专利名称：氮掺杂介孔碳固定化酶生物传感材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种氮掺杂介孔碳固定化酶生物传感材料及其制备方法。属于 生物催化和生物传感领域。
背景技术：
生物传感器是由固定化的细胞、酶、抗体或其它生物活性物质与信号转换 器相配合组成的传感器。它是近年来生物医学和电子学、工程学相互渗透而发 展起来的一种新型信息技术，具有特异性能强、灵敏度高、响应速度快、成本 低和使用寿命长等优点。，生物传感器在医、药、农、牧等学科和食品、发酵、 制药等工业部门以及环境监测等方面均有广泛的应用价值。
选择适当的载体材料使生物分子固定化是决定生物传感器特性的关键技 术。 一个成功的载体需要能够将生物分子稳定的固定或者结合在转换器表面， 并且能够保持生物分子的功能和活性，同时能够容易接触目标检测物，并且能 够与转换器表面有紧密的结合。其中介孔材料由于其高的比表面积、大的孔容 和均一的孔径分布而倍受人们的关注。各种各样的介孔硅材料已经被用于生物 传感器的制备，但是硅质材料低的导电率限制了电子在生物分子与电极之间的 传递。
最近，利用模板法制备介孔碳材料得到了大量报道，这些材料不仅具有高 的比表面积，大的孔容和均一的孔径分布，同时还有高的导电率和好的水、热
稳定性，因此非常适用于生物传感器的制备。Taeghwan Hyeon等(Adv. Mater 2005, 17, 2828-2833)将葡萄糖氧化酶负载在介孔碳上制备得到了高性能的葡 萄糖传感器，该传感器的灵敏度比以往报道的都要高出1 2个数量级，其检测 限也比以往文献报道的要低。这充分说明了介孔碳材料在生物传感器制备方面 的优势。但是介孔碳材料的生物兼容性不好，生物分子与其结合后活性损失严 重，这在很大程度上限制了其在生物传感领域的应用。另外，以往制备的介孔 碳孔径较小，不适合大的生物分子负载，这也是其用于生物传感器制备的不利 因素。
发明内容
本发明的目的是为了避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种 氮掺杂介孔碳固定化酶生物传感材料及其制备方法。 具体的制备步骤如下
(1) 制备碳氮前驱物溶液，碳氮前驱物溶液由碳氮前驱物、溶剂以及酸添 加剂在室温混合搅拌1 5小时得到，其中碳氮前驱物包括乙二胺、丙烯腈、三 聚氰胺或六亚甲基四胺，溶剂包括四氯化碳、甲醛、乙二醛或二甲基亚砜所用 酸添加剂包括对甲苯磺酸、衣糠酸等，碳氮前驱物溶液中碳氮前驱物的质量百
分数为5 60%，添加剂的质量百分数为0.1 5%。
(2) 将干燥的介孔氧化硅分子筛模板(如MCF、 MSU、 FDU-12等)浸 入到碳氮前驱物溶液中，在70 100。C搅拌1 12小时，然后在100 150°C处 理6 36小时，其中模板与碳前驱物溶液的质量比为0.05 0.5: 1。
(3) 将步骤(2)得到的产物在惰性气氛下碳化，碳化温度为500 900°C， 恒温时间为2 12小时。
(4) 将碳化后得到的复合物加入到质量比为2 20%的氢氟酸或2 30% 的强碱(氢氧化钠、氢氧化钾等)溶液中，室温或加热搅拌6 24小时，然后 过滤分离并洗漆，在60 120。C下干燥后得到去除模板后的氮掺杂介孔碳材料。
(5) 将步骤(4)中得到的产物，用10%~35%的硝酸在50~80 。C处理1~15 小时，以对其表面进行修饰。
(6) 酶分子的固定化，将步骤(5)得到的产物与酶分子以0.1 1的质量 比在室温下搅拌混合2 24小时，离心并洗涤，得到氮掺杂介孔碳固定化酶生物传 感材料。其中所用酶分子包括血红蛋白、肌红蛋白、葡萄糖氧化酶、木瓜蛋白 酶或辣根过氧化物酶。
本发明所得氮掺杂介孔碳固定化酶载体的特征为具有大孔径的高比表面 积、大孔容的介孔材料，主孔道由14-17 nm的介孔组成，次级孔则是由3~4 nm 的介孔组成，主要起连通作用，其比表面积在450n^gJ以上，孔容在0.80cm3 g"以上，其组成为CNx，其中X为氮原子与碳原子的摩尔比，由碳氢氮分析测 得其值为0.19 1.2。该材料具有很高的酶分子负载量，为17% 25%，且其负载 酶分子的活性也能保持在自由酶活性的40%以上。
所得到的氮掺杂介孔碳固定化酶重新分散于缓冲溶液中以后(如Nafion磷 酸缓冲溶液，壳聚糖磷酸缓冲溶液)，可以直接修饰在工作电极上(如热解石墨电极、玻碳电极、IT0玻璃电极或铂电极)，成膜，得到生物传感器用酶电极。 将得到的酶电极接入到电化学工作站中，采用循环伏安法测试其电化学特征， 用时间-电流法来测定该生物传感器对底物如双氧水的响应。测试结果表明，本 发明所得生物传感器具有极快的响应速度和宽的线性范围，其检测灵敏度得到 显著提高，而且它的检测限也很低。修饰后的氮掺杂介孔碳制备得到的生物传
感器对双氧水的检测灵敏度高达477 mAL mor1 cm—2，比以往报道的都要高。 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在
(1) 采用大孔径介孔硅为模板，制备得到大孔径的氮掺杂介孔碳，更有利于 大的生物酶分子负载在其孔道中，其负载量达到23.4%，比在其他介孔材料中得 到的高得多。
(2) 通过氮的掺杂，可以增加有效增加介孔碳表面的活性位点，使其更有利 于与酶分子进行结合，从而提高其生物相容性。
(3) 通过硝酸处理，对其表面进行亲水性修饰，使其更容易分散于水中，与 酶分子结合。另外，碳表面的亲水性修饰，也为酶分子提供了更好的亲水性微 环境，使酶分子的活性得到更好的保持，从而更有利于其在生物催化和生物传 感领域的应用。
(4) 本发明所制氮掺杂介孔碳有高热稳定性、化学稳定性，并且环境友好， 能保护孔道中的酶分子抵制热冲击。
(5) 由本发明所得材料制备得到的生物传感器具有快的响应时间、宽的线性 范围、很高的灵敏度和极低的检测限。
(6) 本发明获得生物传感材料的方法简单、便于控制、实用性强。
图1为氮掺杂介孔碳的透射电镜图。
图2为氮掺杂介孔碳吸附酶分子前后的氮气吸附曲线，图中从上到下依次 对应吸附酶分子前和吸附酶分子后的氮掺杂介孔碳。
图3为氮掺杂介孔碳吸附酶分子前后的孔径分布，图中从上到下依次对应 吸附酶分子前和吸附酶分子后的氮掺杂介孔碳。
图4为所制备传感的循环伏安图，图中实线和虚线分别对应实施例2和对 比例2。
图5为所制备传感的电流响应值对双氧水浓度的曲线，图中从上到下依次 对应实施例2、对比例2、实施例3。
具体实施例方式
以下以实施例的方式说明本发明，但不仅限于下述实施例。 实施例1
准确量取2.4ml乙二胺和3.4ml四氯化碳，混合均匀，加入0.5gMCF模板， 在90。C回流处理6小时，然后转移至烘箱干燥12小时，得到的固体用研钵研 细，然后在氮气气氛下，于600。C碳化5小时。所得碳化物用10。/。HF溶液处理 以除去硅模板。所得到氮掺杂介孔碳的氮气吸附曲线和孔径分布如图1和图2 所示，其比表面积和孔容分别为474m、」和0.85 cm3 g—1 ，由吸附曲线得到其 孔径约为17nm。
称取80mg所制得氮掺杂介孔碳，放入4ml的20。/。硝酸中，于60。C反应6h 进行修饰，过滤，洗涤并干燥。
称取10mg上述修饰过的氮掺杂介孔碳，加入2mg/ml的血红蛋白缓冲溶液 中，混合搅拌20h离心，洗涤，得到固定化的血红蛋白。血红蛋白能够催化双 氧水氧化邻羟基苯酚的反应，通过紫外来测试产物的量随时间的变化，可以得 到血红蛋白的催化活性。
由此得到氮掺杂介孔碳的透射电镜如图1所示，其孔道在17nm左右。氮 气吸附曲线(图2)和孔径分布(图3)表明该材料的比表面积和孔容分别为 474m2g-4Q 0.85 cm3 g—1 ，其孔径约为17 nm。其组分为CNX，由碳氢氮分析 测得X值为0.20。
该法所制得固定化血红蛋白的活性为自由酶活性的43.2%。其热稳定性也得 到很大提高，固定化血红蛋白在90。C的缓冲溶液中处理15分钟仍能保持76.6% 的活性，而自由血红蛋白在90°C的缓冲溶液中处理15分钟后就只有28.5%的 活性。
对比例1
采用未经过硝酸修饰的氮掺杂介孔碳来进行血红蛋白的固定化，其余操作 同实施例l。由此得到固定化酶的负载量为17.3%,同样比在其他介孔材料中报 道的要高。其活性为自由酶活性的14.1%，比实施例1中的耍低的多。该固定 化酶在90。C的缓冲溶液中处理15分钟仍能保持83.0%的活性。实施例2
将热解石墨电极在砂纸上打磨光滑，在去离子水中超声处理io分钟，取出 干燥。然后称取lOmg实施例1中得到的固定化酶，分散在2ml的5 wt%Nafion 磷酸缓冲溶液中，取0.5ml，均匀滴涂在热解石墨电极上，在室温下干燥成膜， 形成生物传感器用于电化学测定。
电化学测定在Cffl 440型电化学工作站上进行，采用三电极体系，其中石 墨电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极。所制得酶传感器的循 环伏安图如图4所示， 一对可逆氧化还原峰的出现说明该酶传感器能够实现酶 和电极间的直接电子传递，其电子传递速率常数为4.9s"，这比以往文献报道的都 要高，说明所制得酶传感器具有很高的电子传递速率。同时该酶传感器对双氧 水的电催化氧化也具有很快的响应时间(到达95 %饱和电流值的时间小于5秒) 和宽的线性范围(l 100,ol)，以及高的灵敏度和低的检测限。该酶传感器的 灵敏度为477mALmol"cm—2，比以往报道的都要高。其电流响应值对双氧水浓 度的曲线如图5所示。
对比例2
在实施例2中，其他实验方法和制备步骤不变，只是改用对比例1中得到 的固定化酶来制备酶传感器。由此得到的酶传感器，其循环伏安图如图4所示。 一对可逆氧化还原峰的出现，说明该酶传感器同样能够实现酶分子和电极之间 的直接电子传递，其电子传递速率常数为4.0s"，说明该酶传感器同样具有很快 的电子传递速率。该酶传感器对双氧水的电催化同样具有很快的响应时间(到 达95%饱和电流值的时间小于5秒)和宽的线性范围(1 120pmo1)。其电流响 应值对双氧水浓度的曲线如图5所示，由此计算得到该酶传感器的灵敏度为239 mALmor1 cnf2，比实施例2中的要低。
实施例3
在实施例2中，其他实验方法和制备步骤不变，只是将10mg实施例1中 的固定化酶分散于4ml的5 wt% Nafion磷酸缓冲溶液中，再取0.5ml用于制备 生物传感器。该酶传感器的响应时间同样小于5秒，线性范围为1 80pmo1。其 电流响应值对双氧水浓度的曲线如图5所示，由此计算得到该酶传感器的灵敏 度为142 mAL mo" cnf2，比实施例2和对比例2中的都要低。实施例4
在实施例1中，其他实验方法和制备步骤不变，只是将碳氮前驱物溶液由 乙二胺和四氯化碳的混合溶液改为三聚氰胺、乙二醛和对甲苯磺酸的混合溶液。
实施例5
在实施例1中，其他实验方法和制备步骤不变，只是将碳氮前驱物溶液由 乙二胺和四氯化碳的混合溶液改为丙烯腈、二甲基亚砜和衣糠酸的混合溶液。
实施例6
在实施例1中，其他实验方法和制备步骤不变，只是酶分子由血红蛋白改 为葡萄糖氧化酶。
实施例7
在实施例1中，其他实验方法和制备步骤不变，只是酶分子由血红蛋白改 为辣根过氧化物酶。
实施例8
在实施例2中，其他实验方法和制备步骤不变，只是将10mg实施例1中 的固定化酶分散于2ml的5wt。/。壳聚糖磷酸缓冲溶液中，再取0.5ml用于制备
生物传感器。
由上述实施例可以看出，通过氮的掺杂和表面的亲水修饰，介孔碳材料的 生物相容性得到很大的提高，其负载酶分子的活性得到了较好的保持，由此形 成的酶传感器，具有很快的响应时间，宽的线性范围，高的灵敏度和低检测限。
权利要求
1、氮掺杂介孔碳固定化酶生物传感材料，其特征主孔道由14～17nm的介孔组成，次级孔则是由3～4nm的介孔组成，其比表面积在450m2g-1以上，孔容在0.80cm3g-1以上，其组成为CNx，其中X为氮原子与碳原子的摩尔比，X为0.19～1.2，酶分子负载量为17％～25％。
2、 按权利要求1所述的氮掺杂介孔碳固定化酶生物传感材料，其特征在于 该材料可直接修饰在工作电极上，成膜，得到生物传感用酶电极。
3、 按权利要求2所述的氮掺杂介孔碳固定化酶生物传感材料，其特征在于， 由该材料制得的传感具有很快的响应时间，宽的线性范围，高的灵敏度和低的 检测限。其检测灵敏度可以高达477 mA L mo1-1 cm-2。
4、 按权利要求2或3所述的氮掺杂介孔碳固定化酶生物传感材料，其特征 在于由该材料制得的传感无需电子媒介体，生物大分子在电极表面可以实现直 接的电子传递，属于第三代生物传感器。该生物传感器的电子传递速率常数可 高达4 9 s-1。
5、 氮掺杂介孔碳固定化酶生物传感材料的制备方法，其特征在于制备过程 由两部分组成，首先以乙二胺、丙烯腈或者三聚氰胺为碳氮源，采用模板碳化 法制备氮掺杂介孔碳，然后用硝酸对其表面进行亲水性处理得到。
6、 按权利要求5所述的氮掺杂介孔碳固定化酶生物传感材料的制备方法， 其特征在于该方法由以下步骤组成(1)制备碳氮前驱物溶液，碳氮前驱物溶液由碳氮前驱物、溶剂以及酸添 加剂在室温混合搅拌1 5小时得到，其中碳氮前驱物包括乙二胺、丙烯腈、三 聚氰胺或六亚甲基四胺，溶剂包括四氯化碳、甲醛、乙二醛或二甲基亚砜所用 酸添加剂包括对甲苯磺酸、衣糠酸等，碳氮前驱物溶液中碳氮前驱物的质量百 分数为5 60%，添加剂的质量百分数为0. 1 5%。(2) 将千燥的介孔氧化硅分子筛模板(如MCF、 MSU、 FDU-12等)浸 入到碳氮前驱物溶液中，在70 100。C搅拌1 12小时，然后在100 150。C 处理6 36小时，其中模板与碳前驱物溶液的质量比为0.05 0.5: 1。(3) 将步骤(2)得到的产物在惰性气氛下碳化，碳化温度为500 900°C， 恒温时间为2 12小时。(4) 将碳化后得到的复合物加入到质量比为2 20%的氢氟酸或2 30%的强碱(氢氧化钠、氢氧化钾等)溶液中，室温或加热搅拌6 24小时，然后 过滤分离并洗涤，在60 120。C下干燥后得到去除模板后的氮掺杂介孔碳材料。(5) 将歩骤(4)中得到的产物，用10% 35%的硝酸在50 80 。C处理 1 15小时，以对其表面进行修饰。(6) 酶分子的同定化，将步骤(5)得到的产物与酶分子以0. 1 1的质量 比在室温下搅拌混合2 24小时,离心并洗涤，得到氮掺杂介孔碳固定化酶生物 传感材料。其中所用酶分子包括血红蛋白、肌红蛋白、葡萄糖氧化酶、木瓜蛋 白酶或辣根过氧化物酶。
7、 按权利要求6所述的氮掺杂介孔碳固定化酶生物传感材料的制备方法， 其特征在于模板采用大孔径的介孔氧化硅如MCF、 MSU、 FDU-12等为模板， 由此得到的氮掺杂介孔碳既具有高的比表面积，又具有大的孔径。
8、 按权利要求6所述的氮掺杂介孔碳固定化酶生物传感材料的制备方法， 其特征在于采用硝酸氧化处理，来改善其表面的亲水性，从而使其更好地与生 物分子结合。修饰后的氮掺杂介孔碳所负载血红蛋白的活性是修饰前的3倍多。
9、 按权利要求6所述的氮掺杂介孔碳固定化酶生物传感材料的制备方法， 其特征在于采用新型的氮掺杂介孔碳为载体来固定生物酶分子。
全文摘要
本发明涉及一种氮掺杂介孔碳固定化酶生物传感材料及其制备方法，属于生物催化和生物传感领域。以介孔氧化硅为模板，乙二胺、丙烯腈或三聚氰胺为碳氮源，制备得到介孔碳，再用硝酸对其表面进行修饰，得到亲水性修饰的氮掺杂介孔碳。该材料具有高的比表面积、大的孔容、大的孔径以及很好的生物相容性，同时还有很好的水、热稳定性和导电性。以此为载体固定化的酶分子，其活性能够得到很好的保持。基于氮掺杂介孔碳固定化酶的生物传感具有快的响应时间，宽的线性范围，高的灵敏度和低的检测限。另外，该固定化酶生物传感材料的制备工艺简单可控，条件温和，原料易得，设备常规。
文档编号G01N27/327GK101435792SQ20081020478
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月17日 优先权日2008年12月17日
发明者师琳璞, 高秋明 申请人:中国科学院上海硅酸盐研究所