专利名称：：评判孕妇早产风险的胶体金试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及一种用胎儿纤维连接蛋白(fFN)和白介素6(IL-6)联合评判孕妇早产风险的胶体金试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的制备方法，属于评判孕妇早产风险的试剂领域。
背景技术：
：早产是一种严重的威胁健康的问题，早产儿患新生儿健康并发症(发育不良)的危险性较高。如智力低下，脑瘫，肺部以及消化道问题，丧失视觉和听觉以至于死亡，因此预测早产对于降低早产危害具有重要意义。从1981年以来，妇女的早产率增加了30%还多。在过去的20年中，尽管科技和医学不断进步，早产率仍然每10年大约增加10%。目前，美国约12.5%的婴儿是早产儿，而提早分娩是美国婴儿发病和致死的第一原因。在中国，统计到的早产发生率为8-10%。妊娠期少于36周出生的婴儿被称为早产儿，其中妊娠期在34-36周约占70%，妊娠期在32-33周约占13%，妊娠期在28-31周约占10%，另有6%妊娠期不足28周。早产在中国约为分娩总数的8-15%，早产儿发育不成熟，体重轻(一般低于2500克)。中国的早产儿死亡率高达15%，10%早产儿有终身后遗症。早产是一种严重的威胁健康的问题，对家庭、社会、接生医院、医生及早产儿本人会有较大的精神负担和物质负担。当前预测早产的主要有物理指标和生化指标两种方法1、物理指标及相关检测方法宫颈评价宫颈指数(漏斗长度+1/宫颈管长度)阴道指检主观性，创伤性，易感染宫颈阴道超声检查特异性差，影响因素较多。2、生化指标及相关检测方法各种激素在血液和/或体液中的含量促肾上腺激素释放素(corticotrophin-releasinghormone,CRH)，血桨中的CRH水平可预测早产，尤其是应激性早产；雌三醇(estriol，E3):唾液中E3含量的变化可预测早产(受饮食等环境干扰较大，特异性差，误差大)；炎性因子白介素6，8(IL-6，8):白介素6在体液中的含量预测早产，尤其感染性早产。以上预测早产的方法虽各有特点，但仍然缺乏一种可靠，简单方便，经济快捷，灵敏度和特异性都很好的临床检测方法来协助妇产科医生预测早产。胎儿纤维粘连蛋白(fFN)是一种连接胎囊与子宫内膜的生物胶。孕妇在正常妊娠22到35周之间，由于绒毛膜和蜕膜的融合，其体液中的胎胶蛋白含量极低。分娩时，胎胶蛋白会与母体和胎儿分离溶于羊水并被宫颈与阴道分泌物所溶解。孕妇宫颈阴道分泌物中胎儿纤维连接蛋白的存在是胎儿分娩的最终灵敏标志物。MatthewaGetal等在研究中发现，宫颈阴道分泌物中的IL-6预测高危妇女的早产是独立的，并且是至少等同于宫颈扩张和FFN在预测早产中的地位，并报道IL-6>35pg/ml时预测早产的敏感度77%，特异度60%，阳性预测值12%，阴性预测值97%。大量的专业研究成果和实验证明了孕妇体液中胎胶蛋白含量同早产的密切相关性。在妊娠22-35周期间，孕妇宫颈阴道分泌物中胎胶蛋白的存在表明"胶体"比预期提前脱离，是早产的高危信号，目前研究认为早产前宫颈分泌物中fFN水平增高的产生机制主要有两种一种是早产前的蛋白分解及机械性破坏绒毛-脱膜细胞外基质接触面，使fFN完整释放或降解进入宫颈阴道分泌物中；另一种是与早产密切相关的炎症过程使蛋白水解酶释放，破坏绒毛细胞外基质，使fFN释放增加。因此，宫颈阴道分泌物中fFN的出现是预测早产的较理想的指标。宫颈分泌物中的FFN和IL-6水平与早产密切相关，FFN和IL_6有相关性。FFN和IL-6均是预测早产和一周内分娩的较为敏感的指标，联合检测两项指标将提高早产和一周内分娩的预测能力，可作为一种新的预测早产和一周内分娩的方法。FFN和IL-6与取样至分娩间隔天数均呈负相关，随着它们水平的增加，分娩间隔明显縮短，发生早产的可能性更大，而且FFN和IL-6阳性与妊娠的不良结局fFN在早产预测中的意义和价值日益受到关注，其在早产中的预测价值，尤其是阴性预测价值已较为肯定。由于早产并非单-原因引起，因此，fFN检测与IL-6联合检测对于提高早产预测值具有重要意义。[OOM]免疫层析法(Imm皿ochromatogr即hy)是九十年代在美国兴起的一种基于免疫胶体金技术的快速诊断技术，临床上应用的产品主要采用双抗体夹心的设计，此技术与以往的任何一项检测技术相比的突出优点，快速(全部检测过程仅需3-20分钟)、准确、简便、价格低廉、人为操作误差小、稳定性好等特点外，由于该层析法为通过硝酸纤维素膜进行横向流动，允许并联多个试剂条进行多项指标联合检测，从而达到联检的目的。
发明内容本发明目的在于应用免疫层析法研制出一种可靠的临床检测试剂，通过检测fFN及IL-6两种早产标志物，从而大大提高孕妇的早产预测值，适合孕期妇女自我检测及临床医院检测是否有早产的风险。具体的，本发明目的是通过以下技术方案来实现的—种评判孕妇早产风险的胶体金检试剂盒，包括检测卡、吸滴管、加样杯和一次性注射器；所述的检测卡自下而上依次由样品垫、胶体金标记的结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫的各自的边缘连接在一起后固定于背衬上而组成；其中，所述的硝酸纤维素膜上含有由抗胎儿纤维粘连蛋白单克隆抗体和抗白介素_6(IL-6)单克隆抗体分别包被而成的2条检测线和1条由羊抗鼠IgG包被而成的对照线；其中，羊抗鼠IgG对照线靠近吸水纸一端，2条检测线靠近胶体金结合垫一端。所述的胶体金标记的结合垫按照以下方法制备得到将抗胎儿纤维粘连蛋白单克隆抗体和抗白介素_6单克隆抗体分别用金溶胶粒标记后，将其混合，包被于玻璃纤维上，即得；其中，所述的硝酸纤维素膜可以由尼龙膜等代替。所述的背衬可以是各种硬质的支持物，只要具有一定的硬度具有附载或支持的功能都可用于本发明，例如可以是塑料板(PVC)、硬纸板等，优选为PVC。本发明试剂盒的使用方法及评判标准(1)检测对象用于检测女性阴道分泌物中fFN及IL-6;(2)标本采集常规消毒外阴，窥器扩张阴道暴露宫颈，将无菌棉签置于宫颈管内lOs，取出后置于PBS液lmL中，放置在一7(TC冰箱保存待用；(3)检测用吸滴管将标本(阴道分泌物)收集在加样杯中，将试纸刻度线(标记)以下浸入样本中。等候约1分钟，将样本完全被吸收之后，取出鉴定片进行鉴定；[OO32](4)测定原理本发明检测试剂盒采用两点夹心固相免疫层析法定性检测阴道分泌物中的fFN及IL-6。在试剂盒的检测区分别包被有抗fFN及IL-6单克隆抗体，质控区包被有羊抗鼠IgG抗体。检测时阴道分泌物中的fFN或IL-6与试剂盒上事先包被的胶体金标记抗fFN或IL-6单克隆抗体结合成结合物，该结合物随着膜的毛细管作用向上迁移到达检测区，与膜上的抗fFN或IL-6抗体起反应，出现一条或两红色条带。无论标本中是否存在fFN或IL-6，当液面继续迁移至固定羊抗鼠IgG区带时，质控区应该会出现一条红色条带。如果如果检测区(T)同时出现两条红色条带，质控区出现一条红色条带，则表明被测者出现早产的风险非常高；如果检测区(T)只出现一条红色条带，质控区出现一条红色条带，则表明被测者存有一定的早产风险；如果只有质控区(C)出现红色条带，而检测区(T)没有出现红色条带，则表明被测者出现早产的可能性极低；如果质控区(C)没有出现红色条带，则需要重新判定样本量是否足够或需要分析层析过程是否正常等本发明为免疫层析胶体金快速检测技术，定性或者半定量检测阴道分泌物中的胎儿纤维连接蛋白及IL-6，将已纯化的抗fFN及IL-6的单克隆抗体利用自动微量喷点设备，分别固定在已经过预处理硝酸纤维素膜上，再将已用胶体金标记的抗fFN及IL-6单克隆金标抗体分别固定在玻璃纤维膜上，制备成金结合物垫，再辅以恰当的样品处理垫(聚酯膜)，组合成为检测卡。采用双抗体夹心法原理，可快速检测孕早期妇女阴道分泌物中的fFN及IL-6。本发明采用了两种标志物联合检测早产，克服了以前分开检测方法的敏感性差的缺点，本发明3分钟后可以判断结果，不需要特殊仪器，肉眼直接判读结果。准确、快速、操作简单，可单人份使用，适用于家庭自助检测等需要快速检测的用途。图1本发明试剂盒中的检测卡示意图；从左至右依次由样品垫、胶体金标记的结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫连接在一起后固定于背衬之上。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式5进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1本发明胶体金诊断试剂盒的制备1、制备抗fFN及IL-6的单克隆抗体分别用纯化的fFN(请给出)及IL-6膜蛋白免疫纯系小鼠，小鼠血清产生相应的抗体时，即可将小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合。利用HAT选择杂交瘤细胞，并用酶联免疫吸附试验(ELISA)对McAb进行检测。对于检测抗体阳性的杂交瘤应用有限稀释法进行克隆，同时保存阳性细胞株，利用BALB/c纯系小鼠制备大量的单克隆抗体，同时对抗体特异性的鉴定、识别抗原表位的鉴定、亲合力的鉴定及配对试验，筛选出效果最好的一对细胞株。将筛选到的细胞株重新植入小鼠腹腔中，过5-6天取出腹水，利用硫酸铵盐析及亲和层析纯化得到单克隆抗体。2、胶体金试纸条的制备2.1胶体金的制备(1)用5毫升微量移液枪取3ml1%的四氯金酸于500ml的圆底烧瓶中，量取297ml的超纯水亦加入烧瓶中，配制成0.01%的四氯金酸反应液，充分搅拌混匀；(2)连接上蛇形冷凝管，开启冷凝水，并置于磁力加热搅拌器上，加热煮沸；(3)放入搅拌子，剧烈搅拌，然后一次性，快速准确的加入3ml柠檬酸钠溶液；(4)金黄色的氯金酸水溶液首先变成灰色，约2分钟后变为紫红色，继续煮沸5分钟；(5)关闭磁力加热搅拌器，待胶体金冷却后，分装于500ml的玻璃试剂瓶中，外面覆上铝箔，按规定贴上标签；制备的胶体金应呈现透亮的紫红色，没有聚合物及肉眼可见的沉淀；取适量于530nm波长处测定，紫外吸收值在1.3之间。2.2制备免疫金(1)根据用拟标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质的总量，本工艺每ml胶体金标记12ug/抗体，标记的抗体量为3.6mg;(2)用0.1M的碳酸钾或者0.1M盐酸调节胶体金的ra值为7.8;(3)在电磁搅拌下，将抗体蛋白质溶液加入胶体金溶液中，加入蛋白质时应逐滴加入，lmg的蛋白质大约5min加完；(4)抗体和胶体金反应5分钟后，在磁力搅拌下加入5%的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1%;(5)10分钟后，加入3%的PEG20000至终浓度为0.3%;(6)继续反应1小时或者过夜；(7)将标记好的胶体金溶液于2000r/min，4。C离心10min，吸出上清，弃去沉淀，以去除大的聚合物；(8)调整离心机的转速为10000g/min，在4。C离心30分钟，弃上清，将沉淀以原体积的0.Olmol./1PBSpH8.2(内含1%BSA)溶解，重复离心3次;(9)最后一次小心弃去上清，沉淀溶于溶于原体积的1/50PBS(内含1%BSA)中，即得免疫金；2.3检测线和对照线包被(将检测抗体固定在硝酸纤维膜上)检测线划线分别将抗fFN及IL-6膜蛋白单克隆抗体装入BioDot喷膜机中(蛋白微量喷膜系统)，在硝酸纤维素膜上按1P1/cm的量划上(膜规格为25mmX310mm);对照线划线羊抗鼠抗体包被液装入BioDot喷膜机中(蛋白微量喷膜系统)，在硝酸纤维素膜上按1P1/cm的量划上(膜规格为25mmX310mm);包被37°C包被2小时；封闭37°C封闭30分钟；干燥将包被后的硝酸纤维素膜放入真空干燥器内干燥20小时，密闭保存待用。2.4结合垫制备(1)开启点膜仪，预热30分钟，用蒸馏水作10个循环；(2)调整免疫金的0D值为30，将免疫金加入机器左边的塑料容器内，设置程序，调整2#喷头喷量为2.5UL/CM，将免疫金均匀喷涂在玻璃纤维结合垫上，喷线的位置在结合垫的中央；(3)喷完结合垫后，置于37t:烘箱中干燥30分钟；干燥将标记后玻璃纤维放入真空干燥器内干燥20小时，取出密闭保存待用。2.5检测卡的制备(1)在塑料底板的中央撕去覆于上面的胶带，贴上包被好抗体的硝酸纤维膜；(2)撕去塑料板中央下面的宽为5mm的胶带，贴上喷上胶体金的结合垫，结合垫前端与硝酸纤维膜重叠2mm;(3)撕去塑料板最下面宽为20mm的胶带，贴上经过预处理的样品垫，样品垫的前端与结合垫重叠约5mm;(4)撕去塑料底板的最上端约为25mm的胶带，贴上吸水纸，吸水纸与硝酸纤维膜重叠约2mm;(5)组装完后，将每一个配件都压实，检查粘贴的效果，将组装好的大卡用切条机切成3mm宽的试纸条；(6)把切好的试纸条装在测试卡中，即得。2.6试剂盒的组装将吸滴管、样品加样杯、一次性注射器、制备好的检测卡和使用说明书组装在一个盒子里，即得本发明试剂盒；试验例1本发明试剂盒临床评判孕妇早产风险几率的试验选择2007年3月一2008年9月在黑龙江省人民医院产前门诊及住院治疗孕2834周初产妇141例，分为3组。I组41例，入选标准①有不规则宫縮^4次/h;②宫口扩张<2cm;③胎膜完整。II组40例，入选标准①有规律性子宫收縮；②子宫颈扩张^2cm或有进行性子宫颈容受及子宫颈扩张；③有阴道血性分泌物或胎膜已破。2组均为单胎妊娠。III组(对照组)60例，为相同孕周的单胎正常孕妇。所有孕妇无产科及内、外科并发症。3组的年龄、孕次和取样孕周无显著性差异。应用本发明制备的试剂盒进行检测，统计结果见表1:表1本发明试剂盒临床检测孕妇早产的试验结果(％)7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>临床研究表明，本发明联合检测fFN与IL-6胶体金联检诊断试剂盒可以准确的评判出孕妇所存在的早产风险，能够显著提高早产的检出率，灵敏度高、特异性强，且检测过程非常快速(全部检测过程仅需3分钟)。权利要求一种评判孕妇早产风险的胶体金检试剂盒，包括检测卡、吸滴管、加样杯和一次性注射器；其中，所述的检测卡自下而上依次由样品垫、胶体金标记的结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫的各自的边缘连接在一起后固定于背衬上而组成；其中，所述的硝酸纤维素膜上含有由抗单克隆抗体和抗白介素-6单克隆抗体分别包被而成的2条检测线和1条由羊抗鼠IgG包被而成的对照线。2.按照权利要求1所述的胶体金检试剂盒，其特征在于所述的胶体金标记的结合垫按照以下方法制备得到将抗胎儿纤维粘连蛋白单克隆抗体和抗白介素_6单克隆抗体分别用金溶胶粒标记后，将其混合，包被于玻璃纤维上，即得。3.按照权利要求1或2所述的胶体金检试剂盒，其特征在于所述的硝酸纤维素膜上羊抗鼠IgG对照线靠近吸水纸一端，2条检测线分别靠近胶体金结合垫一端。4.按照权利要求1或2所述的胶体金检试剂盒，其特征在于所述的硝酸纤维素膜由尼龙膜代替。5.按照权利要求1或2所述的胶体金检试剂盒，其特征在于所述的背衬是各种硬质的支持物。6.按照权利要求5所述的胶体金检试剂盒，其特征在于所述的背衬是塑料板。全文摘要本发明公开了一种评判孕妇早产风险的胶体金试剂盒及其制备方法。本发明试剂盒包括检测卡，吸滴管、样品加样杯和一次性注射器；所述的检测卡依次由样品垫、胶体金标记的结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫连接组成。本发明分别将抗胎儿纤维连接蛋白单克隆抗体和抗白介素-6的单克隆抗体固定在硝酸纤维素膜或尼龙膜的不同位置上；用金颗粒标记上述两种单克隆抗体，将上述金标抗体混合后制备成金结合物垫，再加上样品垫和吸水垫，组合成为检测。临床研究表明，本发明试剂盒可以准确的评判出孕妇所存在的早产风险，显著提高早产的检出率，灵敏度高、特异性强，全部检测过程仅需3分钟，不需要特殊仪器，可肉眼直接判读结果。文档编号G01N33/577GK101750500SQ200810186280公开日2010年6月23日申请日期2008年12月22日优先权日2008年12月22日发明者张广秋申请人:哈尔滨奥正医药科技开发有限公司