专利名称：快速检测新城疫病毒的方法及其免疫胶体金测试卡的制作方法
技术领域：
本发明涉及养殖场、防疫检疫部门以及医疗机构等单位诊断或检测新城疫病毒的技 术，具体涉及快速检测新城疫病毒的方法，以及一种新城疫病毒免疫胶体金测试卡。
背景技术：
新城疫病毒(Newcastle disease, ND)是一种急性、败血性、髙度接触性传染病， 其传播迅速，发病率和死亡率高。 一旦爆发，会给养鸡业造成不可估量的经济损失。因此 养殖场、防疫检疫部门以及医疗机构等单位经常需要诊断或检测结果。国家质检总局在 2001年下发文件，要求对食肉出口企业进行每两个月一次的定期监测，该规定要求用鸡胚 病毒分离方法。鸡胚病毒分离方法是一种敏感特异方法，但是耗时较长，约需3周左右， 且操作烦琐，只能起监测作用，不能作快速检测用，不利于快速通关和控制禽肉携带病毒。 CN1827775A (专利申请号为200510008997. 6)"检测新城病毒的核苷序列、试剂盒及检验 方法"，该发明选择新城疫病毒F基因(合成F蛋白)作为靶区域，选择能够反映裂解位 点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针，建立荧光PCR检测新城疫病毒，该 方法比传统的方法灵敏度高100 1000倍，但从样品处理到出结果需要4小时左右， 该方法的实施还需荧光定量PCR仪等昂贵仪器，不宜在基层推广。
目前，现有技术对新城疫病毒的诊断或检测主要包括血凝抑制(HI)试验检测抗血凝 素(HA)抗体；酶联免疫吸附测定OiLISA)方法检测新城疫病毒共有的特异性抗体或抗原。 其中HI试验虽然比较敏感，但受外界因素影响较大而削弱了其实用价值；ELISA检出阳性 血清时间早，敏感度高，与HI试验相比更适合于大批量血清学调查，但因其条件要求髙， 操作不便，在实际应用中未能发挥其应有作用。而免疫荧光技术(IFT)存在假阳性(非特异 性荧光)问题。利用基因扩增(POO方法可直接检出病毒的基因，农业部动物检验所新城 疫检测实验室在国内首先建立一步法PT-rcR快速检测强毒新城疫，将新城疫的检测时间 缩短到12小时之内。但所需的设备昂贵，在临床检测方面受到了很大的限制。可见研究 一种快速检测新城疫病毒的诊断试剂以便对疫情进行现场及时监控，已经是目前畜牧生产 中急需解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种操作简单、快速、敏感和特 异性好的一种快速检测新城疫病毒的方法一胶体金免疫层析法。
本发明的另一目的是提供实现所述方法的新城疫病毒免疫胶体金测试卡。 本发明的目的是这样实现的 一种快速检测新城疫病毒的方法，包括如下步骤
1) 建立新城疫病毒单克隆抗体(Abl,Antibody 1)和羊抗新城疫病毒多克隆抗体 (Ab2, Antibody 2)以及羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗体(Ab3, Antibody 3);
其中，新城疫病毒单克隆抗体是利用杂交瘤技术通过细胞融合，克隆筛选制成特异性 新城疫病毒单克隆抗体；羊抗NDV抗体是用纯化NDV抗原免疫山羊后，提取免疫羊血清中 的免疫球蛋白制成羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗体是用Balb/C小鼠的免疫球蛋白作为 抗原，免疫羊，提取免疫羊血清中的抗体球蛋白制成；
2) 结合垫和NC膜的处理将玻璃纤维膜结合垫浸泡于抑mMNa2B4O7l0H20， 0.1% PVA， 0.1% Tween-20， 0.3。/oBSA的处理液中，于41C条件下浸泡10—12 h;然后于37tl 温度下烘干4一5h，再将所述新城疫病毒单克隆抗体Abl标记胶体金并喷在结合垫上；
硝酸纤维膜NC膜上:喷有线宽为1 ram的所述羊抗新城疫病毒多克隆抗体Ab2作为捕获 抗体，以及线宽为l mm的所述羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗体Ab3作为质控抗体；
3) 将待检测的样品加在样品垫上过滤后，样品中的NDV与结合垫中的金标抗体结合， 通过层析作用先与NC膜上的Ab2结合形成可见的结合线，未结合完的金标抗体继续层析 与Ab3结合，形成第二条；
4) 观察结果阳性则出现两条结合线；阴性则仅出现一条质控线；试剂条无效则不
出现线条。
一种新城疫免疫胶体金测试卡，由试剂条和测试卡盒构成；其中，试剂条由背衬、样 品垫、结合垫、NC膜和吸水垫组成，背衬上中部设有NC膜，NC膜的两端分别相邻连接 结合垫和吸水垫；样品垫设于结合垫的上方；结合垫上喷有金标抗体Abl; NC膜上分别喷 有线宽为1 ram的捕获抗体Ab2线和质控抗体Ab3线；结合垫放在金标抗体与样品中NDV 结合的位置；
测试卡盒由盒体和盒盖组成，盒盖上设有一个加样孔和一个阅读窗口，加样孔正对样 品垫；阅读窗口正对NC膜；盒体的中部设有用于固定所述试剂条的凹槽，凹槽的两侧均 匀设有用于与盒盖连接的凸柱。
相比现有技术，本发明具有如下优点
本发明釆用胶体金标记技术原理，即用胶体金作为示踪标记物，依据新城疫抗原抗体反应的特异性；根据胶体金的高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应等物理特性，加上 结合物所具有的免疫生物学特性，对新城疫病毒血凝素蛋白单克隆抗体进行标记。再利 用免疫胶体金层析技术制成胶体金试剂条，该试纸条可以检测患病动物血液、粪便中的新 城疫病毒。这种技术具有操作简单、快速、敏感和特异性好等特点。
新城疫免疫胶体金测试卡结构简单，易于掌握使用；并且成本低廉，适用于基层或临 床检测新城疫病毒；可以检测禽类血液、粪便的新城疫病毒，10min左右出结果，敏感性 达10ng/ml，可用于新城疫的快速诊断，适用于涉及需要新城疫快速诊断或检测的养殖场、 防疫检疫部门以及医疗机构等。
图1是本发明试剂条的结构示意图； 图2是本发明测试卡盒的结构示意图； 图3是本发明测试卡盒体的结构示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对木发明作进一步说明。 快速检测新城疫病毒的方法，包括如下步骤
1、 本发明利用抗原抗体反应的特异性和胶体金免疫层析简单快速原理，建立了新城 疫病毒单克隆抗体(Abl, Antibody 1)和羊抗新城疫病毒多克隆抗体(Ab2, Antibody 2)以 及羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗体(Ab3, Antibody 3);
2、 确定结合垫厳佳处理液(80mM Na2B4O710H2O， 0.1% PVA， 0.1% Tween-20， 0.3%BSA,其中的百分比均为重量百分比)，将结合垫(玻璃纤维膜)浸泡于处理液中， 在4"C条件F过夜(约12小时)；然后于37r条件下烘干(2—5h);再将Abl标记胶体金 并喷在结合垫上，Ab2和Ab3分别喷在硝酸纤维膜(NC膜)上作为捕获抗体Ab2线和质控 抗体Ab3线，然后通过结合垫、样品垫、背衬、塑料卡等分别组装成试剂条和测试卡。
3、 将待检测的样品加在样品垫上过滤后，样品中的NDV与结合垫中的金标抗体结合， 通过层析作用先与NC膜上的Ab2结合形成可见的结合线(检测线，简称T线)，未结合完 的金标抗体继续层析与Ab3结合，形成第二条结合线(质控线，简称C线)；
4、 观察结果阳性则出现两条结合线；阴性则仅出现一条C线；试剂条无效则不出 现线条。
实现所述方法的新城疫免疫胶体金测试卡，由试剂条和测试卡盒构成；如图l所示，其中，试剂条由背衬l、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维NC膜4和吸水垫5组成，背衬l、 样品垫2、结合垫3、硝酸纤维NC膜4和吸水垫5均为宽度相当的薄片条形结构，背衬l 上平面的中部设有NC膜4 (即硝酸纤维NC膜)，硝酸纤维NC膜4的两端分别相邻连接结 合垫3和吸水垫5;样品垫2设于结合垫3的上方；结合垫3上喷有金标抗体Abl (新城 疫病毒单克隆抗体)；硝酸纤维NC膜4上喷有线宽为1 mm的捕获抗体Ab2 (羊抗NDV抗体) 和质控抗体Ab3 (兔抗Balb/C球蛋白抗体)；结合垫3放在金标抗体与样品中NDV结合的 位置。试剂条置于测试卡盒的
如图2和图3所示，测试卡盒由盒体11和盒盖8扣合(卡接)而成，盒盖8上设有 一个加样孔9和一个阅读窗口 10，加样孔9正对样品垫2，是加样品的位置；阅读窗口 10 正对硝酸纤维NC膜，阅读窗口 IO旁印有T和C字母，分别代表NC膜检测线的位置和质 控线的位置。盒体11的中部设有用于固定所述试剂条的凹槽12,凹槽12的两外侧均匀设 有用于与盒盖8连接的凸柱13;图中，14是支撑试剂条的凸块。试剂条置于测试卡盒的 凹槽12中。
本发明试剂条和测试卡的制备方法
1.2.1新城疫病毒单克隆抗体(AIV McAb):这是发明的核心之一，其利用杂交瘤技 术通过细胞融合，克隆筛选制成特异性新城疫病毒单克隆抗体。该抗体针对新城疫病毒的 血凝素，该抗体决定了试剂条的特异性。用此抗体标记胶体金，制成金标抗体，可与待检 样品中的NDV特异结合，所以此抗体标记胶体金后喷在结合垫上。
1.2.2羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗体这种抗体是用Balb/C小鼠的免疫球蛋白作 为抗原，免疫羊，提取免疫羊血清中的抗体球蛋白制成。用在NC膜上的质控线上，可与 金标抗体结合，以此检验试剂条的有效性。
1.2.3羊抗NUV抗休这种抗体是用纯化NDV抗原免疫山羊后，提取免疫羊血清中的 免疫球蛋白制成的。该抗体用在试剂条NC膜上的捕获线上，可与金标抗体一NDV抗原抗体 复合物结合，形成夹心抗原抗体复合物。用此检测样品中的NDV，是该发明重要内容之一。
1.2.4 NDV单克隆抗体的胶体金标记及纯化用氯金酸制备胶体30nm金颗粒，将NDV 单克隆抗体标记胶体金，标记有胶体金的抗体经离心纯化，采用1% BSA的缓冲液将金标 抗体悬浮保存.悬浮后的金标抗体在室温或在试剂条中能保持一年以上。
1.2.5样品垫和结合垫的特殊处理样品垫经处理液浸泡后，在371C的温度下干燥 2h后，切成40mm宽度，用于过滤样品中的有形成分，同时又不能使NDV抗原变性。样 品垫放在试剂条(卡)的最前端，在试剂卡样品孔的下端。结合垫处理方式与样品垫相同，均需用缓冲液浸泡，干燥后喷金标抗体，置于样品垫下，并与NC膜相连。结合垫放在金 标抗体与样品中NDV结合的地点，然后借助层析作用向NC膜移动。
1.2.6该试剂条的生产工艺流程该流程主要由以下几个步骤组成
1) NDV金标抗体的制备用氯金酸制备胶体金颗粒，颗粒大小30nm:然后将NDV单 克隆抗体与胶体金颗粒18ng/ml进行标记，标记完后用牛血清白蛋白(BSA)进行封闭。标 记好的金标抗体用高速离心法进行纯化，去除游离抗体和蛋白及其它小分子物质。
2) 结合垫和样品垫的处理将结合垫和样品垫放入相应的缓冲液中浸泡、干燥，结 合垫喷标记好的金标抗体，然后干燥。将结合垫切成50咖的宽度，样品垫切成40mm宽 度。
3) 试剂条板的制备撕去背衬上的不干胶纸，分别贴上NC膜、结合垫(已喷有金标 抗体)、样品垫和吸水垫纸。
4) NC膜的喷样将制备好的试剂条板上的NC膜分别喷上捕获抗体(羊抗NDV抗体) 和质控抗体(兔抗Balb/C球蛋白抗体)，线宽l咖.喷完后在37"€的温度下干燥。
5) 试剂条板切条和测试长的组装将NC膜喷有抗体的试剂条板切成50mmX10mm的 试剂条，立即放入有千燥剂的铝箔袋内，封n:或将试剂板切成30 mmX10 mm的试剂条 放入测试卡盒内，立即放入铝箔袋内封门。
6) 试剂条的检验按每批1%进行抽样检验，包括外观、试剂条的敏感性、特异性 和保存期加速试验等，验证试剂条的可靠性。
以上实施方式仅用于帮助本领域技术人员更加全面的理解本发明，但并不对本发明作任 何限制。凡依照木发明的内容所做出的任何本领域等同的替换均属于本发明保护的范围之内。
权利要求
1. 一种快速检测新城疫病毒的方法，包括如下步骤1)建立新城疫病毒单克隆抗体(Ab1，Antibody 1)和羊抗新城疫病毒多克隆抗体(Ab2，Antibody 2)以及羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗体(Ab3，Antibody 3)；其中，新城疫病毒单克隆抗体是利用杂交瘤技术通过细胞融合，克隆筛选制成特异性新城疫病毒单克隆抗体；羊抗NDV抗体是用纯化NDV抗原免疫山羊后，提取免疫羊血清中的免疫球蛋白制成；羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗体是用Balb/C小鼠的免疫球蛋白作为抗原，免疫羊，提取免疫羊血清中的抗体球蛋白制成；2)结合垫和NC膜的处理将玻璃纤维膜结合垫浸泡于80mM Na2B4O710H2O，0.1％PVA，0.1％Tween-20，0.3％BSA的处理液中，于4℃条件下浸泡10-12h；然后于37℃温度下烘干4-5h，再将所述新城疫病毒单克隆抗体(Ab1)标记胶体金并喷在结合垫上；NC膜上分别喷有线宽为1mm的所述羊抗新城疫病毒多克隆抗体(Ab2)作为捕获抗体，以及线宽为1mm的所述羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗体(Ab3)作为质控抗体；3)将待检测的样品加在样品垫上过滤后，样品中的NDV与结合垫中的(Ab1)金标抗体结合，通过层析作用先与NC膜上的(Ab2)结合形成可见的结合线，未结合完的金标抗体继续层析与(Ab3)结合，形成第二条；4)观察结果阳性则出现两条结合线；阴性则仅出现一条质控线；试剂条无效则不出现线条。
2、 实现权利要求l所述方法的新城疫免疫胶体金测试卡，由试剂条和测试卡盒构成； 其中，试剂条由背衬(1)、样品垫(2)、结合垫(3)、 NC膜(4)和吸水垫(5)组成，背 衬(1)上平面的中部设有NC膜(4)， NC膜(4)的两端分别相邻连接结合垫(3)和吸水 垫(5);样品垫(2)设于结合垫(3)的上方；结合垫(3)上喷有金标抗体Abl; NC膜(4)上喷有线宽为1 ram的捕获抗体Ab2 (6)和质控抗体Ab3 (7);结合垫(3)放在金 标抗体与样品中结合的位置测试卡盒由盒体UO和盒盖(8)组成，盒盖(8)上设有一个加样孔(9)和一个 阅读窗口 (10)，加样孔(9)正对样品垫(2);阅读窗口 (10)正对NC膜(4);盒体(11) 的中部设有用于固定所述试剂条的凹槽(12)，凹槽(12)的两侧均匀设有用于与盒盖(8) 连接的凸柱(13)。
全文摘要
本发明提供一种快速检测新城疫病毒的方法，包括如下步骤建立新城疫病毒单克隆抗体和羊抗新城疫病毒多克隆抗体以及羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗体；对结合垫和NC膜的处理；将待检测的样品加在样品垫上过滤后，样品中的NDV与结合垫中的金标抗体结合，通过层析作用先与NC膜上的Ab2结合形成可见的结合线，未结合完的金标抗体继续层析与Ab3结合，形成第二条；最后观察结果阳性则出现两条结合线；阴性则仅出现一条质控线。具有操作简单、快速、敏感和特异性好等特点。并且价额低廉，适用于基层或临床检测新城疫病毒；可以检测禽类血液、粪便的新城疫病毒，10min左右出结果，敏感性达10ng/ml。本发明还提供了实现所述方法的新城疫免疫胶体金测试卡。
文档编号G01N33/577GK101285839SQ20081006977
公开日2008年10月15日 申请日期2008年5月29日 优先权日2008年5月29日
发明者吴胜昔, 胡仁建, 蔡家利 申请人:重庆工学院