专利名称：：粮食和蔬菜中吡蚜酮残留量的检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种农业
技术领域：
的检测方法，具体是一种农产品中吡蚜酮残留量的检测方法。吡蚜酮(pymetrozine)是一种新型的吡啶类杀虫剂，作用方式独特，无击倒活性，具有"口针穿透阻塞效应"。可用于防治大部分同翅目害虫，尤其是蚜虫科、粉虱科、叶蝉科及飞虱科害虫，适用于蔬菜、水稻、棉花、果树等多种大田作物，持效期可达20天以上。吡蚜酮独特的毒理学特性以及优异的防治效果已经引起了国内外的广泛关注。美国环保局已将吡蚜酮视为有机磷农药的替代品。然而，最近一些吡蚜酮对小鼠的研究结果显示吡蚜酮可导致小鼠产生肿瘤，美国环保局将其归为人类的可能致癌物。吡蚜酮的化学结构式为化学名称为(E)_4,5—二氢一6—甲基一4一(3—吡啶亚甲基胺)一l，2，4一三嗪一3(2H)_酮。经对现有技术的文献检索发现，目前有关吡蚜酮残留量测定方法的文献报道较少，Lehotay等在《JournalofAOACInternational(美国国际分析化学协会杂志，2005年第88期第595-614页)上发表的"ValidationofaFastandEasyMethodfortheDeterminationofResiduesfrom229PesticidesinFruitsandVegetablesUsingGasandLiquidChromatographyandMassSpectrometricDetection"(—种用于果蔬中229种农药的气质和液质快速检测方法)，文献中采用酶免疫分析法、气质和液质联用等方法测定了植物中吡蚜酮的残留量，但这些方法都存在着一定的局限性，如测定方法的回收率低、使用仪器昂贵、容易受吡釾酮代谢物干扰等。目前有关粮食和蔬菜中吡蚜酮残留量的检测方法还未背景技见报道。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种粮食和蔬菜中吡蚜酮残留量的检测方法，使其具有简便、准确、快速、可靠的特点，对控制粮食和蔬菜中吡蚜酮的残留具有重要的价值。本发明是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤第一步，取样取谷类、豆类和或蔬菜样品，谷类和豆类样品粉碎过筛；蔬菜取可食部分，轻轻擦去样品表面的附着物，采用四分法，将其切碎，充分混匀，制成样品，放入分装容器中备用。所述取谷类、豆类或蔬菜样品，所取重量等于或者大于1Kg。所述过筛是指过420um标准网筛。第二步，提取准确称取上述样品置于锥形瓶中，加入有机溶剂，经震荡、过滤、浓縮，净化后备测。所述样品置于锥形瓶，是指将10g20g样品置于250mL锥形瓶。所述有机溶剂，是指乙腈、二氯甲垸、乙酸乙酯、甲苯、乙醇、辛醇、丙酮的一种或几种混合液体。所述浓縮，是指用旋转蒸发仪将样品在40°C—5(TC的范围内浓縮，浓縮近干，或者lmL2mL都可。第三步，标准溶液的配制称取吡蚜酮标准品，用有机溶剂溶解定容，制成10mg/L的储备液。将吡蚜酮标准储备液稀释，配置成5mg/L、lmg/L、0.5mg/L、0.lmg/L、0.05mg/L、0.01mg/L的标准工作液。待仪器状态稳定后，用系列标准溶液进样，保留时间定性，以峰面积或峰高和标样浓度制作标准曲线，然后对第二步收集的净化样品进行检测，外标法定量。所述有机溶剂，是指乙腈、甲醇、正己烷、异丙醇、丙酮、四氯化碳的一种或几种混合液体。所述储备液，具体为称取吡蚜酮标准品0.0100g，用有机溶剂溶解定容至100mL，制成10mg/L的储备液。第四步，在第三步的基础上进行液相色谱分析检测。所述液相色谱分析检测，其条件为色谱柱岛津Shim-packVP-0DS色谱柱(货号VP-0DS柱)，长150咖X内径4.6mm;流动相V(乙腈)V(水)二9585:5~15;流速0.6或1.0mL/min;检测器波长299nm;柱温40或20。C;进样量20或10nL。与现有技术相比，本发明用有机溶剂与水的混合液作为流动相，使用长150mmX内径4.6mm的VP-ODS液相色谱柱，采用紫外检测器，对吡蚜酮进行液相色谱分析，能方便、快捷、准确地检测出粮食和蔬菜中吡蚜酮的含量，其最小检出量为1.OX10—1Qg，最低检出浓度为0.005mg/kg。图1为实施例一吡蚜酮标准色谱图图2为实施例二吡蚜酮标准色谱图图3为吡蚜酮在实施例一甘蓝样品中的色谱图图4为吡蚜酮在实施例二西兰花样品中的色谱图图5为本发明实施例一甘蓝样品空白色谱图图6为本发明实施例二西兰花样品空白色谱图具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。本发明实施例实施的条件为仪器SCL-10AVP型液相色谱仪(配有SPD-10AVPUV检测器，日本岛津公司)，VP-0DS色谱柱(150ramX4.6mm，150L，日本岛津公司)，旋转蒸发仪(RE-52)。试剂吡蚜酮标准品(99.9%，德国Dr公司提供)，乙腈、二氯甲垸、乙酸乙酯(均为分析纯)，无水硫酸钠(用前40(TC烘4h)，弗罗里硅土(用前650。C活化3.5h，再加5%的去活水)，粉末活性炭(用前ll(TC烘lh，用酸浸泡，再用蒸馏水清洗直至pH达到67)。以下为实施例的具体实施过程实施例一甘蓝中吡岈酮残留量的HPLC检测1.标准溶液的配制1.1标准储备液的配制称取吡蚜酮标准品O.OlOOg，用乙腈溶解定容至100mL，制成10mg/L的储备液。1.2标准工作液的配制将吡岈酮标准储备液稀释，配置成5，1，0.5，0.1，0.05，0.01mg/L的标准工作液。2.样品提取和净化2.1提取四分法称取甘蓝样品10g置于250mL锥形瓶中，加入100mL乙腈，震荡10min，将震荡后的甘蓝残渣和溶液一起用玻璃漏斗(底部塞脱脂棉，上面依次添加少量无水硫酸钠和活性炭)过滤，滤液用旋转蒸发仪(水浴温度50°C)蒸发浓縮。将浓縮液移入加有NaOH的分液漏斗中，用二氯甲垸萃取，每次50mL，分4次进行，合并二氯甲烷萃取液，滤液于旋转蒸发仪上40。C浓縮近干。2.2净化在玻璃层析柱(柱内径1.5cm，长20cm)最底层铺入少量玻璃纤维，再自下而上依次填装2cm厚无水硫酸钠，10g弗罗里硅土，3cm厚无水硫酸钠。先用乙酸乙酯淋洗液预淋洗层析柱，弃去前10mL淋出液，收集之后的净化液于旋转蒸发仪4(TC浓縮近干，并用乙腈定容至5mL，摇匀，过0.45nm微孔滤膜，备测。3.色谱条件色谱柱岛津Shim-packVP-ODS色谱柱，长150mmX内径4.6mm;流动相V(乙腈)V(水)=95:5;流速0.6mL/min;UV检测器波长299nra;柱温40°C;进样量20uL。在上述条件下所得的标准色谱图见图1。据图可知在上述检测条件下吡蚜酮的保留时间为6.731min，峰形明显，可据此来进行面积定量。4.标准曲线的建立采用面积定量，将吡蚜酮标准溶液浓度5rag/L，lmg/L，0.5mg/L，0.lmg/L，页0.05mg/L，0.01mg/L作为横坐标，峰面积为纵坐标，所得标准曲线回归方程为y=241.31x+669478(R2=0.9989)，计算得出在上述条件下吡蚜酮的最小检出量为1.OXl(Tg，最低检出浓度为0.005mg/kg。5.计算方法I—CixlOOO一MxlOOO式中X为样品中农药残留量(mg/kg)C为被测样品的浓度(ng/uL)V为试样最后定容体积(mL)M为样品质量(g)6.回收率试验对甘蓝样品进行吡蚜酮标准添加回收率试验。结果见表l，0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg三个浓度的吡蚜酮平均添加回收率分别为95.09%，90.62%和91.01%，变异系数分别为0.38，L70和4.82。说明该方法的准确度和精密度符合残留试验准则要求。吡蚜酮在甘蓝样品中的色谱图见图3，目标检测峰与临近的干扰峰获得了接近基线的分离，即可用峰面积法进行精确定量。图5为未添加吡蚜酮的空白样品对照图，图中可知样品中吡蚜酮本底值为O，对本实验无干扰。表l吡魅酮在甘蓝中添加回收率的实验结果添加水平回收率(％)变异系数(mg/kg)IIIIII平均值CV(%)0.0194.8595.5194.9195.090.380.189.3390.2092.3290.621.70186.3591.6395.0691.014.82实施例二西兰花中吡蚜酮残留量的HPLC检测1.标准溶液的配制1.1标准储备液的配制称取吡蚜酮标准品O.OlOOg，用乙腈溶解定容至100mL，制成10mg/L的储备液。1.2标准工作液的配制将吡蚜酮标准储备液稀释，配置成5，1，0.5，0.1，0.05，0.01mg/L的标准工作液。2.样品提取和净化4分法称取西兰花样品10g置于250mL锥形瓶中，加入lOOmL乙腈，震荡10min，将震荡后的残渣和溶液一起用玻璃漏斗(底部塞脱脂棉，上面依次添加少量无水硫酸钠和活性炭)过滤，滤液用旋转蒸发仪(水浴温度5(TC)蒸发浓縮。将浓縮液移入加有NaOH的分液漏斗中，用二氯甲垸萃取，每次50mL，分4次进行，合并二氯甲垸萃取液，滤液于旋转蒸发仪上4(TC浓縮近干后进行柱层析。层析柱长20cm，内径1.5cm，最底层铺入少量玻璃纤维，再自下而上依次填装2cm厚无水硫酸钠，10g弗罗里硅土，3cm厚无水硫酸钠。先用乙酸乙酯淋洗液预淋层析柱，弃去前10mL淋出液，然后倒入样品浓縮液，收集净化液于旋转蒸发仪40。C浓縮近干，并用乙腈定容至5mL，摇匀，过0.45um微孔滤膜，待测。3.色谱条件色谱柱岛津Shim-packVP-ODS色谱柱，长150mmX内径4.6;流动相V(乙腈)V(水)=85:15;流速1.OmL/min;UV检测器波长299nm;柱温2(TC;进样量10nL。在上述条件下所得的标准色谱图见图2。由图可知，在上述检测条件下吡岈酮的保留时间为1.943min，峰形明显。4.标准曲线的建立采用峰高定量，将吡岈酮标准溶液浓度5mg/L，lmg/L，0.5mg/L，0.lmg/L，0.05mg/L，0.01mg/L作为横坐标，峰高为纵坐标，所得标准曲线回归方程为y=17382x+411.4(R2=0.9999)，计算得出在上述条件下吡蚜酮的最小检出量为1.0X10—ieg，最低检出浓度为0.005mg/kg。5.计算方法I_C.FxlOOO—MxlOOO式中X为样品中农药残留量(mg/kg)C为被测样品的浓度(ng/uL)V为试样最后定容体积(mL)M为样品质量(g)6.回收率试验对西兰花样品进行吡蚜酮标准添加回收率试验。结果见表2，0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg三个浓度的吡蚜酮平均添加回收率分别为87.29%，93.60%和91.57%，变异系数分别为0.78，1.93和3.14。说明该方法的准确度和精密度符合残留试验准则要求。吡蚜酮在西兰花样品中的色谱图见图4，图中可见，上述条件下，可采用峰高定量法。图6为未添加吡蚜酮的空白样品对照图，图中可见，样品中吡蚜酮本底值为O，对本实验无干扰。表2吡蚜酮在西兰花中添加回收率的实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例三稻谷中吡蚜酮残留量的HPLC检测1.标准溶液的配制1.1标准储备液的配制称取吡蚜酮标准品O.OlOOg，用乙腈溶解定容至lOOmL，制成10mg/L的储备液。1.2标准工作液的配制将吡蚜酮标准储备液稀释，配置成5，1，0.5，0.1，0.05，0.Olmg/L的标准工作液。2.样品提取和净化准确称取10g粉碎后且过420um标准网筛的稻谷风干样品于锥形瓶中，加入20mL蒸馏水充分润湿稻谷样品，再加入lOOmL乙腈后，放入匀浆机中匀浆2min，之后离心，保留上清液，将上清液用旋转蒸发仪(水浴温度5(TC)蒸发浓縮。将浓縮液移入加有NaOH的分液漏斗中，用二氯甲垸萃取，每次50mL，分4次进行，合并二氯甲烷萃取液，滤液于旋转蒸发仪上40。C浓縮近干后进行柱层析。层析柱长20cm，内径1.5cm，最底层铺入少量玻璃纤维，再自下而上依次填装2cm厚无水硫酸钠，10g弗罗里硅土，3cm厚无水硫酸钠。先用乙酸乙酯淋洗液预淋层析柱，弃去前10mL淋出液，然后倒入样品浓縮液，收集净化液于旋转蒸发仪4(TC浓縮近干，并用乙腈定容至5mL，摇匀，过0.45nm微孔滤膜，待测。3.色谱条件色谱柱岛津Shim-packVP-0DS色谱柱，长150腿X内径4.6腿；流动相V(乙腈)V(水)=90:10;流速1.OmL/min;UV检测器波长299nm;柱温20。C;进样量20uL。4.标准曲线的建立采用面积定量，将吡蚜酮标准溶液浓度5mg/L，lmg/L，0.5mg/L，0.lmg/L，0.05mg/L，0.Olmg/L作为横坐标，峰高为纵坐标，所得标准曲线线性回归方程为y=268312x+28589(R2=0.9995)，计算得出在上述条件下吡蚜酮的最小检出量为1.OX1010g，最低检出浓度为0.005mg/kg。5.计算方法I—C-KxlOOO—MxlOOO式中X为样品中农药残留量(mg/kg)C为被测样品的浓度(ng/pL)V为试样最后定容体积(mL)M为样品质量(g)6.回收率试验对稻谷样品进行吡蚜酮标准添加回收率试验。结果见表3，0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg三个浓度的吡蚜酮平均添加回收率分别为91.71%，86.76%和95.65%，变异系数分别为1.69，1.55和0.76。说明该方法的准确度和精密度符合残留试验准则要求。表3吡蚜酮在稻谷中添加回收率的实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>吡蚜酮在稻谷中添加回收率的实验结果权利要求1、一种粮食和蔬菜中吡蚜酮残留量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤第一步，取样取谷类、豆类或蔬菜样品，谷类和豆类样品粉碎过筛，蔬菜取可食部分，擦去样品表面的附着物，采用四分法，将其切碎，充分混匀，制成样品，放入分装容器中备用；第二步，提取称取上述样品置于锥形瓶中，加入有机溶剂，经震荡、过滤、浓缩，净化后备测；第三步，标准溶液的配制称取吡蚜酮标准品，用有机溶剂溶解定容，制成10mg/L的储备液，将吡蚜酮标准储备液稀释，配置成5mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.1mg/L、0.05mg/L、0.01mg/L的标准工作液，待仪器状态稳定后，用系列标准溶液进样，保留时间定性，以峰面积和标样浓度制作标准曲线，然后对第二步收集的净化样品进行检测，外标法定量；第四步，在第三步的基础上进行液相色谱分析检测。2、根据权利要求1所述的粮食和蔬菜中吡蚜酮残留量的检测方法，其特征是，第一步中，所述取谷类、豆类或蔬菜样品，所取重量等于或者大于1Kg。3、根据权利要求1所述的粮食和蔬菜中吡蚜酮残留量的检测方法，其特征是，第一步中，所述过筛是指过420um标准网筛。4、根据权利要求1所述的粮食和蔬菜中吡岈酮残留量的检测方法，其特征是，第二步中，所述样品置于锥形瓶，是指将10g20g样品置于250mL锥形瓶。5、根据权利要求1所述的粮食和蔬菜中吡蚜酮残留量的检测方法，其特征是，第二步中，所述有机溶剂，是指乙腈、二氯甲垸、乙酸乙酯、甲苯、乙醇、辛醇、丙酮的一种或几种混合液体。6、根据权利要求1所述的粮食和蔬菜中吡蚜酮残留量的检测方法，其特征是，第二步中，所述浓縮，是指用旋转蒸发仪将样品在40。C一5(TC的范围内浓縮，浓縮近干，或者浓縮到lmL2mL。7、根据权利要求1所述的粮食和蔬菜中吡蚜酮残留量的检测方法，其特征是，第三步中，所述有机溶剂，是指乙腈、甲醇、正己垸、异丙醇、丙酮、四氯化碳的一种或几种混合液体。8、根据权利要求1所述的粮食和蔬菜中吡蚜酮残留量的检测方法，其特征是，第三步中，所述储备液，具体为称取吡蚜酮标准品0.0100g，用有机溶剂溶解定容至100mL，制成10mg/L的储备液。9、根据权利要求1所述的粮食和蔬菜中吡蚜酮残留量的检测方法，其特征是，第四步中，所述的液相色谱分析检测，其条件为色谱柱岛津Shim-packVP-ODS色谱柱，长150mmX内径4.6mm，流动相乙腈水体积比=9585:515，流速0.6mL/min或1.OmL/min，检测器波长299nm，柱温4(TC或20。C，进样量20uL或lOyL。全文摘要本发明涉及一种农业
技术领域：
的农产品中吡蚜酮残留量的检测方法，步骤为取样、提取、净化、对净化样品进行液相色谱分析检测，外标法定量。本发明用有机溶剂与水的混合液作为流动相，使用长150mm×内径4.6mm的VP-ODS液相色谱柱，采用紫外检测器，对吡蚜酮进行液相色谱分析检测。其标准曲线制作方法为，称取吡蚜酮标准品，用有机溶剂溶解定容，制成10mg/L的储备液，将吡蚜酮标准储备液稀释，配置成5mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.1mg/L、0.05mg/L、0.01mg/L的标准工作液，待仪器状态稳定后，用系列标准溶液进样，保留时间定性，以峰面积或蜂高和标样浓度制作标准曲线。文档编号G01N30/00GK101231272SQ20081003222公开日2008年7月30日申请日期2008年1月3日优先权日2008年1月3日发明者姚来峰,燕张,沈国清,璇胡申请人:上海交通大学