专利名称：一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡及其制备方法
技术领域：
本发明涉及饲料及食品中的三聚氰胺含量的快速检测技术领域，具体为一 种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡及其制备方法。
(二)
背景技术：
三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原 料，简称三胺，又叫蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。三聚氰胺是一种用途 广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂
(MF)的原料。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，常被人为添加进动物饲 料及植物蛋白中以提高产品中蛋白质含量，而长期或反复大量食用含有三聚氰 胺的饲料或食物，会造成动物或人类生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石， 并可进一步诱发膀胱癌。因此，有必要对饲料及食品中的三聚氰胺的含量进行 检测，目前采用较多的有高效液相色谱法，该方法具有很好的灵敏度和特异性， 但操作繁琐、耗时长，不用适于对大批量样品的检测，且需要昂贵的仪器设备， 检测成本高；也可以采用酶联免疫吸附法检测，此方法虽然操作相对简单，不 需要昂贵的仪器设备，检测成本低，但是在检测过程中需要重复多次洗涤，而 且要借助于酶标仪读数进行测定，不能实现真正的一步法快速检测。
(三)
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡，能 够满足现场快速检测的需要，检测快速，携带方便，操作简单，无需特殊设备 和仪器，为此本发明者还提供了快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡的制备方法， 其制备工艺简单，成本低。
一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡，其包括试纸条，所述试纸条封装 于检测卡壳体中，所述检测卡壳体上开有加样孔和观测孔，所述试纸条包括底 板，其特征在于所述试纸条的底板上依次粘贴有吸水纸、硝酸纤维素膜、金 标垫、样品垫，所述吸水纸和所述金标垫分别粘贴在所述硝酸纤维素膜两端，在所述硝酸纤维素膜的两端结合处，所述吸水纸和金标垫的一小段重叠压在所 述硝酸纤维素膜上，所述样品垫粘贴在所述金标垫的另一端，所述样品垫的一
小段重叠在所述金标垫上；所述金标垫上喷涂有金标抗三聚氰胺单克隆抗体； 所述硝酸纤维素膜上依次喷涂有材质为三聚氰胺-卵清蛋白偶联结合物的检测 线、材质为羊抗鼠IgG的质控线。
其进一步特征在于所述样品垫位置正对所述加样孔，所述硝酸纤维素膜 位置正对所述观测孔。
一种快速检测三聚氰胺的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于其包括 以下步骤
U)用碳二亚胺法偶联三聚氰胺半抗原与卵清蛋白，形成偶联物三聚氰胺-卵 清蛋白作为人工抗原；
(2) 用免疫原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细 胞，筛选能够稳定分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的细胞株，制备抗三聚氰胺单克 隆抗体；
(3) 制备胶体金溶液；
(4) 用制备好的胶体金溶液标记抗三聚氰胺单克隆抗体；
(5) 用制备好的包被抗原以及羊抗鼠IgG处理硝酸纤维素膜；
(6) 用制备好的金标抗三聚氰胺单克隆抗体处理金标垫；
(7) 组装金标试纸条。 其进一步特征在于
所述三聚氰胺-卵清蛋白的制备称取三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加 入10% 20%的琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物1小时 ~3小时，然后低温浓縮至干，得半抗原，取此半抗原，溶于N， N-二甲基甲酰 胺(DMF)溶液中，滴加l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，搅拌反 应20分钟后，将该反应液滴加至卵清蛋白(OVA)溶液中，立即加入N-羟基 硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，室温下搅拌过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)透析 24小时 72小时，冷冻干燥后于-2(TC -4(TC保存；上述反应成分的比例为三 聚氰胺琥珀醛酸氰基硼氢化钠-(10 1000)mg : (50-8000)^1 : (6-600)mg， 半抗原EDC: OVA: NHS = (10~2000)mg : (5~10000)mg : (10-2000)mg:(20~5000) mg;
所述三聚氰胺-牛血清白蛋白偶联抗原的制备称取三聚氰胺，溶于吡啶溶
液中，分别加入10%~20%的琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该 混合物2小时，然后低温浓縮至干，得半抗原，取此半抗原，溶于N， N-二甲 基甲酰胺(DMF)溶液中，滴加l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)， 搅拌反应20分钟后，将该反应液滴加至牛血清白蛋白(BSA,溶于超纯水中) 溶液中，立即加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，室温下搅拌过夜，磷 酸盐缓冲液(PBS)透析24小时 72小时，冷冻干燥后于-20'C -4(TC保存；上
述反应成分的比例为三聚氰胺琥珀醛酸氰基硼氢化钠=(10~1000)mg :
(50 8000) pl : (6 600)mg，半抗原EDC: BSA: NHS = (10~2000)mg : (5 謂00)mg : (10 2000)mg: (20 5000)mg;
所述抗三聚氰胺单克隆抗体及其溶液的制备取三聚氰胺-牛血清白蛋白 (Melamine-BSA)偶联物用生理盐水配成0.1pg/|nl~10 pg/W抗原溶液，与等体 积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全 福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为 10^ig/只 10(^g/只小鼠，以后每隔2周~4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静 脉注射，免疫剂量10^ig/只 100iig/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾 融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1 比例混合，离心，去除上清，在50S 90S内将0.1ml 10ml50X聚乙二醇(分 子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，l分钟 3分钟后加入10m1 50 ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止10分钟~30分钟后离心，去除上清； 将融合细胞用含5%~30%小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为 lxl04 lx106饲养细胞/0.1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养 板中，于5%~10%CO2， 35'C 45'C条件下培养，5天~10天后，每培养孔更换 2/3HT培养液，10天 20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上 清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤 筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以三聚氰胺-卵清蛋白 (Melamine-OVA)为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓 瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)>2.1;对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将 阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数， 稀释为70个/ml，再取l ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆， 直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对10 13周龄Balb/c小鼠腹腔注射 液体石蜡0.3ml/只 0.5ml/只，8天 10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤 细胞，5x105细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于 -20。C -4(rC保存；上述成分的比例为Melamine-BSA :生理盐水=(10-1000) |ig : (0.1~10)ml。
所述胶体金溶液的制备用新制双蒸水配制0.01% 0.1%氯金酸溶液，置于
锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至10(TC 120。C，在100r/min~200r/min磁力 搅拌下，迅速加入预先在35。C 45。C保温的1%~3%柠檬酸三钠溶液，保持温度 和转速不变，继续搅拌加热15分钟 30分钟左右，直至溶液呈现清亮的酒红色； 室温冷却，2匸 8。C冰箱保存备用；上述成分的比例为氯金酸柠檬酸三钠= (l(MOOO)ml : (l~20)ml。
所述胶体金标记抗三聚氰胺单克隆抗体的制备取胶体金溶液于离心管中， 用0.1 M -l.OM K2C03或0.1 M -l.OM HC1调节pH至7~8左右，用铝箔纸包住 离心管，轻轻振荡；边振荡边逐滴加入抗体蛋白溶液，继续振荡10分钟 30分 钟左右；逐滴加入1%BSA溶液以饱和游离的胶体金，然后于2'C 8'C， 6000 rpm 12000rpm，离心30分钟~60分钟；离心后取出离心管，将上清液轻轻吸掉一 部分后，用移液枪将管底沉淀小心吸至离心管中，2'C 8'C保存备用；上述成分 的比例为胶体金溶液抗体蛋白BSA = (10-1000)ml : (50~5000) pg :(1 100) ml。
所述硝酸纤维素膜的处理用金标点样仪喷涂两条平行线于硝酸纤维素膜 上，三聚氰胺偶联卵清蛋白结合物三聚氰胺-卵清蛋白作为检测线，羊抗鼠IgG 作为质控线，置35"C 45'C真空干燥后备用；
所述金标垫的处理将一定量金标抗三聚氰胺单克隆抗体均匀喷涂于金标
垫上，置35'C 45"C真空干燥后备用；
所述金标试纸条的组装取制作试纸条专用的底板，先将干燥好的硝酸纤
维素膜粘贴在相应位置，再将吸水纸和干燥好的金标垫粘贴在相应位置并稍微压住硝酸纤维素膜，最后将样品垫粘好并压住金标垫，用切条机切割成3mm宽 的试纸条装入检测卡中，此时，样品垫的位置正对检测卡的加样孔、硝酸纤维 素膜位置正对检测卡的观测孔，与干燥剂一起装入铝箔袋中，密封包装。
本发明的快速检测三聚氰胺的胶体金试纸条，其检测快速，检测时间仅需 5min，能够满足现场快速检测的需要，且检测准确率高、特异性强，其改变了 对三聚氰胺的检测必须由专业机构的专业人员才能进行检测的局限性，携带方 便，操作简便，各个奶牛养殖场、牛奶收购站、各级检验检疫部门及消费者均 可即时进行检验；检测试纸条的制备工艺简单，成本低，且在常温下即可保存， 无需特殊设备和仪器，检测重复性好。
(四)
图1为本发明快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡示意图2为本发明快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡中所述试纸条的结构示意
图3为图2的左视图。
(五)
具体实施例方式
见图l、图2， 一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡，其包括检测卡壳体 1和试纸条2，试纸条2封装于检测卡壳体1中，检测卡壳体1上开有加样孔3 和观测孔4，试纸条2包括底板5，试纸条2的底板5上依次粘贴有吸水纸6、 硝酸纤维素膜7、金标垫8、样品垫9，吸水纸6和金标垫8分别粘贴在硝酸纤 维素膜7两侧，在硝酸纤维素膜7的两端结合处，吸水纸6和金标垫8的一小 段重叠压在硝酸纤维素膜7上，样品垫9粘贴在金标垫8的另一侧，样品垫9 的一小段重叠在金标垫8上；金标垫8上喷涂有金标抗三聚氰胺单克隆抗体； 硝酸纤维素膜7上依次喷涂有材质为三聚氰胺偶联卵清蛋白结合物的检测线10、 材质为羊抗鼠IgG的质控线ll。
一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡的制备方法，其包括以下步骤-
(1) 用碳二亚胺法偶联三聚氰胺半抗原与卵清蛋白，形成偶联物三聚氰胺-卵 清蛋白作为人工抗原；
(2) 用免疫原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细 胞，筛选能够稳定分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的细胞株，制备抗三聚氰胺单克隆抗体；
(3) 制备胶体金溶液；
(4) 用制备好的胶体金溶液标记抗三聚氰胺单克隆抗体；
(5) 用制备好的包被抗原以及羊抗鼠IgG处理硝酸纤维素膜；
(6) 用制备好的金标抗三聚氰胺单克隆抗体处理金标垫；
(7) 组装金标试纸条。
下面结合实施例描述检测卡的制备方法 实施例1
三聚氰胺-卵清蛋白的制备称取三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入10% 的琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物1小时，然后低温
浓縮至干，得半抗原，取此半抗原，溶于N， N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中， 滴加l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，搅拌反应20分钟后，将该 反应液滴加至卵清蛋白(OVA)溶液中，立即加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺 (Sulfo-NHS)，室温下搅拌过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)透析72小时，冷冻干 燥后于-40。C保存；上述反应成分的比例为三聚氰胺琥珀醛酸氰基硼氢化 钠-1000mg : 4000 pl : 6mg，半抗原EDC: OVA: NHS=2000mg : 5000mg : 10mg: 2500mg。
三聚氰胺-牛血清白蛋白偶联抗原的制备称取三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，
分别加入15%的琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物2h， 然后低温浓縮至干，得半抗原，取此半抗原，溶于N， N-二甲基甲酰胺(DMF) 溶液中，滴加l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，搅拌反应20分钟 后，将该反应液滴加至牛血清白蛋白(BSA，溶于超纯水中)溶液中，立即加 入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，室温下搅拌过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)
透析48小时，冷冻干燥后于-40。C保存；上述反应成分的比例为三聚氰胺琥
珀醛酸氰基硼氢化钠=1000mg : 8000 pi : 600mg，半抗原EDC: BSA: NHS=1000mg : 5mg : 10mg: 2500mg。
抗三聚氰胺单克隆抗体及其溶液的制备取三聚氰胺-牛血清白蛋白 (Melamine-BSA)偶联物用生理盐水配成5.05pg^1抗原溶液，与等体积完全福 氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为55 pg/只小 鼠，以后每隔4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量lOOpg/ 只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与 处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在50 S内将5.05ml50X聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合， 3分钟后加入10ml DMEM培养液，终止融合，水浴静止20分钟后离心，去除 上清；将融合细胞用含30X小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度 为1 x 104饲养细胞/O. lml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中， 于10%(^02， 4(TC条件下培养，5天后，每培养孔更换2/3HT培养液，20天后， 开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳 性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争 ELISA法进行，以三聚氰胺-卵清蛋白(Melamine-OVA)为包被抗原，以免疫 小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性 细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)〉2.1;对分泌阳性抗 体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养 瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取lml稀释20 倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为 止；对10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.4ml/只，8天后，腹腔注射培养 至对数期的杂交瘤细胞，5><105细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除 沉淀，加甘油于-40"C保存；上述成分的比例为Melamine-BSA :生理盐水=1000 jxg : 5.05ml。
胶体金溶液的制备用新制双蒸水配制0.1%氯金酸溶液，置于锥形瓶中，
用恒温电磁搅拌器加热至沸120°C，在150r/min磁力搅拌下，迅速加入预先在 35。C保温的3%柠檬酸三钠溶液，保持温度和转速不变，继续搅拌加热22.5分钟， 直至溶液呈现清亮的酒红色；室温冷却，8'C冰箱保存备用；上述成分的比例为 氯金酸柠檬酸三钠=1000 ml : 10.5ml。
胶体金标记抗三聚氰胺单克隆抗体的制备取胶体金溶液于离心管中，用 0.1MK2CO3或1.0MHCl调节pH至7，用铝箔纸包住离心管，轻轻振荡；边振 荡边逐滴加入抗体蛋白溶液，继续振荡20分钟左右；逐滴加入P/。BSA溶液以饱和游离的胶体金，然后于5卩，12000rpm，离心45分钟；离心后取出离心管， 将上清液轻轻吸掉一部分后，用移液枪将管底沉淀小心吸至离心管中，8'C保存 备用；上述成分的比例为胶体金溶液抗体蛋白BSA= 1000ml : 2500吗 50.5 ml;
所述硝酸纤维素膜的处理用金标点样仪喷涂两条平行线于硝酸纤维素膜 上，三聚氰胺偶联卵清蛋白结合物三聚氰胺-卵清蛋白作为检测线，羊抗鼠IgG
作为质控线，置45T:真空干燥后备用；
所述金标垫的处理将一定量金标抗三聚氰胺单克隆抗体均匀喷涂于金标 垫上，置35'C真空干燥后备用。
实施例2
所述三聚氰胺-卵清蛋白的制备称取三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加
入20%的琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物3h，然后低 温浓縮至干，得半抗原，取此半抗原，溶于N， N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液 中，滴加l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，搅拌反应20分钟后， 将该反应液滴加至卵清蛋白(OVA)溶液中，立即加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺 (Sulfo-NHS)，室温下搅拌过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)透析48小时，冷冻干
燥后于-30'C保存；上述反应成分的比例为三聚氰胺琥珀醛酸氰基硼氢化
钠=10mg : 8000 pl : 300mg,半抗原EDC: OVA: NHS = 10mg : lOOOOmg : 1000mg: 5000mg。
所述三聚氰胺-牛血清白蛋白偶联抗原的制备称取三聚氰胺，溶于吡啶溶 液中，分别加入10%的琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合
物2h，然后低温浓縮至干，得半抗原，取此半抗原，溶于N， N-二甲基甲酰胺 (DMF)溶液中，滴加l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，搅拌反应 20分钟后，将该反应液滴加至牛血清白蛋白(BSA，溶于超纯水中)溶液中， 立即加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，室温下搅拌过夜，磷酸盐缓冲 液(PBS)透析24小时，冷冻干燥后于-20。C保存；上述反应成分的比例为三 聚氰胺琥珀醛酸氰基硼氢化钠=10mg : 4000 pl : 6mg，半抗原EDC: BSA: NHS=2000mg : 10000mg :謂Omg: 5000mg。
所述抗三聚氰胺单克隆抗体及其溶液的制备取三聚氰胺-牛血清白蛋白(Mdamine-BSA)偶联物用生理盐水配成0.1pg/|LU抗原溶液，与等体积完全福 氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂 代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为10)ig/只小 鼠，以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10pg/ 只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与 处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在90 S内将0.1ml50X聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合， 1分钟后加入50mlDMEM培养液，终止融合，水浴静止10分钟后离心，去除 上清；将融合细胞用含5X小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度 为"106饲养细胞/0.1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中， 于5XC02， 35"C条件下培养，7天后，每培养孔更换2/3 HT培养液，IO天后， 开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳 性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争 ELISA法进行，以三聚氰胺-卵清蛋白(Mdamine-OVA)为包被抗原，以免疫 小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性 细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)〉2.1;对分泌阳性抗 体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养 瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取lml稀释20 倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为 止；对13周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3 ml/只，10天后，腹腔注射培 养至对数期的杂交瘤细胞，5xl()S细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去 除沉淀，加甘油于-20'C保存；上述成分的比例为Melamine-BSA :生理盐水= 10 pg : 5,05ml。
所述胶体金溶液的制备用新制双蒸水配制0.01%氯金酸溶液，置于锥形瓶
中，用恒温电磁搅拌器加热至沸IOO'C，在100r/min磁力搅拌下，迅速加入预先 在45。C保温的1%柠檬酸三钠溶液，保持温度和转速不变，继续搅拌加热15分 钟左右，直至溶液呈现清亮的酒红色；室温冷却，5'C冰箱保存备用；上述成分 的比例为氯金酸柠檬酸三钠=10ml : 20ml。
所述胶体金标记抗三聚氰胺单克隆抗体的制备取胶体金溶液于离心管中，用1.0MK2CO3或0.1MHCl调节pH至7.5左右，用铝箔纸包住离心管，轻轻振 荡；边振荡边逐滴加入抗体蛋白溶液，继续振荡10分钟左右；逐滴加入1%BSA 溶液以饱和游离的胶体金，然后于8"C， 6000rpm,离心60分钟；离心后取出离 心管，将上清液轻轻吸掉一部分后，用移液枪将管底沉淀小心吸至离心管中，5°C 保存备用；上述成分的比例为胶体金溶液抗体蛋白BSA-10ml : 5000 pg :
100 ml。
所述硝酸纤维素膜的处理用金标点样仪喷涂两条平行线于硝酸纤维素膜 上，三聚氰胺偶联卵清蛋白结合物三聚氰胺-卵清蛋白作为检测线，羊抗鼠IgG 作为质控线，置4(TC真空干燥后备用；
所述金标垫的处理将一定量金标抗三聚氰胺单克隆抗体均匀喷涂于金标 垫上，置45'C真空干燥后备用。
实施例3
三聚氰胺-卵清蛋白的制备称取三聚氰胺，溶于吡啶溶液中，分别加入15%
的琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物2h，然后低温浓縮 至干，得半抗原，取此半抗原，溶于N， N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，滴 加l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，搅拌反应20分钟后，将该反 应液滴加至卵清蛋白(OVA)溶液中，立即加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺 (Sulfo-NHS)，室温下搅拌过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)透析24小时，冷冻干 燥后于-20。C保存；上述反应成分的比例为三聚氰胺琥珀醛酸氰基硼氢化 钠-505mg : 50pl : 600mg，半抗原EDC: OVA: NHS =1005mg : 5mg : 2000mg: 20mg。
三聚氰胺-牛血清白蛋白偶联抗原的制备称取三聚氰胺，溶于吡啶溶液中， 分别加入20%的琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物2h， 然后低温浓縮至干，得半抗原，取此半抗原，溶于N， N-二甲基甲酰胺(DMF) 溶液中，滴加l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，搅拌反应20分钟 后，将该反应液滴加至牛血清白蛋白(BSA，溶于超纯水中)溶液中，立即加 入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，室温下搅拌过夜，磷酸盐缓冲液(PBS) 透析72小时，冷冻干燥后于-30。C保存；上述反应成分的比例为三聚氰胺琥 珀醛酸氰基硼氢化钠-505mg : 50^x1 : 303mg，半抗原EDC: BSA: NHS=10mg : 5000mg : 2000mg: 20mg。
抗三聚氰胺单克隆抗体及其溶液的制备取三聚氰胺-牛血清白蛋白 (Melamine-BSA)偶联物用生理盐水配成10 pg/W抗原溶液，与等体积完全福 氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂 代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为100pg/只 小鼠，以后每隔3周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量55pg/ 只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与 处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比例混合，离心，去除上清，在70 S内将10ml50X聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合， 2分钟后加入30mlDMEM培养液，终止融合，水浴静止30分钟后离心，去除 上清；将融合细胞用含17.5X小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓 度为lxl05饲养细胞/0.1 ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板 中，于7.5%(302， 45"C条件下培养，IO天后，每培养孔更换2/3HT培养液， 15天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测 结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接 非竞争ELISA法进行，以三聚氰胺-卵清蛋白(Melamine-OVA)为包被抗原， 以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照； 阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)〉2.1;对分泌阳 性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至 培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/ml，再取l ml稀 释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈 阳性为止；对ll周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，9天后，腹腔注 射培养至对数期的杂交瘤细胞，5xl()S细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离 心去除沉淀，加甘油于-30。C保存；上述成分的比例为Melamine-BSA :生理 盐水=505吗:10ml。
胶体金溶液的制备用新制双蒸水配制0.055%氯金酸溶液，置于锥形瓶中， 用恒温电磁搅拌器加热至ll(TC，在200r/min磁力搅拌下，迅速加入预先在40°C 保温的2%拧檬酸三钠溶液，保持温度和转速不变，继续搅拌加热30分钟左右， 直至溶液呈现清亮的酒红色；室温冷却，2"C冰箱保存备用；上述成分的比例为氯金酸拧檬酸三钠=505 ml : lml。
胶体金标记抗三聚氰胺单克隆抗体的制备取胶体金溶液于离心管中，用
0.55MK2CO3或0.55MHCl调节pH至8，用铝箔纸包住离心管，轻轻振荡；边 振荡边逐滴加入抗体蛋白溶液，继续振荡30分钟左右；逐滴加入1%BSA溶液 以饱和游离的胶体金，然后于2。C, 9000rpm，离心30分钟；离心后取出离心管， 将上清液轻轻吸掉一部分后，用移液枪将管底沉淀小心吸至离心管中，2'C保存 备用；上述成分的比例为胶体金溶液抗体蛋白BSA = 505ml : 50 pg : lml。
硝酸纤维素膜的处理用金标点样仪喷涂两条平行线于硝酸纤维素膜上， 三聚氰胺偶联卵清蛋白结合物三聚氰胺-卵清蛋白作为检测线，羊抗鼠IgG作为 质控线，置35'C真空干燥后备用；
金标垫的处理将一定量金标抗三聚氰胺单克隆抗体均匀喷涂于金标垫上， 置4(TC真空干燥后备用；
所述金标试纸条2的组装取制作试纸条专用的底板，先将干燥好的硝酸
纤维素膜7粘贴在相应位置，再将吸水纸6和干燥好的金标垫8粘贴在相应位 置并稍微压住硝酸纤维素膜7，最后将样品垫粘好并压住金标垫8，用切条机切 割成3mm宽的试纸条装入检测卡中，此时，样品垫9的位置正对检测卡的加样 孔3、硝酸纤维素膜7位置正对检测卡的观测孔4，与干燥剂一起装入铝箔袋中， 密封包装。
对样品进行检测时，将检测卡平放，取100pL样夜滴入加样孔3，在30分 钟内观察结果；羊抗鼠IgG和三聚氰胺-卵清蛋白偶联物分别喷涂在硝酸纤维素 膜的质控线ll (C)和检测线IO (T)，含三聚氰胺的待侧样品经样品垫9根据 层析原理向另一端移动，并先后经过质控线11和检测线10，固化在金标垫8上 的金标记抗三聚氰胺特异性单克隆抗体与样品中的三聚氰胺起特异性反应，并 竞争抑制其与检测线上的三聚氰胺结合，因此，当样品中的三聚氰胺含量低于 某一量时，金标记抗三聚氰胺特异性单克隆抗体与检测线IO上的三聚氰胺结合 后金颗粒凝集显色，当样品中的三聚氰胺含量超过一定量时，金标记抗体完全 被抑制而不显色，其中，质控线ll (C)是为判断检验方法本身有效与否而设定 的，显色有效，不显色说明方法本身无效。
权利要求
1、一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡，其包括试纸条，所述试纸条封装于检测卡壳体中，所述检测卡壳体上开有加样孔和观测孔，所述试纸条包括底板，其特征在于所述试纸条的底板上依次设置有吸水纸、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫，所述吸水纸和所述金标垫分别设置在所述硝酸纤维素膜两端，在所述硝酸纤维素膜的两端结合处，所述吸水纸和金标垫的一小段重叠压在所述硝酸纤维素膜上，所述样品垫设置在所述金标垫的另一端，所述样品垫的一小段重叠在所述金标垫上；所述金标垫上喷涂有金标抗三聚氰胺单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上依次喷涂有材质为三聚氰胺-卵清蛋白偶联结合物的检测线、材质为羊抗鼠IgG的质控线。
2、 根据权利要求l所述一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡，其特征在 于所述样品垫位置正对所述加样孔；所述硝酸纤维素膜位置正对所述观测孔。
3、 一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡的制备方法，其特征在于其包 括以下步骤(1) 用碳二亚胺法偶联三聚氰胺半抗原与卵清蛋白，形成偶联物三聚氰胺-卵 清蛋白作为人工抗原；(2) 用免疫原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细 胞，筛选能够稳定分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的细胞株，制备抗三聚氰胺单克 隆抗体；(3) 制备胶体金溶液；(4) 用制备好的胶体金溶液标记抗三聚氰胺单克隆抗体；(5) 用制备好的包被抗原以及羊抗鼠IgG处理硝酸纤维素膜；(6) 用制备好的金标抗三聚氰胺单克隆抗体处理金标垫；(7) 组装金标试纸条。
4、 根据权利要求3所述一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡的制备方法， 其特征在于所述三聚氰胺-卵清蛋白的制备，称取三聚氰胺，溶于吡啶溶液中， 分别加入10%~20%的琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅拌反应该混合物 l小时 3小时，然后低温浓縮至千，得半抗原，取此半抗原，溶于N， N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，滴加l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)， 搅拌反应20分钟后，将该反应液滴加至卵清蛋白(OVA)溶液中，立即加入 N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，室温下搅拌过夜，磷酸盐缓冲液(PBS) 透析24小时 72小时，冷冻干燥后于-2(TC -40'C保存；上述反应成分的比例为 三聚氰胺琥珀醛酸氰基硼氢化钠^(10 1000)mg : (50 8000)^il : (6 600)mg， 半抗原EDC: OVA: NHS = (10~2000)mg : (5 10000)mg : (10 2000)mg: (20-5000) mg。
5、 根据权利要求3所述一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡的制备方法， 其特征在于所述三聚氰胺-牛血清白蛋白偶联抗原的制备，称取三聚氰胺，溶 于吡啶溶液中，分别加入10%~20%的琥珀醛酸溶液和氰基硼氢化钠，室温下搅 拌反应该混合物2小时，然后低温浓縮至干，得半抗原，取此半抗原，溶于N， N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，滴加l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，搅拌反应20分钟后，将该反应液滴加至牛血清白蛋白(BSA,溶于 超纯水中)溶液中，立即加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，室温下搅 拌过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)透析24小时 72小时，冷冻干燥后于-2(TC -4(TC保存；上述反应成分的比例为三聚氰胺琥珀醛酸氰基硼氢化钠= (10 1000)mg : (50~8000) )il : (6 600)mg，半抗原EDC: BSA: NHS = (10~2000)mg : (5~10000)mg : (10~2000)mg: (20~5000) mg。
6、 根据权利要求3所述一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡的制备方法， 其特征在于所述抗三聚氰胺单克隆抗体及其溶液的制备，取三聚氰胺-牛血清白蛋白(Melamine-BSA)偶联物用生理盐水配成0.1^tg/|Lil~10 pg/W抗原溶液， 与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的 不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫 剂量为10lig/只 100 iig/只小鼠，以后每隔2 4周加强免疫一次，加强免疫采用 尾静脉注射，免疫剂量1(Vg/只 100 )Lig/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天 后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o 以10:1比例混合，离心，去除上清，在50S 90S内将0.1ml 10ml50X聚乙 二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，1分钟~3分钟后加入 10ml 50mlDMEM培养液，终止融合，水浴静止10分钟 30分钟后离心，去除上清；将融合细胞用含5M 30X小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最 后浓度为lxl0Mxl(^饲养细胞/0.1ml接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96 孔培养板中，于5%~10%(:02， 35'C 45。C条件下培养，5天 10天后，每培养孔 更换2/3HT培养液，10天 20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔， 取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂 交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法进行，以三聚氰胺-卵清蛋白 (Melamine-OVA)为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP-2/o骨髓 瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白) /(A对照-A空白)>2.1;对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将 阳性克隆细胞吹匀，取一微滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数， 稀释为70个/ml，再取l ml稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆， 直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对10 13周龄Balb/c小鼠腹腔注射 液体石蜡0.3 ml/只 0.5 ml/只，8天 10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交 瘤细胞，5><105细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于 -2(rC -4(TC保存；上述成分的比例为Melamine-BSA :生理盐水-(10~1000) pg : (0.1~10)ml。
7、 根据权利要求3所述一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡的制备方法， 其特征在于所述胶体金溶液的制备，用新制双蒸水配制0.01%~0.1%氯金酸溶 液，置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至100。C 12(TC，在100r/min~200r/min 磁力搅拌下，迅速加入预先在35X: 45。C保温的1%~3%柠檬酸三钠溶液，保持 温度和转速不变，继续搅拌加热15分钟 30分钟左右，直至溶液呈现清亮的酒 红色；室温冷却，2'C 8'C冰箱保存备用；上述成分的比例为氯金酸柠檬 酸三钠=(10~1000)ml : (l~20)ml。
8、 根据权利要求3所述一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡的制备方法， 其特征在于所述胶体金标记抗三聚氰胺单克隆抗体的制备，取胶体金溶液于 离心管中，用0.1M 1.0MK2CO3或0.1M 1.0MHCl调节pH至7 8左右，用 铝箔纸包住离心管，轻轻振荡；边振荡边逐滴加入抗体蛋白溶液，继续振荡10 分钟 30分钟；逐滴加入1。/。BSA溶液以饱和游离的胶体金，然后于2。C 8'C， 6000 rpm 12000rpm，离心30分钟 60分钟；离心后取出离心管，将上清液轻轻吸掉一部分后，用移液枪将管底沉淀小心吸至离心管中，2-C 8'C保存备用； 上述成分的比例为胶体金溶液抗体蛋白BSA = (10 1000)ml : (50~5000) Hg (1 歸)ml。
9、 根据权利要求3所述一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡的制备方法， 其特征在于所述硝酸纤维素膜的处理，用金标点样仪喷涂两条平行线于硝酸纤维素膜上，三聚氰胺偶联卵清蛋白结合物三聚氰胺-卵清蛋白作为检测线，羊抗鼠IgG作为质控线，置35'C 45'C真空干燥后备用；所述金标垫的处理将一 定量金标抗三聚氰胺单克隆抗体均匀喷涂于金标垫上，置35'C 45。C真空干燥后
10、 根据权利要求3或9所述一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡的制 备方法，其特征在于所述金标试纸条的组装，取制作试纸条专用的底板，先 将干燥好的硝酸纤维素膜粘贴在相应位置，再将吸水纸和干燥好的金标垫粘贴 在相应位置并稍徴压住硝酸纤维素膜，最后将样品垫粘好并压住金标垫，用切 条机切割成3mm宽的试纸条装入检测卡中，此时，样品垫的位置正对检测卡的 加样孔、硝酸纤维素膜位置正对检测卡的观测孔，与干燥剂一起装入铝箔袋中， 密封包装。
全文摘要
本发明提供了一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡，其检测快速，携带方便，操作简单，为此本发明还提供了检测卡的制备方法，其制备工艺简单，成本低。其包括试纸条，所述试纸条封装于检测卡壳体中，所述检测卡壳体上开有加样孔和观测孔，所述试纸条包括底板，其特征在于所述试纸条的底板上依次设置有吸水纸、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫，所述吸水纸和所述金标垫分别设置在所述硝酸纤维素膜两端，在所述硝酸纤维素膜的两端结合处，所述吸水纸和金标垫的一小段重叠压在所述硝酸纤维素膜上，所述样品垫设置在所述金标垫的另一端，所述样品垫的一小段重叠在所述金标垫上；所述金标垫上喷涂有金标抗三聚氰胺单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上依次喷涂有材质为三聚氰胺-卵清蛋白偶联结合物的检测线、材质为羊抗鼠IgG的质控线。
文档编号G01N33/543GK101413956SQ20081023637
公开日2009年4月22日 申请日期2008年11月8日 优先权日2008年11月8日
发明者进 叶, 杰 吴, 张凌裳, 杨婷婷, 沈雯琰, 王文静, 秦海萍, 蔡建荣, 赵春城, 赵晓联, 燕 龚 申请人:江苏省苏微微生物研究有限公司