个组成部分从而帮助即帮助他评估疾病进展的风险。术语"评估风险"或"评估可能性"，例如，疾病进展的，是指当实施本发明的方法时，结果总是显示进行性RA的相对风险性或相对可能性。结果越高，RA患者经历进行性病程的相对风险性也越高。在本发明的意义上"疾病进展"是通过Sharp-Genant-评分评估的。进展率每年>5的患者(在1或2年后Sharp-Genant-评分从基线的改变)被分类为具有疾病进展的RA患者。所有其他患者被分类为无疾病进展。"患有类风湿性关节炎的患者"是满足美国风湿病学会为类风湿性关节炎的分类而制定的修订标准的患者(Arnett,F.C.,等，ArthritisRheum.31(1988)315-324)。这些标准通过引用结合到本文中。本发明的发明人已经定义了两种亚群的RA患者，显示疾病进展的患者以及显示无疾病进展的RA对照人群或亚群，研究了基于这些患者群生化标记物预测疾病进展的可能性。令人惊奇地，能够发现并确定在临床需要的高特异性下CRP力口白介素-6的标记物组合对改善RA患者的病程预测的灵敏度是重要的。在本发明的方法中至少分别测定生物标记物CRP和IL-6的浓度，并将该标记物组合与诊断患有RA的患者的疾病进展的风险相关联。本领域技术人员将会理解将标记物水平与某种可能性或风险相关的步骤可以以不同的方式实施和完成。优选地标记物CRP和IL-6测定的值进行数学组合，将组合的值与潜在的诊断问题相关联。标记物值可以通过任何合适的现有技术的数学方法进行组合。优选用于标记物组合的数学算法是逻辑函数。运用这种数学算法或这种逻辑函数的的结果优选是单一值。该值可以容易地与RA疾病进10展的风险相关联。在一种优选的方式中，这种逻辑函数是通过a)将RA患者分为经历疾病进展的患者组和没有经历疾病进展的患者组，b)通过单变量分析鉴定这些组之间差异显著的标记物，c)逻辑回归分析以评估用于评估RA疾病进展的标记物的独立区别值，以及d)建立逻辑函数以组合独立区别值而获得的。在一个优选的实施方案中，用于组合CRP和IL-6值的逻辑函数是通过a)将RA患者分别分为经历疾病进展的患者组和没有经历疾病进展的患者组，b)建立CRP和白介素-6的值，c)进行逻辑回归分析以及d)建立逻辑函数以组合CRP和IL-6标记物的值而获得的。在一个进一步优选的实施方案中，用于将CRP和IL-6的测定与一种或多种其它标记物的值组合的逻辑函数是通过a)将RA患者分为经历疾病进展的患者组和没有经历疾病进展的患者组，b)通过单变量分析鉴定这些组之间差异显著的一种或多种其它的标记物，c)进行逻辑回归分析以评估所述的标记物在评估RA疾病进展中对CRP和白介素-6的组合是否具有附加区别值以及d)建立逻辑函数以组合CRP、白介素-6以及一种或多种其它标记物的测定值而获得的。用于将标记物组合与疾病相关联的逻辑函数优选釆用通过使用统计学方法开发和获得的算法，统计学方法例如判别分析(DA)(即线性的-、二次的-、规则化的-DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻分类法)、PLS(偏最小二乘法)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、Boosting/Bagging方法)、广义线性模型(即逻辑回归)、基于主组分的方法(即SIMCA)、广义相加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。本领域技术人员会毫无问题地选择合适的统计学方法来评估本发明的标记物组合并因此获得合适的数学算法。优选获得用于将本发明的标记物组合与RA疾病进展的风险相关联的数学算法的统计学方法选自DA(即线性的、二次的、规则化的判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻分类法)、PLS(偏最小二乘法)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随才几森林方法、Boosting方法)或广义相加模型(即逻辑回归)。关于这些统计学方法的细节可以参见下列参考文献Ruczinski,L,等,J.ofComputationalandGraphicalStatistics12(2003)475-511;Friedman,J.H.，丄oftheAmericanStatisticalAssociation84(1989)165-175;Hastie,T.,等，TheElementsofStatisticalLearning,SpringerVerlag(2001);Breiman,L.，等，Classificationandregressiontrees,California,Wadsworth(1984);Breiman,L.,RandomForests,MachineLearning45(2001)5-32;Pepe，M.S.,TheStatisticalEvaluationofMedicalTestsforClassificationandPrediction,OxfordStatisticalScienceSeries,28(2003);和Duda,R.O.,等,PatternClassification,WileyInterscience,第2版(2001)。本发明的一个优选的实施方案是使用生物学标记物的潜在组合的最优化的多变量临界值(cut-off)并分别区分状态A和状态B,例如，RA疾病进展和非RA疾病进展。在这种类型的分析中标记物不再是独立的而是形成标记物组。能够确定组合CRP和IL-6的测定结果的确显著改善评估患有RA的患者疾病进展的风险的诊断准确度。在多变量分析中，CRP、IL-6和其它一些标记物具有约0.7-约0.8的曲线下面积(AUC)。CRP和IL-6均为炎症标记物并且它们彼此高度相关。因此，很意外地观察到CRP和IL-6可以组合并且作为个体标记物在相同的特异性水平下在灵敏度方面显示巨大的改善。AUC是诊断过程的性能或准确度的指标。诊断方法的准确度最好通过其受试者操作特性(ROC)描述(参见特别是Zweig，M.H.,和Campbell,G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC曲线图是在整个观察的数据范围内由连续变化决定阈值(decisionthresh-hold)得到的所有灵敏性/特异性对的曲线。ROC曲线下的面积称为AUC。实验室试验的临床性能取决于其诊断准确度，或将受试者正确分类为临床上相关亚群的能力。诊断准确度测定正确区分被研究的受试者两种不同症状的试-睑的能力。这种症状是例如健康和疾病或疾病进展对没有疾病进展。在每个病例中，ROC曲线通过在决定阈值的全部范围将灵敏性对l-特异性作图，描述了两种分布之间的重叠。在y轴上是灵敏度，或真阳性率[定义为(真阳性试验结果数)/(真阳性数+假阴性测试结果数)]。这也是指疾病或症状存在下的确定性。它由受影响的亚群单独计算。在x轴上是假阳性率或l-特异性[定义为(假阳性结果数)/(真阴性数+假阳性测试结果数)]。它是特异性的指数，并完全地由未受影响的亚群计算。因为通过使用来自两个不同亚群的试验结果，完全独立地计算真和々i阳性率，所以ROC曲线不依赖于样品中疾病的患病率。ROC曲线上的每个点代表对应于特定决定阈值的灵敏性/l-特异性对。具有完美辨别力的试验(在结果的两个分布中没有重叠)具有通过左上角的ROC曲线，在左上角，真阳性率是l.O，或100%(完美的灵敏度)，并且假阳性率是0(完美的特异性)。无辨别力的试验的理论曲线(两组结果相同的分布)是从左下角至右上角的45°对角线。大多数曲线落在这两个极端之间(如果ROC曲线完全落在45°对角线下，可以容易地通过将"确定性，，的标准从"高于"反转为"低于"进行校正，反之亦然)。定性地，曲线越接近左上角，试验的总准确率也就越高。定量实验室试验的诊断准确度的一个方便的目的是通过单独的数字表示其性能。最普通的总体测定是ROC曲线下面积(AUC)。按照惯例，该面积总是^).5(如果不是，可以反转决定规则使其这样)。值在1.0(两组试验值的完美分离)和0.5(两组试验值之间没有明显的分布差异)之间。该面积不仅取决于曲线特定的部分，例如最接近对角线的点或90%特异性的灵敏度，也取决于整个曲线。这是ROC曲线如何接近于完美ROC曲线(面积=1.0)的定量、描述性表述。总的测定灵敏度将取决于实施本文公开的方法所需的特异性。在某种优选的情况中，75%的特异性可能是足够的，统计学方法和所得算法可以基于这种特异性需要。在进一步优选的实施方案中，用于评估患有RA的患者疾病进展的风险的方法基于80%、85%或者特别优选90%或95%的特异性。由实施例部分可以明显看出，在90%的特异性下使用CRP和IL-6的标记物组合具有大约50%的良好的灵敏度。这相当于大约20%的总误差，并且比单独基于个体生化标记物使用现有技术的方法获得的总误差要更好。使用给定的测定方法测量并确定了实施例部分中CRP和IL-6给定的水平。应当理解不同的测定会导致不同的临界值。本领域技术人员会毫无问题的按照本发明描述的方法确定这种供应商依赖性(supplierdependent)临界值。白介素-6(IL-6)是具有大量生物学活性的21kDa的分泌性蛋白，是i、性期反应物，刺激多种蛋白的合成，包^粘附分子。其主要功能是介导肝脏蛋白的急性期生成，并且其合成是通过细胞因子IL-1和TNF-a诱导的。IL-6通常是由巨噬细胞和T淋巴细胞生成的。IL-6正常的血清浓度是<5pg/ml。检测例如CRP和IL-6的生物标记物的优选方法是特异性结合测定，特别是免疫测定法。免疫测定法是本领域技术人员熟知的。进行这种测定的方法以及实际应用和操作总结于相关的教科书中。相关教科书的实例是Tijssen，P.,In:Practiceandtheoryofenzymeimmunoassays，eds.R.H.Burdon和v.P.H.Knippenberg，Elsevier,Amsterdam(1990),pp.221-278,和多巻MethodsinEnzymology,eds.Colowick,S.P.,和Caplan，N.O.,AcademicPress,dealingwithimmunologicaldetectionmethods,净争别是70、73、74、84、92和121巻。例如IL-6可以通过竟争性或夹心型(sandwich)免疫测定法进行测定。优选IL-6是在夹心型免疫测定法中测定的，夹心型免疫测定法基本上基于特异性结合于IL-6的抗体，IL-6直接或间接连接或能够结合于固定相，特异性结合于可被检测标记的IL-6的抗体，并且在允许抗IL-6抗体与样品中IL-6结合的条件下培养这些反应物，分离未结合的可检测标记的抗体，测定通过IL-6结合的标记的抗体的量，以及将结合的标记抗体的量与样品中IL-6的浓度相关联。C-反应蛋白(CRP)是具有21kDa亚基的涉及宿主防御的均五聚体(homopentameric)Ca"-结合急性期蛋白。CRP合成是由IL-6诱导的，并由IL-I间接诱导，因为IL-I可以引发通过肝窦中的K叩ffer细胞的IL-6的合成。在卯°/。的健康人群中CRP正常的血浆浓度是〈3^g/ml(30nM),在99%的健康个体中<10吗/ml(100nM)。血浆CRP浓度可以，例如通过均质测定形式或ELISA测定。CRP被认为是全身性炎症的标记物。进一步混杂和合并患有RA的患者疾病进展的风险评估的因素是患者在就诊的时候可以是在疾病发展的不同阶段和处于不同的治疗方案中。本发明的发明人已经能够证实所发现的标记物组合对还没有使用抗风湿药物治疗的患者和已经处于使用緩解疾病的抗类风湿性药物(DMARD)治疗的患者具有预测性。特别是后来的发现具有更大的相关性，其显示本发明公开的方法可以帮助鉴定那些对使用DMARD治疗不响应或者不充分响应的患者。在一个优选的实施方案中本发明的方法是使用从处于使用选自緩解疾病的抗类风湿性药物(DMARD)的抗风湿药治疗的RA患者获得的样品实施的。还优选，本文公开的方法是使用从还没有处于使用抗风湿药治疗的RA患者获得的样品实施的。相信随着CRP和IL-6标记物组合的鉴定，用于评估患有RA的患者疾病进展的风险的重要地标记物组合还没有被鉴定。如本发明人进一步所示，评估患有RA的患者疾病进展的风险的方法可以进一步通过将两种关键标记物CRP和IL-6的测定与进一步的参数组合来改善。在一个进一步优选的实施方案中，本发明涉及包括a)获得液体样品，b)测定所述样品中C-反应蛋白(CRP)和白介素-6以及一种或多种其它标记物的浓度，c)将步骤(b)中测得的浓度与疾病进展的风险相关联的步骤，其中任选的一种或多种其他标记物选自骨或软骨标记物、滑液标记物、其他炎症标记物、遗传标记物和放射学评分。在一个优选的实施方案中用于本发明方法的一种或多种其他标记物是骨或软骨标记物，优选所述的骨或软骨标记物选自PINP、卩-CrossLaps、CartiLaps、骨4丐素和ICTP,还优选一种或多种骨或软骨标记物是ICTP和/或CartiLaps。最显著的关节组织是骨、软骨和滑膜。由于类风湿性关节炎是破坏性疾病，这些组织受到影响的最多。在RA领域它们是潜在的生物学标记物可能的来源。原则上这些标记物不4义可以来自于各自组织的石皮坏也可以来自于失控和/或无效的修复过程。有经验的技术人员会理解，骨、软骨和滑膜代谢的标记物可以来源于这些组织的合成或破坏。多种骨、软骨和滑膜代谢的标记物可以由两种不同组的蛋白进行描绘。它们来自于多种类型的胶原或非胶原蛋白。非胶原蛋白通常参与细胞外基质的形成。在所有三种组织中可以发现不同量的其中一些标记物。骨和/或软骨标记物包括骨和/或软骨胶原降解的标记物以及骨和/或软骨胶原形成的标记物。优选的胶原衍生的骨或软骨标记物是1.吡咬诺林(=PYD)、脱氧吡啶诺林(=DYD)和Glc-Gal-PYD:吡啶诺林(=PYD)通过交联胶原三螺旋的链稳定胶原。PYD的化学结构非常稳定，作为胶原降解的最终产物可以在血清和尿中发现(Knott,L.,和Bailey，A丄，Bone22(1998)181-187)。其与关节炎有关(Kaufmann，丄，等，Rheumatology42(2003)314-320)。PYD监测参与关节破坏的软骨，因为其由软骨释放，并且仅一定程度上由骨释放，而其近亲脱氧吡啶诺林(=DYD)主要来源于骨。所有三种标记物与关节炎相关(Kaufmann,supra)。糖基化形式的Glc-Gal-PYD主要发现于滑液组织(Gineyts,E.,等，Rheumatology40(2001)315-323)。2.交联端肽CTX-I、CTX-II、NTX-I、LQ-表位，它们是分别来自于I型或II型胶原的C-或N-末端的交联端肽，其中卩-CTX-I也称为卩-CrossLaps⑧(Bonde，M.,等，Clin.Chem.40(1994)2022-2025)。3.I型胶原羧基末端终肽(-ICTP)是指I型胶原片段和标记物，其初期来源于I型胶原通过氰溴化物裂解(US5,538,853)。4.来源于胶原的线性肽称为。&1^&口8@的测定法测量来源于II型胶原C-末端区域的线性肽(US6,372,442)。5.修饰的氨基酸胶原包含例如羟基脯氨酸和半乳糖羟基赖氨酸的修饰的氨基酸，其可以用作胶原降解的标记物(Al-Dehaimi，A.W.,等，Clin.Chem.45(1999)676-681)。6.胶原新表位(neoepit叩es):Col2-3/4和CIIN是通过胶原酶由II型胶原的初期裂解生成的新表位(Billinghurst,R.C.,等，J.Clin.I鹏st.99(1997)1534-1545)。7.考虑过的反映骨形成的胶原标记物I型胶原的N-末端以及C-末端前肽(=PINP和PICP),分别在合成期间/之后由前体多肽(前胶原)和骨形成的考虑过的标记物剪切得到。PIICP是来自II型胶原的相对应的前肽，而PIIINP来源于III型胶原。还优选骨或软骨标记物是非胶原标记物，例如CS846,其为在聚集蛋白聚糖合成期间生成的硫酸软骨素表位；在软骨中具有桥接功能的软骨低聚物基质蛋白(=COMP)(Saxne,T.,和Heinegard,D.，Br丄Rhe醒to1.31(1992)583-591);软骨间层蛋白(=CILP),其为软骨的基质蛋白(Lorenzo,P.,等，J.Biol.Chem.273(1998)23463-23468);软骨基质蛋白1-3也称为matnlins;在软骨中作为信号分子的chondromodulins(Suzuki,F.,Connect.TissueRes.35(1996)303-307);软骨原性视黄酸敏感蛋白(=CD-RAP)或MIA,其在软骨细胞调控中具有尚未确定的功能(Mueller-Ladner，U.,等，Rheumatology38(1999)148-154);骨4丐素，其由成骨细胞合成，属于主要的骨非胶原基质蛋白，用于监测骨转换(Gundberg,C.M.，等，J.Clin丄igandAssay21(1998)128-138);以及骨唾液蛋白，其为主要的骨非胶原基质蛋白，例如骨唾液蛋白II,现称为骨唾液蛋白，其例如作为标记物用于评估骨转换(Saxne,T.,等，ArthritisRheum.38(1995)82-90)。在一个优选的实施方案中本发明方法中所用的一种或多种其他标记物是滑液标记物，选自基质金属蛋白酶l(=pro-MMP-l)、基质金属蛋白酶3(=pro-MMP-3)、透明质酸，优选地一种或多种其他滑液标记物是透明质酸和pro-MMP3。基质-金属蛋白酶(=MMP)家族降解几乎所有的细胞外基质的组分。因此MMP不仅和多种类型的癌症相关，也与RA中的炎症过程相关。MMP1和MMP3是由成纤维细月包、成骨细月包和内皮细月包通过例如IL-1或TNF-a的促炎细胞因子刺激生成的。通常在循环中发现作为无活性的前体形式的MMP，即，分别作为pro-MMPl和pro-MMP3。已经在RA患者的滑液中检测到pro-MMP1和pro-MMP3，它们的水平对抗TNF-a疗法敏感。用于评估患有RA的患者疾病进展的风险的标记物组中使用的最优选金属蛋白酶是pro-MMP3。除了上文提及的金属蛋白酶，也可能使用它们统称为基质金属蛋白酶的组织抑制剂(=TIMP)的相应的抑制剂，例如，MMP-1和MMP-3在体内通过TIMP-1失活，TIMP-1是29.5kD的唾液糖蛋白，其与MMP形成1:1的定比化学复合物。已经研究了RA中TIMP1和TIMP-2与软骨的破坏的关系(Ishiguro,N.,等，ArthritisRheum.44(2001)2503-2511)。葡糖胺聚糖透明质酸是一种关节功能必需的大分子。它是由成纤维细胞和其它特殊结締组织细胞合成的。透明质酸参与细胞外基质的形成和细胞与细胞间的接触。在滑液中发现高浓度，在其中负责水分的保持从而有助于关节的润滑。在类风湿性关节炎中透明质酸的合成由促炎症介质IL-1和TNF-a刺激，导致增加血清/血浆水平(Sawai,T.,和Uzuki,M.,ConnectiveTissue33(2001)253-259)。在一个优选的实施方案中，本发明方法中所用的一种或多种其他标记物是遗传标记物，选自HLA-DR4和HLA-DRB1等位基因，优选地一种或多种其他遗传标记物是HLA-DRBTOl或/和HLA-DRBr04等位基因(Goronzy,J丄，等，ArthritisandRheumatism50(2004)43-54)。在一个优选的实施方案中本发明方法中所用的一种或多种其他标记物是放射学评分，优选地所述的放射学评分选自Sharp-评分、Sharp-Genant-评分、vanderHeijde-Sharp-评分、Ratingen-评分、Larsen-评分、RAU-评分和Herborn-评分，还优选一种或多种放射学评分是Sharp-Genant-评分或/和Larsen-评分。"Sharp-评分，，首先在1971年被提出(Sharp,J.T.,等，ArthritisandRheumatism14(1971)706-720)并在1985年被进一步阐明(Sharp,J.T.,等，ArthritisandRheumatism28(1985)1326-1335)。"Sharp-Genant-评分"是Genant于1983年提出的"Sharp-评分"的修正版(Genant,H.K.,Am丄Med.75(1983)35-47)。"vanderHeijde-Sharp-评分"是vanderHeijde于1989年提出的"Sharp-评分，，的修正版(vanderHeijde,D.M.F.M.，Lancet1(1989)1036-1038)。"Larsen-评分"首先在1977年被提出(Larsen,A.，等，ActaRadiol.Diagn.18(1977)481-491)。"RAU-评分"有时也称为"Ratingen-评分"是Larsen-评分的修正版(Rau，R.和Wassenberg,S.，Z.Rheumatol.62(2003)555-565)。在一个优选的实施方案中本发明方法中所用的一种或多种其他标记物是炎症的进一步标记物，优选所述的炎症的进一步标记物是炎症标记物，选自S100-蛋白、红细胞沉降率(ESR)、SAA和E-选4奪素，优选它是SAA或/和E-选择素。术语"炎症的其它标记物"或"炎症的进一步标记物"是指这些标记物不是CRP和IL-6。血清淀粉样蛋白A(二SAA)是U.7kDa的低分子量的急性期蛋白。其主要是通过肝对IL-1、IL-6或TNF-a刺激响应而合成，并参与T-细胞依赖性免疫应答的调控。在急性症状下SAA的浓度增加至1000倍，达到每毫升1毫克。其用于监测疾病例如嚢性纤维化、肾移植排斥、外伤或感染中的炎症。在类风湿性关节炎中在某些情况下它用作CRP的替代物，但是，SAA还没有被广泛地接受。S-100蛋白形成不断增加的Ca^结合蛋白家族，如今包括超过20个成员。S-100蛋白的生理学相关结构是同型二聚体，但某些也可以互相形成异型二聚体，例如S100A8和S100A9。其细胞内功能从蛋白质磷酸化、酶活性或细胞骨架动态的调控到参与细胞增殖和分化。由于某些S100-蛋白也由细胞释放，其细胞外功能也已经得到描述，例如，神经元存活、星形细胞增殖、凋亡的诱导和炎症过程的调控。在S100A8对十曼性炎症应答的炎症中已经发现了S100A8、S100A9、异型二聚体S100A8/A9和S100A12,而在急性炎症中S100A9、S100A8/A9和S100A12增加。S100A8、S100A9、S100A8/A9和S100A12已经与具有炎症组分的不同的疾病相联系，包括某些癌症、肾移植排斥、结肠炎以及更重要的是与RA相联系(Burmeister,G.,和Gallacchi,G.,Inflammopharmacology3(1995)221-230;Foell,D.,等,Rheumathology42(2003)1383-1389)。用于评估RA中疾病进展的标记物组中使用的最优选的S100标记物是S100A8、S100A9、S100A8/A9异型二聚体和S100A12。sE-选择素(可溶性内皮白细胞粘附分子-1,ELAM-1)是115kDa,I型跨膜糖蛋白，其仅在被炎症细胞因子(IL-1卩、TNF-a)或内毒素激活后在内皮细胞上表达。细胞表面E-选择素是白细胞滚动附着于内皮-在炎症部位白细胞外渗中的必要步骤-的介质，因此在局部炎症应答中起到重要作用。在健康个体的血液中发现可溶性E-选择素，可能来源于表面表达的分子的蛋白水解裂解。在许多疾病中已经报道了血清中水平升高的sE陽选择素(Gearing,A丄H.,等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.667(1992)324-331)。优选地为了评估RA中疾病进展的风险用于与CRP和IL-6组合的一种或多种其它标记物是生化标记物或生物标记物。优选地生物标记物是多肽或自身抗体。由实施例部分可以明显看出包含CRP和IL-6的标记物组会帮助评估患有RA患者疾病进展的风险。在一个进一步优选的实施方案中本发明涉及包含至少CRP和白介素-6的标记物组在评估患有类风湿性关节炎的患者疾病进展的风险中的用途。与CRP和IL-6—起使用的一种或多种额外的标记物优选是标记物组的一部分，即适合进一步完善任何患有RA患者疾病进展风险的评估一系列标记物。在这种用于评估RA进展的标记物组中标记物的总数优19选少于20种标记物，更优选少于15种标记物，还优选少于10种标记物，8种或更少的标记物甚至是更优选的。优选的是总共包含3、4、5或6种标记物的用于评估RA中疾病进展的标记物组。进一步优选的实施方案涉及标记物组在评估患有RA患者疾病进展的风险中的用途，该组包含CRP、白介素-6和至少一种选自CartiLaps、透明质酸、E-选4奪素和ICTP的额外标记物。在一个优选的实施方案中帮助评估患有RA患者疾病进展的风险的标记物组包括CRP、白介素-6和透明质酸。在一个优选的实施方案中帮助评估患有RA患者疾病进展的风险的标记物组包括CRP、白介素-6和E-选才奪素。在一个优选的实施方案中帮助评估患有RA患者疾病进展的风险的标记物组包括CRP、白介素-6和ICTP。在一个优选的实施方案中帮助评估患有RA患者疾病进展的风险的标记物组包括CRP、白介素-6和CartiLaps。在一个进一步优选的实施方案中实施至少CRP和白介素-6测定所需的试剂以试剂盒形式提供。因此本发明也涉及包含分别特异性测定CRP和白介素-6所需的试剂，以及任选的实施测定的辅助试剂的试剂合疯。在本发明一个优选的实施方案中，特异性结合两种生物标记物蛋白CRP和IL-6以及任选的一种或多种其它生物标记物的试剂固定于固体载体上，例如聚苯乙烯表面。本发明一个优选的实施方案提供同时结合并定量用于评估RA中疾病进展的标记物组的蛋白微阵列或蛋白阵列装置。蛋白阵列装置由结合于载体材料上确定点的分子(捕获剂)组成。优选地生物素化的特异性结合试剂作为涂布有抗生蛋白链菌素的固定相上非常小的点结合。然后阵列接触样品。例如抗体的捕获剂能够结合来自生物样品的感兴趣的蛋白。然后可以通过定量每个点产生的信号来监测特异性分析蛋白与个体位点的结合。在一个进一步优选的实施方案中本发明涉及用于评估患有类风湿性关节炎的患者疾病进展的风险的包含至少合适的用于CRP和白介素-6测定的特异性结合配偶体和任选的合适的一种或多种其它标记物的特异性结合配偶体的蛋白阵列装置。提供下列实施例和图以帮助理解本发明，所附权利要求所述的真实范围。应当理解可以在所述的方法中进行改变而不偏离本发明的精神。附图简述图1所有RA患者进展率1的累积概率图(x轴=累积概率％,y-轴二SharpGenant评分中的变化)图2-5显示单个标记物或标记物组合的箱线图(boxplots)。组I的RA患者分为具有疾病进展的或没有疾病进展的。特异性(每个图中右边的箱)设置为大约卯％(y轴上=0.9)。每个标记物或标记物组合的灵敏度显示于中间的箱，对应的总误差通过左边的箱线图辅助显示。(箱=25化-75化四分值；须(whiskers)=1.5倍四分位差；箱中-=中位数；+显示平均值的位置；*=落在须外的个体值)图2CRP的箱线图灵敏度=35%;总误差=23%图3IL-6的箱线图灵敏度=35%;总误差=25%图4CRP+IL-6标记物组合的箱线图灵敏度=50%;总误差=20%图5CRP、IL-6和pro-MMP3标记物组合的箱线图灵敏度=53%;总误差=20%实施例1研究人群来源于237个高度特征的最大病程15年的RA患者的样品收集于具有一或两年随访的五个欧洲中心。根据美国风湿病学会用于类风湿性关节炎分类的1987年修订标准，所有个体^皮诊断为RA-患者(Arnett,F.C.,等，ArthritisRh函.31(1988)315-324)。所有患者使用广泛的病例报告表(=CRF)记录。CRF包括健康评估问巻、SF36问巻、肿胀和触痛关节计数、实验室参数、相关手术的临床史、药物、共病(co-morbidities)和共病的药物。在基线处由手和脚获得X-射线，在一年和两年后进行标准化程序。只有从RA-患者获得的基线样品用于不同分析物的测定，相应的结果用于单变量和多变量分析。研究人群的人口数据显示于表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例2Sharp-Genant-评分的测定在基线处以及一年和两年后从每个患者的四肢获得x射线。将传统的胶片x光照片送至Synarc(SynarcGmbH,汉堡，德国)，在那里使用Lumiscan200高分辨率数字转换器将硬拷贝胶片数字化。在质量检查后，由有经验的放射科医师读取每个图像并根据Genant-modifiedSharpscoring进行评分。x光照片的形态学评分根据下文描述的Genant-修改的Sharp评分方案对手和脚中骨侵蚀和关节腔狭窄进行评分。该评分方案是基于Genant-修改的Sharp评分技术。侵蚀评分基于侵蚀的大小和累及骨(关节的两侧)的面积使用8点的评分等级从0-3.5对每个手腕和手上的14个位点(4个近端指间和5个掌指关节、拇指的腕掌关节、舟骨、桡骨远端和尺骨远端)和每只脚的六个关节(5个跖趾关节和趾I(即，拇趾)的趾间关节)进行评分0(正常无侵蚀)0.5(皮质连续性的微小损失或骨侵蚀不确定的结果)1.0(轻度一个或两个关节骨确定但低的侵蚀，通常在棵区，包括<25°/。的关节面)1.5(轻度至中度中小型侵蚀，包括<25%的一个或两个关节骨的关节面)2.0(中度大中型侵蚀，包括大约26%-50%的两个关节骨的关节面)2.5(中度至严重大约51%-75%关节面的侵蚀)3.0(严重大约76%-90%关节面的侵蚀)3.5(非常严重100%的关节面的侵蚀(关节面的完全破坏))关节腔狭窄(JSN)评分。使用9点的评分等级从0到4对每个手腕和手上的13个位点(指II-V的近端指间、拇指的指间关节和5个掌指关节、作为一个单元的指III-V的腕掌关节、关节嚢周(舟骨-头状骨(capitate)和月骨(lunate)-头状骨结合)的空间和桡腕关节)和每只脚上六个位点(5个跖趾关节和趾I(即，拇趾)的趾间关节)进行评分0(正常)0.5(微小的关节腔狭窄或模糊的结果)1.0(轻度关节腔狭窄(局部的或较小的))1.5(轻度至中度关节腔狭窄)2.0(中度关节腔狭窄)2.5(中度至重度关节腔狭窄)3.0(重度关节腔狭窄)3.5(重度关节腔狭窄接近关节强直)4.0(确定的关节强直)手/手腕分别总计个体关节评分以建立手和手腕的总的侵蚀评分和总的JSN评分。手和手腕最大的总的侵蚀评分是(14x3.5最大每关节)x2=98。最大的总的JSN评分是(13x4最大每关节)x2=104。为了提供侵蚀和关节腔狭窄相等的权重，每个总数标准化到0-100的评分等级。如果E-评分是总的侵蚀评分和J-评分是双手总的JSN评分，标准化的评分如下计算标准化E-评分-(E-评分/98)xlOO,和标准化^评分=(J-评分/104)xlOO。脚对于手/手腕，分别总计个体关节评分以建立脚的总的侵蚀评分和总的JSN评分。脚的最大的总的侵蚀评分是(6x3.5最大每关节)x2=42。最大的总的JSN评分是(6x4最大每关节)"=48。为了提供侵蚀和关节腔狭窄相等的权重，每个总数标准化到0-100的评分等级。如果E-评分是总的侵蚀评分和J-评分是双脚总的JSN评分，标准化的评分如下计算标准化E-评分(E-评分/42)x45，和标准化-评分=(J-评分/48)x45。组合手/手腕和脚的总评分是每个个体总分的总和。因此，最大可获得的评分是290。4曼蚀评分=标准化E-评分手/手腕+标准化E-评分脚，加JSN评分=标准化J-评分手/手腕+标准化J-评分脚，加总评分H菱蚀评分+JSN评分。总评分中的变化如下计算侵蚀变化=(随访侵蚀评分)-(最初侵蚀评分)加JSN变化=(随访JSN评分)-(最初JSN评分)，加总变化=(随访总评分)-(最初总评分)。实施例3具有疾病进展的RA和没有疾病进展的RA中患者的分类存在疾病进展的分类的文献中讨论的某些可能性。除了广泛用于药物研究中评估治疗应答的ACR和EULAR标准，HAQ评分和放射学评分也可以用于疾病进展的分类。最优选的方法是在一年后使用任何放射学评分的变化。我们决定使用总的Sharp-Genant-评分和测定在基线值后一年或两年该评分的个体变化(-进展率)。进展率(1)=从基线到1年Sharp-Genant-评分(SGS)的变化。进展率(2)=从基线到2年Sharp-Genant-评分(SGS)的变化。接下来重要的步骤是定义能够分类具有进展的RA和没有进展的RA中的患者的进展率的临界值。因此绘制所有患者的进展率1或2的累积概率图(参见图1)(vanderHeijde等,ArthritisRhe腿.52(005)49-60)。在图的第一个斜面上设置一条直线，在"5"的进展率(1)测定交叉点。使用进展率(2)的概率图获得相同的结果。使用"5"的进展率(即，每年SGS中增加超过5)作为用于将RA患者分类为具有或不具有进展的患者的临界值通过下列两个论证支持1.使用"5"的进展率(1)作为临界值，该样品群体大约20%的RA患者会分类为具有进展的RA患者。2.任何用于测定临床结果的评分方法的值取决于其可信度。存在描述过的用于测定"变化的灵敏度"的不同方法(Boini,S.和Guillemin,F.,Ann.Rheum.Dis.60(2001)817-827)。用于个体患者分类的最好的可信度评分是最小检测差异(SDD)。评价了用于建立SGS的放射照片的专家已经测定了SGS的5.1的SDD。这是指，大约5的SGS变化是一个患者在两个时间点的最小差异，其可以显著的区分。因此使用下列分类进展率(1)或(2)〉5:具有进展性疾病的RA患者进展率(1)或(2)S5:没有进展性疾病的RA患者使用这个定义，我们完成了下列分类具有疾病进展的RA患者59个患者没有疾病进展的RA患者178个患者实施例4测定的标记物表2代表了所用的测定法并给出了测试形式以及测定法的供应商。大多数测定法是手动微孔板(=MTP)形式ELISA。在自动Hitachi分析仪上同种测试形式中测定RF和CRP。测定血清样品中除了CartiLaps外的所有标记物浓度，CartiLaps在尿中测定。通过肌酐结果标准化CartiLaps值。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>)实施例5单变量分析使用表2所列的16种标记物测定所有237个RA患者的基线样品。每个标记物值进行对数化并进行ROC分析。表3描绘了AUC值和每个标记物的灵敏度(在90%的特异性下)。表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>8种标记物获得70%以及更高的AUC。在90%的特异性下最好的灵敏度显示37%的CRP。非常令人惊讶的是，作为预后因子被公开的抗-CCP,显示只有0.59的AUC。在许多科学论文中具有大约3.0或更高的优势比的生物标记物相当乐观地称为进展预测因子。例如，Syve腦，S.W.等(Ann.Rheum.Dis.65,Suppl.II(2006)1IO)报道了抗-CCP(OR=4.18)、RF-IgM(OR=3.12)、ESR(OR=3.73)和女性性别(OR=3.29)是RA患者中IO年放射学进展的独立预测因子。如果我们计算在我们的RA群体中抗-CCP的优势比(Oddsratio)(临界值〉5U/mL),我们获得了相似的优势比，即，4.6的OR。然而"4，，或"5，，的优势比在需要高的特异性(对应低数量的假阳性结果)的临床常规中没有诊断价值。实施例6多变量分析由于有限数量的具有进展的RA患者，患者群体随机化分为训练组和试验组是不可能的。因此进行外部交叉验证(ECV)。对于ECV，训练组再分50次(比例2(训练亚组):l(试验亚组))对于外部Monte-Carlo交叉验证(Dudoit,S.和vanderLaan,M.J.，StatisticalMethodology2(2005)131-154)。在训练亚组中制定分类算法并在独立试验亚组中验证该算法。使用正则化判别分析(RDA)产生分类算法，正则化判别分析(RDA)是普通判别分析的一般化，即，二次和一次判别分析(McLachlan，G丄，DiscriminantAnalysisandStatisticalPatternRecognition,WileySeriesinprobabilityandmathematicalstatistics,1992)在RDA中使用通常最大似然(插件)评估协方差矩阵的替代法。这些替代法以两个参数(x、y)为特征，通过共同最小化未来错分类风险的基于样品的评估，它们的值专门用于个体情况(Friedman,J.H.,J.oftheAmericanStatisticalAssociation84(1989)165-175)。作为可选的方法，支持向量才几算法(SupportVectorMachinesalgorithms)(Hastie，T.，等，TheElementsofStatisticalLearning,SpringerSeriesinStatistics,2001)可以使用可比较的分类结果。逐步构建标记物组，从最好的用于分类问题的单个标记物开始并当总分类误差不再显著变化时结束。为了获得集中分布，使用自然对数函数转化每个单个标记物。实施例7用于评估RA患者疾病进展的风险的标记物组的鉴定多变量分析的目标是寻找显示比最好的单个标记物更高灵敏度的标记物组。特异性极限设为90%。选择的第一个标记物是具有35%的灵敏度的CRP,第二个标记物是将灵敏度提高至50%的IL-6。具有不同标记物的其他组合作为第三个和第四个标记物，它们能够最小化总误差和/或改善灵敏度(表4)。对所有这些标记物组合，最重要的两个标记物是CRP和IL-6,从而代表这些标记物组中关4建的标记物。本发明的目的是帮助风湿病学家评估RA患者是否处于疾病进展的风险中。已鉴定的标记物组的诊断价值在表4中通过分类的总误差得到最好的反映。CRP,目前用于炎症评估的单个生物学标记物得到0.228的总误差。IL作为单个标记物也显示相似的0.247的总误差。优选的CRP和IL6的组合显著改善分类，减少总误差至0.203。加入第三或第四标记物最终帮助进一步最小化错分类(总误差0.196)。获得的50%的灵敏度表明基于本文公开的方法大约一半的具有进展性疾病的RA患者可以通过生化标记物测定在单一时间点被正确地鉴定，即在基线，但到目前为止还不可能。期望这种分类帮助风湿病学家的决策过程，例如4吏用DMARD开始治疗或^_用不同DMARD的组合变为更好的治疗方案。表4分类为具有疾病进展的RA对没有疾病进展的RA的患者的分类结果<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表4中标记物CRP和IL-6以及标记物组合(CRPIL-6和CRP+IL-6+pro-MMP3)的箱线圓分别如图2-5所示。权利要求1.帮助评估患有类风湿性关节炎(RA)患者疾病进展的风险的方法，该方法包括以下步骤a)获得液体样品，b)测定所述样品中C-反应蛋白(CRP)和白介素-6以及任选的一种或多种其它标记物的浓度，和c)将步骤(b)中测定的浓度与疾病进展风险相关联。2.根据权利要求l的方法，其中当实施评估时，RA患者处于选自緩解疾病的抗类风湿性药物(DMARD)的抗风湿药物的治疗中。3.根据权利要求1的方法，其中任选的一种或多种其他标记物选自骨或软骨标记物、滑液标记物、其他炎症标记物、遗传标记物和放射学评分。4.根据权利要求3的方法，其中一种或多种骨或软骨标记物选自PINP、卩-C聽Laps、CartiLaps、骨钙素和ICTP。5.根据权利要求3的方法，其中一种或多种滑液标记物选自透明质酸和pro-MMP3。6.根据权利要求3的方法，其中一种或多种遗传标记物选自HLA-DR4和HLA-DRB1等位基因。7.根据权利要求3的方法，其中一种或多种放射学评分选自Sharp-评分、Sharp-Genant-评分、vanderHeijde-Sharp-评分、Ratingen评分、Larsen-评分和RAU-评分。8.根据权利要求3的方法，其中一种或多种其他炎症标记物选自SAA和E-选择素。9.包含至少CRP和白介素-6的标记物组在评价患有类风湿性关节炎的患者疾病进展的风险中的用途。10.用于实施根据权利要求1的方法的试剂盒，所述试剂盒包含分别特异性测定CRP和白介素-6所需的试剂，以及任选的用于实施测定的辅助试剂。11.用于评估患有类风湿性关节炎的患者疾病进展的风险的蛋白阵列装置，所述蛋白阵列装置包含至少用于CRP和白介素-6测定的合适的特异性结合配偶体和任选的一种或多种其他标记物的合适的特异性结合配偶体。全文摘要本发明涉及帮助进一步评估患有类风湿性关节炎患者的体外方法。该方法特别用于评估RA患者是否处于疾病进展的风险中。该方法例如通过分析生化标记物实施，包括测定样品中至少C-反应蛋白(CRP)和白介素-6的浓度并将测定的浓度与RA潜在的快速进展形式的可能性相关联。处于快速进展疾病的高风险中的患者可以是需要治疗或者如果已经治疗还需要不同的和更有效治疗的患者。本发明还涉及包含C-反应蛋白和白介素的标记物组在评估患有类风湿性关节炎的患者中的用途，以及教导了分别用于实施本发明方法的蛋白阵列装置和试剂盒。文档编号G01N33/68GK101523218SQ200780036552公开日2009年9月2日申请日期2007年9月25日优先权日2006年9月29日发明者J·卡尔,N·威尔德,V·格鲁纳特,W·罗林杰申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司