专利名称：：评估细胞和细胞培养物的方法
技术领域：
：本发明涉及测定细胞培养物组成的方法，更具体地，涉及区分软骨细胞与成纤维细胞的方法。
背景技术：
：关节软骨损伤具有较差的修复速率，这部分由于软骨组织中缺乏血液供给(Basad等，于Hendrich等,CartilageSurgeryandFuturePerspectives,ThiemeVerlag，49-56(2003))。膝关节创伤能导致例如软骨和骨软骨损伤，而且此类损伤可发展成骨关节炎(Brittberg等，NewEnglandJournalofMedicine,331(14):889-895(1994))。在骨关节炎的严重病例中，可能需要全膝置换。然而，膝置换中所使用的人工假肢具有有限的寿命，如此膝置换不是最佳的治疗法，特别是对于非老年患者(Brittberg等，见上文)。在一些情况中，关节软骨损伤可以通过自体软骨细胞植入来修复(Brittberg等，Clin.Orthopaed.Rel.Res"367S:S147-S155(1999))。在这种规程中，从患者收获软骨细胞，在细胞培养中扩充以增加软骨细胞的数目，然后回植入该患者的损伤部位中。用一片骨膜组织覆盖软骨细胞以将软骨细胞密封入损伤部位中。虽然所培养的软骨细胞在培养中具有去分化的趋势，但是在成功的植入物中，去分化的软骨细胞保持其再分化潜力，而且会在植入后再分化成产生透明软骨组织的软骨细胞。在一种称为基质诱导的自体软骨细胞植入的改良技术(MACI⑧植入规程)中，将培养的软骨细胞加载至胶原基质上，然后将它们植入患者中(Basad等，见上文)。另外，胶原基质可以用血纤蛋白胶而非通过缝合来固定，使其成为更简单的手术技术。可使用不同的技术和培养基来培养软骨细胞。供软骨细胞培养用的无血清培养基的例子及用于分离和增殖软骨细胞的方法记载于例如美国专利号6，150,163和7,169,610,及美国临时专利申请号60/805,307，本文通过提及而将它们收录。成纤维细胞或成纤维细胞样细胞(诸如滑膜细胞)可以与软骨细胞共分离，如此在制备软骨细胞植入物的过程中在细胞培养物中共增殖。已知软骨细胞在它们在培养中去分化时呈现成纤维细胞的外观(Benya和Shaffer,Cell,30:215-224(1982))。不过，它们维持其分化潜力，即它们能够在植入后再表达软骨细胞表型。因此，根据外观区分所培养的去分化软骨细胞与共培养的成纤维细胞或成纤维细胞样细胞会是困难的。胞的基因表达样式。例如，天然软骨软骨细胞中高度表达的许多标志物在所培养的软骨细胞中以降低的水平表达(Binette等，J.Orthopaed.Res.,16:207-216(1998))。因而，这样的软骨细胞标志物的表达可能未必能区分去分化的软骨细胞与可在细胞培养物中存在的其它类型的细胞。此外，许多已知的成纤维细胞标志物在去分化软骨细胞和天然软骨软骨细胞两者中均表达，尽管处于不同水平。因而，这样的成纤维细胞标志物的表达水平可能未必能指明样品中所存在的细胞是去分化软骨细胞、成纤维细胞、还是成纤维细胞样细胞。需要鉴定软骨细胞、成纤维细胞和成纤维细胞样细胞的方法，特别是适用于细胞培养的方法。发明概述在某些方面，本发明的方法提供了评估细胞培养物组成(例如用以区分软骨细胞与成纤维细胞)的方法和用于评估细胞个体的表型(例如评估为软骨细胞)的方法。本发明的方法可用于例如评估用于治疗软骨缺陷的软骨细胞培养物。在一些实施方案中，本发明牵涉根据成纤维细胞标志物的表达水平来鉴定细胞培养物组成或细胞身份。在其它实施方案中，本发明牵涉比较至少一种软骨细胞标志物和至少一种成纤维细胞标志物在细胞培养物样品中或在细胞个体中的表达水平。在例示性的实施方案中，所述软骨细胞标志物是乙酰透明质酸和蛋白聚冲唐连4妄蛋白1(hyaluronanandproteoglycanlink7protein1，HAPLN1),而所述成纤维细胞标志物是樣i原纤维相关蛋白5(microfibrillarassociatedprotein5,MFAP5)。本发明至少部分基于MFAP5作为细胞表型标志物的鉴定，其在某些非软骨细胞细胞类型(诸如成纤维细胞和滑膜细胞)中高度表达，而在软骨细胞中以显著更低的水平表达。本发明进一步至少部分基于如下发现，即MFAP5和软骨细胞标志物(诸如HAPLN1)的表达水平比率是自软骨活组织检查物衍生的培养物中细胞表型的可靠指示物。虽然在一些条件下可能优选使用这两种类型的标志物(即成纤维细胞和软骨细胞标志物)以便证实细胞培养物的组成或细胞个体的表型，但是本发明还提供了如下实施方案，其中仅测定MFAP5标志物的标准化表达水平便可足以实现该目的。在一些实施方案中，所述成纤维细胞标志物不同于MFAP5，而是这样的，即其标准化表达水平在软骨细胞中比在成纤维细胞中低。在一些实施方案中，所述成纤维细胞标志物是这样的，即其标准化表达水平在软骨细胞(例如原代和/或传代软骨细胞)中比在成纤维细胞和/或滑膜细胞中低。在一些实施方案中，所述成纤维细胞标志物在软骨细胞中比在成纤维细胞和/或滑膜细胞中表达得低至少2倍、5倍、8倍、10倍、或更小。如此，在一个方面，本发明提供了一种评估细胞培养物(例如试验性地含有软骨细胞的细胞培养物)组成的方法(方法l);和一种评估细胞个体表型的方法(方法2)。在方法l的实施方案中，各种标志物的表达水平以该标志物在多个细胞(例如培养物样品)中的平均表达水平测定。在方法l的实施方案中，细胞培养物的组成可以作为整体进行评估以确定其是否含有软骨细胞。在方法2的实施方案中，标志物的表达水平以该标志物在所评估的细胞个体中的表达水平测定。如此，方法l鉴定细胞培养物的组成，而方法2鉴定细胞个体的表型，例如该细胞是否是软骨细胞。在一些实施方案中，方法l包括a)从细胞培养物荻得多个细胞；b)测定本发明的成纤维细胞标志物在来自所述细胞培养物的多个细胞中的平均表达水平；并c)根据所述表达水平来确定所述培养物的组成；其中低于预定阈值的表达水平指明所述细胞培养物含有软骨细胞。或者，高于预定阈值的表达水平指明所述细胞培养物不含软骨细胞(例如所述培养物8不包含至少50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多的软骨细胞)。在一些实施方案中，方法l牵涉将成纤维细胞标志物(MFAP5或另一种成纤维细胞标志物)和软骨细胞标志物(例如HAPLN1)的表达水平与对照进行比较或者彼此进行比较。在一些实施方案中，所述成纤维细胞标志物和所述软骨细胞标志物是这样的，即它们在原代和/或传代软骨细胞中的表达水平比率(软骨细胞标志物比成纤维细胞标志物)等于或大于在培养的成纤维细胞中的表达比率的5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、75倍、100倍或更多倍。具体地，在一些实施方案中，方法l包括a)从细胞培养物获得多个细胞；b)测定软骨细胞标志物在所述多个细胞中的平均表达水平；c)测定成纤维细胞标志物在所述多个细胞中的平均表达水平；并水平来确定所述培养物的组成。在一些实施方案中，若软骨细胞标志物的表达水平高于预定的阈值，而成纤维细胞标志物的表达水平低于预定的阈值，则所述培养物鉴定为含有软骨细胞。或者，高于预定阈值的成纤维细胞标志物表达水平指明所述细胞培养物不含软骨细胞(例如所述培养物不包含至少50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多软骨细胞)。在一些实施方案中，测定培养物组成的步骤包括比较软骨细胞标志物的述标志物的表达水平相对于彼此进行比较(如此，所述阈值可以定义为例如两种标志物表达水平之间的给定差异，或其比率)。例如，在一些实施方案中，软骨细胞标志物(例如HAPLN1)表达水平与成纤维细胞标志物(例如MFAP5)表达水平的比率大于预定的阈值，例如0.25、0.55、1、2、2.2、5、10、25、50或更多，指明所述细胞培养物含有软骨细胞。在方法l的一些实施方案中，在RNA水平测定软骨细胞和成纤维细胞标志物的表达水平，例如通过定量RT-PCR的标准曲线法或通过定量RT-PCR的比较Gr法(其测量成纤维细胞标志物和软骨细胞标志物所要求的阈值循环数的差异)来实现。在一个相关的方面，本发明提供了一种评估细胞个体的表型的方法(方法2),例如使用流式细胞术或单细胞RT-PCR来实现。该方法对于鉴定来自细胞培养物(包括自软骨或滑膜衍生的细胞培养物、软骨细胞培养物、成纤维细胞培养物、滑膜细胞培养物、或任何其它合适的培养物)的细胞个体是有用的。该方法对于鉴定自想要鉴定其中的细胞个体的任何合适的生物学样品(包括软骨样品、滑膜样品、成纤维细胞样品等)衍生的细胞个体也是有用的。可以如针对方法1所描述的那样选择和评估方法2中的成纤维细胞和软骨细胞标志物。在一些实施方案中，方法2包括a)测定本发明的成纤维细胞标志物在细胞中的表达水平；并其中低于预定阚值的表达水平指明该细胞是软骨细胞。、或者，高于预定阈值的表达水平指明该细胞不是软骨细胞(例如成纤维细胞或滑膜细胞)。在一些实施方案中，方法2包才舌a)测定软骨细胞标志物在细胞中的表达水平；b)测定成纤维细胞标志物在细胞中的表达水平；并c)根据软骨细胞标志物的表达水平和成纤维细胞标志物的表达水平来评估该细胞的表型。在一些实施方案中，若软骨细胞标志物的表达水平高于预定的阈值水平，而成纤维细胞标志物的表达水平低于预定的阈值水平，则所述细胞鉴定为软骨细胞。或者，若软骨细胞标志物的表达水平低于预定的阄值水平，而成纤维细胞标志物的表达水平高于预定的阈值水平，则所述细胞不是软骨细胞。在一些实施方案中，评估细胞表型的步骤c)包括比较软骨细胞标志物的表达水平与成纤维细胞标志物的表达水平。本发明别的方面会在随后的描述中提出。附图简述图l是流程图，图示了用于从软骨细胞活组织检查物产生培养的软骨细胞的例示性制造工艺中的各阶段。图2描绘了数种细胞林中的HAPLN1表达水平，如通过RT-PCR标准曲线法所测定的。将表达水平关于18S核糖体RNA标准化。原代软骨细胞(PC)中的表达水平定标(scale)成l;其它比率相应地定标。所使用的细胞林列于表2中。图3描绘了与图2中所显示的细胞抹相同的细胞林中的MFAP5表达水平，如通过RT-PCR标准曲线法所测定的。将表达水平关于18S核糖体RNA标准化。原代软骨细胞(PC)中的表达水平定标成1;其它比率相应地定标。图4描绘了来自图2和图3的HAPLN1和MFAP5表达水平的比率。原代软骨细胞(PC)中的比率定标成l;其它比率相应地定标。图5描绘了与图2中所显示的抹相同的抹中的HAPLN1和MFAP5表达水平比率。通过RT-PCR比较CT法测定所述表达水平，并且该比率以2A(Cr，MFAP5_CT,HAPLN1)计算。图6描绘了多种别的软骨细胞和滑膜细胞株中的HAPLN1表达水平。通过RT-PCR标准曲线法来测定表达水平，并关于18S核糖体RNA标准化。原代软骨细胞(PC)中的表达水平定标成1;其它比率相应地定标。所使用的细胞抹列于表3中。图7描绘了与图6中所显示的林相同的抹中的MFAP5表达水平。通过RT-PCR标准曲线法来测定表达水平，并关于18S核糖体RNA标准化。原代软骨细胞(PC)中的表达水平定标成1;其它比率相应地定标。图8描绘了来自图6和图7的HAPLN1和MFAP5表达水平的比率。原代软骨细胞(PC)中的比率定标成1;其它比率相应地定标。平比率。通过RT-PCR比较CT法来测定表达水平，并且该比率以2A(CT,MFAP5-C丁,HAPLN1)计异。图IOA描绘了与图2和图6中所显示的林相同的林、以及表4中所鉴定的别的软骨细胞、滑膜细胞、和真皮成纤维细胞抹中的HAPLN1和MFAP5表达水平比率。通过使用定制设计的(custom-designed)1物和探针的RT-PCR比较C丁法来测定表达水平，如实施例3中所描述的。HAPLN1:MFAP5比率以2A(CT>MFAP5-C，AP認0计算。图10B描绘了表5中所鉴定的别的细胞抹中的HAPLN1和MFAP5表达水平比率。使用与针对图IOA所描述的方法相同的方法来测定表达水平。图11显示了单层与胶原支架培养物中的HAPLN1和MFAP5表达水平比率之间的比较。所使用的细胞林列于表7中。通过RT-PCR标准曲线法来测定HAPLN1和MFAP5表达水平。将表达水平关于18S核糖体RNA标准化。原代软骨细胞(PC)的单层培养物中的比率定标成1;其它比率相应地定标。图12显示了单层与胶原支架培养物中的HAPLN1和MFAP5表达水平比率之间的比较，其使用与图ll中所显示的抹相同的林进行。通过RT-PCR比较CT法来测定HAPLN1和MFAP5表达水平，并且该比率以2、Ct，mfaps-C丁,hapln1)计异。图13描绘了HAPLN1和MFAP5表达水平比率的变化，作为培养水平的函数。3种滑膜细胞抹自原代培养(培养水平l)培养至第四次传代(培养水平5),如该图中所显示的。通过RT-PCR比较Or法来测定HAPLNl和MFAP5表达水平，并且该比率以2八(Gr,mfap5-CT,h肌n,)计算。图14A和图14B描绘了HAPLN1和MFAP5表达水平比率的变化，作为培养水平函数。在图14A和图14B中，自软骨(培养水平0)取样得到软骨细胞抹，然后从原代(培养水平l)培养至第二次传代(培养水平3),如该图中所显示的。通过使用定制设计的引物和探针的RT-PCR比较Gr法来测定表达水平，如实施例5中所描述的。HAPLN1:MFAP5比率以2八(Ct,mmp5-CT,HAPLNI)计算。图15描绘了软骨细胞和滑膜细胞混合群体培养物中HAPLN1和MFAP5表达水平的比率。进行了三次试验，每次具有不同比例的两种细胞类型。通过使用定制设计的引物和探针的RT-PCR比较CV法来测定表达水平，如实施例6中所描述的。HAPLN1:MFAP5比率以2八(CT,mfap5-Or，hap园)计算。的摩尔比率，其使用通过绝对定量方法测定得到的标志物绝对拷贝数得到。如实施例3中所描述的那样实施RT-PCR,只是每13pLPCR^应体系使用2i^LcDNA。自以103、104、和105个拷贝/反应运行的合成HAPLN1和MFAP5RNA转录物标准品绘制标准曲线。从这些标准曲线确定每个测试样品中所存在的HAPLN1和MFAP5mRNA拷贝的数量。发明详述本发明至少部分基于将MFAP5鉴定为如下的基因，其在某些非软骨细胞细胞类型(诸如成纤维细胞和滑膜细胞)中高度表达，而在软骨细胞中以显著更低的水平表达。因而，在一些实施方案中，本发明提供了使用MFAP5作为细胞表型标志物的方法。MFAP5是富含丝氨酸-苏氨酸的蛋白质，其结合微纤维蛋白，并且据报道其牵涉I型前胶原的稳定化(Lemaire等,Arthritis&Rheumatism,52(6):1812-1823(2005))。人MFAP5的核香酸和氨基酸序列可以以GenBank⑧登录号NM—003480找到；其核苷酸序列还以SEQIDNO:l提供。在MFAP5外或者替代MFAP5，其它成纤维细胞标志物也可以在本发明的方法中使用，如下文所描述的。因而，在一个方面，本发明提供了一种评估包含软骨细胞的细胞培养物的组成的方法(方法l)和一种评估细胞个体的表型的方法(方法2)。在涉及方法l的实施方案中，各种标志物的表达水平以该标志物在多个细胞中的平均表达水平测定。在方法l的实施方案中，细胞培养物的组成可以作为整体评估以确定其是否含有软骨细胞。在方法2的实施方案中，标志物的表达水平以该标志物在所评估的细月包个体中的表达水平测定。如此，方法l鉴定细胞培养物的组成，而方法2鉴定细胞个体的表型，例如该细胞是否是软骨细胞。在一些实施方案中，成纤维细胞标志物不同于MFAP5，而是这样的，即其标准化表达水平在软骨细胞中比在成纤维细胞中低。在一些实施方案中，成纤维细胞标志物是这样的，即其标准化表达水平在软骨细胞(例如原代软骨细胞、培养的去分化软骨细胞)中比在成纤维细胞(例如真皮成纤维细胞)和/或滑膜细胞中低。在一些实施方案中，成纤维细胞标志物在软骨细胞中比在成纤维细胞和/或滑膜细胞中表达得低至少2倍、5倍、8倍、10倍、或更小。此类别的标志物可以使用例如基因阵列分析来鉴定，如记载于例如Leung等，TrendsinGenetics,19(11):649-659(2003)的。在一些实施方案中，方法l包括测定本发明的成纤维细胞标志物在来自细胞培养物的多个细胞中的表达水平，其中低于预定阈值的表达水平指明所述细胞培养物含有软骨细胞。或者，高于预定阈值的表达水平指明所述细胞培养物不含软骨细胞(例如所述培养物不包含至少50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多的软骨细胞)。在例示性的实施方案中，成纤维细胞标志物是MFAP5，并且由细胞培养物进行的高于阈值的MFAP5表达指明所述培养物含有实质数目的非软骨细胞。在一些实施方案中，预定的阈值水平l)等于或小于纯的成纤维细胞培养物中的MFAP5表达水平(例如低2倍、3倍、4倍、或5倍)或者2)等于或大于(例如高2倍、3倍、4倍、或5倍)纯的软骨细胞培养物(例如自软骨活组织检查物获得的原代软骨细胞)中的MFAP5表达水平。对于不同于MFAP5的成纤维细胞标志物，可以类似地根据各种标志物在纯的成纤维细胞和/或软骨细胞中的表达水平来选择预定的阈值。"预定的"水平不需要在测定标志物表达水平前进行选择，而是可以在测定表达水平后根据例如对表达结果的统计学分析进行选择。来自所评估的培养物的多个细胞可以以自该培养物获得的样品或等分试样代表。例如，在胶原基质上培养的培养物的情况中，可以使用穿孔取样，如实施例中所描述的。所述多个细胞通常会含有至少足以进行给定的表达分析方法的细胞数目，或者更多。例如，对于PCR，少至10-1,000个细胞通常便是足够的，但是还可以使用更低的数目。在一些实施方案中，方法1和方法2牵涉将成纤维细胞标志物(MFAP5或另一种成纤维细胞标志物)和软骨细胞标志物(例如HAPLN1或另一种软骨细胞标志物)的表达水平与对照进行比较或者彼此进行比较。测定任一标志物的表达水平的次序可以有所不同。例如，可以首先测定软骨细胞标志物的表达水平，然后测定成纤维细胞标志物的表达水平，或者反之亦然。在一些实施方案中，可以同时测定这两种类型的标志物的表达水平。表l中提供了本发明方法中有用的一些软骨细胞标志物的例子(包括它们的GenBankTM登录号和SEQIDNO)。如此，在一些实施方案中，所述软骨细胞标志物选自HAPLN1、MGP、EDIL3、WISP3、AGC1、COMP、COL2Al、COL9Al、COLllAl、LECT1、S100B、CRTAC1、SOX9、和NEBL。表l:软骨细胞标志物的例子标志物名称GenBankTM登录号SEQIDNO参考文献乙酰透明质酸和NM一001884SEQIDBuckwalter等,J.Biol.Chem.,蛋白聚糖连接蛋NO:2259(9):5361-5363(1984)白l(HAPLN1)基质Gla蛋白画一000900SEQIDMonroe等，NatGenet，21(1):(MGP)NO:3142-4(1999)GF样重复和丽—005711SEQIDGenesDev.,12(1):21-33(1998)盘菌素I样结构NO:4域3(EDIL3)14<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>别的软骨细胞标志物可以使用例如基因阵列分析来鉴定，如记载于例如Leung等,TrendsinGenetics,19(11):649-659(2003)的。一般而言，软骨细月包标志物是这样的基因或蛋白质，其标准化表达水平在软骨细胞(例如原代软骨细胞、培养的去分化软骨细胞)中比在成纤维细胞(例如真皮成纤维细胞)和/或滑膜细胞中高。在一些实施方案中，所述软骨细胞标志物在软骨细胞中比在成纤维细胞和/或滑膜细胞中表达得高至少2倍、4倍、5倍、8倍、10倍、5(H咅、75卩咅、100倍或更大。在一些实施方案中，以这样一种方式选择成纤维细胞标志物和软骨细胞率等于或者大于真皮成纤维细胞和/或滑膜细胞中的表达水平比率的5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、75倍、100倍或更多倍。具体地，在一些实施方案中，方法l包括a)从细胞培养物获得多个细胞；b)测定软骨细胞标志物在所述多个细胞中的平均表达水平；c)测定成纤维细胞标志物在所述多个细胞中的平均表达水平；并d)根据所述软骨细胞标志物的平均表达水平和所述成纤维细胞标志物的平均表达水平来确定所述培养物的组成。在一些实施方案中，若软骨细胞标志物的表达水平高于预定的阈值，而成纤维细胞标志物的表达水平低于预定的阈值，则所述培养物鉴定为含有软骨细胞。或者，若所述软骨细胞标志物的表达水平低于预定的阈值，而所述成纤维细胞标志物的表达水平高于预定的阈值水平，则所述培养物不含软骨细胞(例如所述培养物不包含至少50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多的软骨细胞)。在方法l的进一步实施方案中，本发明包括一种评估细胞培养物组成的方法，所述方法包括a)从哺乳动物获得软骨活组织检查物；b)从所述活组织检查物分离细胞；c)在细胞培养物中培养步骤b)中分离得到的细胞；d)获得所述细胞培养物的样品；e)测定MFAP5和HAPLNl在一个或多个来自所述样品的细胞中的表达水平；并f)根据MFAP5和HAPLN1的表达水平来确定所述培养物的组成。在一些实施方案中，确定培养物组成的步骤包括比较软骨细胞标志物的平均表达水平和成纤维细胞标志物的平均表达水平。在一些此类实施方案中，在HAPLN1表达与MFAP5表达的比率大于0.25时，细胞培养物评估为含有软骨细胞。在具体的实施方案中，此比率指明细胞培养物含有至少50%的软骨细胞。在一些实施方案中，标志物的表达水平相对于;f皮此进行比较(如此，所述阈值可以定义为例如两种标志物表达水平之间的给定差异，或其比率)。例如，在一些实施方案中，软骨细胞标志物(例如HAPLN1)表达水平与成纤维细胞标志物(例如MFAP5)表达水平的比率大于预定的阈值，例如0.25、0.55、1、2、2.2、5、10、25、50或更多，指明所述细胞培养物含有软骨细胞。在方法l的一些实施方案中，在RNA水平测定软骨细胞和成纤维细胞标志物的表达水平，例如通过定量RT-PCR标准曲线法或通过定量RT-PCR比较Ct法(其测量成纤维细胞标志物和软骨细胞标志物所要求的阈值循环数的差异)来实现。在一个相关的方面，本发明提供了一种评估细胞个体的表型的方法(方法2)，例如使用流式细胞术来实现。该方法对于鉴定来自细胞培养物(包括自软骨或滑膜衍生的细胞培养物、软骨细胞培养物、成纤维细胞培养物、滑膜细胞培养物、或任何其它合适的培养物)的细胞个体是有用的。该方法对于鉴定自想要鉴定其中的细胞个体的任何合适的生物学样品(包括软骨样品、滑膜样品、成纤维细胞样品等)衍生的细胞个体也是有用的。在一些实施方案中，方法2包括测定本发明的成纤维细胞标志物在细胞中的表达水平，其中低于预定阈值的表达水平指明该细胞是软骨细胞。或者，高于预定阈值的表达水平指明该细胞不是软骨细胞(例如该细胞是成纤维细胞或滑膜细胞)。在一些实施方案中，方法2包括a)测定软骨细胞标志物在细胞中的表达水平；b)测定成纤维细胞标志物在细胞中的表达水平；并c)根据软骨细胞标志物的表达水平和成纤维细胞标志物的表达水平来评估细胞的表型。在一些实施方案中，若软骨细胞标志物的表达水平高于预定的阈值水平，而成纤维细胞标志物的表达水平低于预定的阈值水平，则所述细胞鉴定为软骨细胞。可以如上文针对方法1所描述的那样选择和评估方法2的实施方案中的成纤维细胞和软骨细胞标志物。可以使用商品化抗体来实施流式细胞术，或者可以制备此类抗体，如记载于例钕口Linsenmeyer等，Biochem.Biophys.Res.Com.，92(2):440-6(1980)的。由本发明方法所评估的细胞和培养物可以获自可含有不含有软骨细胞的任何生物学样品，包括任何组织、细胞培养物、或其它材料。在一些实施方案中，所评估的细胞或培养物是哺乳动物(特别是人)起源的。在一些实施方案中，细胞培养物从自软骨活组织检查物释放的细胞培养。例如，在自体软骨细胞植入中，用于该规程的软骨细胞通常自接受植入物的患者的软骨活组织检查物培养得到。Carticel自体软骨细胞产品(GenzymeCorporation:Cambridge,MA)是培养的软骨细胞产品的例子。在本发明的一些实施方案中，细胞培养物包含加载有软骨细胞的胶原基质。可以自软骨活组织检查物获得此类软骨细胞，并进行培养，之后在基质上加载，例如如MACM)植入产品中所使用的。本发明的方法对于在植入基质前筌定和/或证实加载至胶原支持物上的细胞的身份是有用的。为了例示细胞培养物测定方法效用的例子，参考图l。该图例示了产生用于自体软骨细胞植入(诸如使用Carticel自体软骨细胞来实现)的培养的软骨细胞产品中所牵涉的步骤，或用于产生用于MACI⑧植入规程的培养的软骨细胞产品的步骤。在步骤1中，运送来自接受自体软骨细胞植入的患者的软骨活组织检查物，用于加工(步骤2)。将活组织检查物质在步骤3进行消化以自软骨释放和收获软骨细胞。在步骤4，将所释放的细胞在组织培养瓶中分配，并在原代培养中扩充，若需要的话，进行传代培养。一旦细胞达到足够的数目，它们便可以任选地在步骤5进行冷藏，直至患者准备好接受植入物。一旦患者准备好接受所述细胞，便将它们融化，分配入组织培养瓶中，并培养以制备装配培养物(步骤6)。为了在自体软骨细胞植入物中使用，若在装配培养物中获得足够数目的细胞，则将细胞离心成细胞团，并在运送培养基中重悬，这便是"最终产品"，诸如Carticel⑧自体软骨细胞产品(步骤8)。这种"最终产品，，经过多种QC测试(包括例如无菌度测试、细胞生存力测试、内毒素测试、支原体测试、和培养物组成测试)(如本文中所描述的步骤9"QC身份")以确保所培养的细胞含有足够数目的软骨细胞。若所培养的细胞通过所有QC测试，则将它们运送(步骤IO)至患者以进行植入(步骤ll)。或者，在来自步骤6的装配培养物要在MACI⑧植入物中使用时，将细胞在培养基中重悬，接种至胶原支架上，并培养4天(步骤7)。培养期结束时，用运送培养基漂洗细胞以便为MACI⑧植入物产生最终产品。这种产品也经过上文所概述的QC测试。因而，无论最终产品是培养的软骨细胞(诸如Carticel自体软骨细胞)的悬浮液，还是用于MACI⑧植入物的支架接种产品，本发明的方法作为批量鉴定测定法(lotidentificationassay)或批量释放测定法(lotreleaseassay)都是有用的，用以在运送该培养物前证实细胞培养物的组分为含有软骨细胞。例如，"QC身份，，(步骤9)可以在最终产品装配前在任何步骤实施，例如步骤4、5、6、7、或8前。测定基因或蛋白质表达水平的许多方法是本领域技术人员知晓的，例如如记载于Sambrook等(编)Cloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989;CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等(编)NewYork:JohnWileyandSons,1998)的。此类方法的例子包括聚合酶链式反应(包括通过PCR、实时PCR(RT-PCR)和qRT-PCR、多重或单重PCR进行的绝对定量)、单细胞PCR、Northern印迹测定法、核酸酶保护测定法、原位杂交测定法、免疫组织化学测定法、免疫细胞化学测定法、电泳测定法诸如凝胶或毛细管、Western印迹测定法、ELISA、免疫沉淀测定法、基于层析的测定法诸如HPLC或凝胶层析、质谱术测定法、RNA酶保护测定法、流式细胞术测定法、DNA曱基化测定法、和组蛋白修饰分析测定法。在本发明的所有方法中，可以使用任何合适的方法(包括任一种常规方法)来测定表达水平(处于RNA或蛋白质水平)。可以通过例如定量RT-PCR(例如TaqManTMRT-PCR或RT-PCR)、Northern印迹、或用于测定RNA水平的任何其它方法，或者如实施例中所描述的那样来测定RNA水平。可以通过例如使用Western印迹、ELISA、流式细胞术、酶活性测定法、或用于测定蛋白质水平的任何其它方法来测定蛋白质水平。表达水平可以根据样品和/或对照中的RNA或蛋白质(其通常可以是持家基因，诸如P-肌动蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氬酶(GAPDH)、或18S核糖体RNA等)的总量来定标(scale)和/或标准化。通常进行标准化以解决蛋白质、DNA、或RNA输入量的变异性。例如，在实施例中，使用标准曲线来将表达水平关于18S核糖体RNA标准化。在例示性的实施方案中，使用RT-PCR来测定成纤维细胞和软骨细胞标志物的表达水平，其通过标准曲线或者通过比较Cr法进行相对量化来实现。在一些实施方案中，通过使用已知量的标志物来绘制标准曲线，能测定标志物拷贝数的绝对数量。用于进行此类测定法的一般方法记载于例如实时PCR系统AppliedBiosystems7900HT快速实时PCR系统和7300/7500实时PCR系统，ChemistryGuide,AppliedBiosystems,2005,PartNo.4348358Rev.E。在使用比较Gr法比较两种标志物的情况中，成纤维细胞标志物表达水平与软骨细胞标志物表达水平的比率量可以以(1+￡)、0^-Gp,e)计算，其中Or,f是成纤维细胞标志物阈值循环的数目，CT，e是软骨细胞标志物阈值循环的数目，假设扩增效率(E)对这两种标志物是相同的，并且将这两种标志物的起始量关于内源对照的相同量(例如如在两份一式两份样品中的)标准化。在E约等于l的情况中，如实施例中所例示的，该比率可以以2A(CT,f-Cr,c)估计。否则，该计算可以如实时PCR系统AppliedBiosystems7900HT快速实时PCR系统和7300/7500实时PCR系统，ChemistryGuide,AppliedBiosystems,2005，PartNo.4348358Rev.E的附录A中所描述的那样实施。本发明的进一步实施方案在下列实施例中例示，所述实施例意图是例示性的，而非意图对本发明的范围进行限制。实施例实施例l:HAPLN1和MFAP5在软骨细胞、滑膜细胞和成纤维细胞中的表达勿/3为、离和^1^——人软骨细胞培养物使用用于产生Cartice1⑧自体软骨细胞的方法或用于产生培养的软骨细胞的蛋白酶法从软骨分离。使用用于产生Carticel⑧自体软骨细胞的方法，将软骨组织修整掉骨和滑膜，并进行第一次消化，其中将组织在胶原酶溶液中于37。C酶促处理18小时。将自第一次消化所释放的细胞在装有含胎牛血清(FBS)和庆大霉素的培养基(EGHXX)的组织培养瓶中分配。然后所述细胞进行第二次消化，其中用胶原酶/胰蛋白酶溶液于37。C处理来自第一次消化的剩余组织达2.5小时。将自第二次消化所释放的细胞在装有EGHXX的组织培养瓶中分配。将第二次消化后的组织块剩余物在装有EGHXX的组织培养瓶中分配。使用蛋白酶分离法，将软骨组织修整掉骨和滑膜，并在链霉蛋白酶E(Sigma-AldrichInc.,St.Louis,MO)溶液中于37。C进行第一次消化达1.5小时。然后除去链霉蛋白酶溶液，并将对软骨的第二次消化在胶原酶溶液中于37。C实施18小时。然后将所释放的细胞在装有EGHXX的组织培养瓶中分配。分离后，细胞培养方法对于自任一分离方法所获得的细胞是相同的。每2至4天向原代细胞培养物再次供给新鲜的EGHXX。在原代培养瓶达到50°/。至80%汇合时，将它们用胰蛋白酶处理成单细胞悬浮液，用EGHXX进行中和以使胰蛋白酶失活，并实施细胞计数。然后对所得的细胞悬浮液取样，通过传代培养来进一步扩充，或者进行冷藏，用于长期贮存。原代培养物的传代培养称为继代培养或首次传代。随后的传代培养称为二次传代、三次传代、四次传代等。如下实施传代培养，即将细胞在装有EGHXX的组织培养瓶中分配，并每2至4天再次供给新鲜的EGHXX。在传代培养物达到80%至100%汇合时，将它们用胰蛋白酶处理成单细胞悬浮液，用EGHXX进行中和以使胰蛋白酶失活，并实施细胞计数。然后对所得的细胞悬浮液取样，进一步扩充，或者进行冷藏，用于长期贮存。人滑膜细胞培养物(滑膜衍生的细胞培养物，也称为滑膜成纤维细胞)S1和S2以冷藏的原代培养细胞自CellApplicationsInc.(SanDiego，CA)获得。将滑膜细胞在装有EGHXX培养基的组织培养瓶中分配，并使用用于产生Carticel⑧自体软骨细胞的方法来培养，如上文所描述的。人真皮成纤维细胞培养物以冷藏的原代培养细胞自CellApplicationsInc.购得。使用用于产生Carticd自体软骨细胞的方法来培养真皮成纤维细胞，如上文所描述的。本实施例中所使用的细胞培养物列于表2中。表2:RT-PCR分析中所使用的细胞培养物(实施例l)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>/A^和cDA^^^——使用TRI旋转规程自细胞培养物分离RNA(Reno等:Biotechniques22:1082-6(1997))。以分光光度法测定所分离的RNA浓度。为了自样品PC、Cl、C2、Sl、S2、Fl、和F2制备cDNA,使用随机六聚物引物运行第一链合成试剂盒(Roche,Indianapolis,IN)，其依照制造商的指示来实现。将所得的cDNA于-20。C或-80。C贮存，直至分析。差^4迷为Vf—一使用定量实时RT-PCR来实施基因表达分析，其使用标准曲线法或比较CV法来实现。实时PCR法基于5，核酸酶对双标记寡聚物探针的切割来报道靶序列的序列特异性引物扩增("TaqManTM"测定法)。分别使用TaqManTM基因表达测定法Hs00157103—ml和Hs00185803—ml(Applied说明书第17/32页BiosystemsInc.)来测定编码软骨连接蛋白(HAPLN1)和微原纤维相关蛋白5(MFAP5)的基因的表达。用TaqManTM通用PCR主混合物，无UNG(产品目录编号4324018，AppliedBiosystemsInc.)准备实时PCR，依照通用PCR混合物方案使用合适的TaqManTM基因表达测定法(AppliedBiosystems)和样品cDNA。在ABI7500实时PCR系统(AppliedBiosystemsInc.)上使用标准的TaqManTM循环和用于这种配制(configuration)的数据收集程序运行扩增。一式两份的25pL反应体系与每孔多至5ng输入cDNA—起运行。对所有测定法均使用O.l个单位的阈值。^尹凉必i4'法——^f吏用真核18SrRNA内源对照测定法(产品目录编号4319413E,AppliedBiosystemsInc.)来实施标准曲线法，其中使用18SrRNA作为内部对照来标准化RT-PCR结果，以解决输入变化。为了定量每种基因表达的相对水平，运行原代软骨细胞(PC)cDNA的多个稀释度以用7500系统软件产生标准曲线。从标准曲线确定每个测试样品的表达水平，并用所得mRNA相对于原代软骨细胞对照(PC)的比率除以样品18SrRNA相对于PC的比率来标准化cDNA加载。^較CV法——实施比较ct分析以从如上文所述的那样产生的实时定量RT-PCR基因表达分析原始数据确定各个样品中HAPLN1与MFAP5的相对基因表达比率。比较Gr法提供了对HAPLNl与MFAP5比率的相对测量，其容许在不需要标准品、标准曲线分析、或实际校准物的情况中进行测试样品间的直接比较。可以在本实施例中所使用的HAPLN1和MFAP5测定法的情况中采用这种方法，因为满足了下列4项条件l)测定法表现在各次运行间是一致的；2)在HAPLN1、MFAP5、和内源对照测定法中运行相当量的RNA;3)在每次测定法中运行相当量的RNA时，内源对照基因18SrRNA的ct值总是低于HAPLN1Ct或MFAP5Ct,且如此在HAPLN1或MFAP5可量化时，18SCT总是可量化的；和4)该方法使用任意选定的理论校准物，其定义为含有如下HAPLN1/MFAP5比率的理论样品，即在满足上文所列出的其它3项条件时其产生的HAPLN1Gr值等于MFAP5CVf直。用于这种比较CV法的方程式的推导如下。若样品中关于内源对照基因且相对于校准物标准化的靶基因量以下式払屮,口山,(l+E)八(-AAC丁，把基因)其中E二扩增效率其中AAC丁,i巴基因=々，口^AC丁,把基因—一又〉,^7AC丁,把基因且其中AG丁,te基因=Gt,耙基因—gt,内源对照基因(参见Liu,W.和Saint，D.A.，AnalyticalBiochemistry,302:52-59(2002);Livak，K.J,ABIPrism7700序列检测系统，用户公告2，ABI出版物4303859,1997)。则可以以下式描述HAPLN1与MFAP5的比率(1+E)八(-AAC丁,ha訓)/(1+E)a(-AAC丁，,5)其等于(1+E)八(-([才羊品Ct,haplni_才羊品C丁，内源对照基因]-[校准物Ct，hapln！-校准物Ct,内源对照基因]})/(1+￡)、-{[样品(^,mfap5—才羊品C丁，内源对照基因][才文'1^净勿CT,mfap5一4疋)，4》Gt，内源对照基因]})若在每次测定法中运行相同量的样品，则样品内源对照基因的Ct可以以x项代表。若在每次测定法中运行相同量的校准物，则校准物内源对照基因的C丁可以以y项代表。替代这些项，该方程式导出(1+E)A(-{^^。。CT，HAPLN1—x]-[校准物Ct,hapln—y]})/(l+E)A(-{p^^CT,mfap5-X]—[才交准物Ct,mfap5-y]))其等于(1+E)A([x—祥品Ct,hapln,]-[y—校准物Ct,hap副])/(1+E)八([x-样品C丁，mfap5]-[y-校准物C丁,mfap5])若所述校准物定义为含有如下HAPLN1/MFAP5比率的理论样品，即在每次测定法中运行相对量的校准物时其产生的Ct，hap园值等于Ct，mfap5值，则可以用z项替代校准物CT,hapln,和校准物Cr,mfap5。则该方程式导出(1+E)a([x—祥品Ct,h謂,〗—[y—z])/(1+E)八([x—祥品Ct，m函]_[y-z])其等于(1+E)A([X—祥品Ct,hapln,]-[y—z]—[x—祥品Ct，MFAP5]+[y—z])其等于(1+E)A([X—祥品Ct,hapln!]-[X—祥品Ct,mfap5])其等于(1+E)a(样品C丁,mfap5-样品C丁,hapln1)23且若E=1(100%效率)，则HAPLN1与MFAP5的相对比率等于2八(样品C丁,MFAP5-样品C丁，HAPLN1)上文的方程式导出仅剩下两个变量，即样品HAPLN1Gr和样品MFAP5Cr未知的的最终公式。此公式在样品于上文所描述的条件下测定且如上文所述的那样设置所采用的理论校准物时适用。图2描绘了数种细胞林中的HAPLN1表达水平，如通过RT-PCR标准曲线法所测定的。图3描绘了与图2中所显示的细胞样品相同的细胞样品中的MFAP5表达水平，如通过RT-PCR标准曲线法所测定的。HAPLN1在软骨细胞细胞培养物中比在滑膜细胞和成纤维细胞细胞培养物中表达的水平高。MFAP5在滑膜细胞和成纤维细胞细胞培养物中比在软骨细胞细胞培养物中表达的水平高。图4描绘了来自图2和图3的HAPLN1和MFAP5表达水平的比率。原代软骨细胞(PC)中的比率定标成1;其它比率相应地定标。图5描绘了与图2中所显示的抹相同的抹中的HAPLN1和MFAP5表达水平的比率，不过，所述表达水平是通过RT-PCR比较Or法测定的。Gr法的结果与通过标准曲线法所获得的结果类似。实施例2:HAPLN1和MFAP5在别的软骨细胞、滑膜细胞和成纤维细胞林中的表达在别的细胞培养物中测定HAPLN1和MFAP5的表达水平以证实用于区分软骨细胞与滑膜细胞培养物的方法的保真度。本实施例中所使用的培养物列于表3中。表3:RT-PCR分析中所使用的细胞培养物(实施例2)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>勿y敏为、离和培^——使用用于产生Cartice1⑧自体软骨细胞的方法来分离和培养人软骨细胞细胞培养物C3、C4、C5、C6、和C7，如实施例l中所描述的。人滑膜细胞培养物(滑膜衍生的细胞培养物，也称为滑膜成纤维细胞)在Genzyme分离或者自CellApplicationsInc.(SanDiego，CA)获得。抹S4、S6、和S7在Genzyme使用多种规程分离。如下分离S4，即将滑膜组织糜在胶原酶溶液中于37。C进行消化3.5小时，接着在胰蛋白酶溶液中于37。C进4亍第二次消化达l小时。通过将滑膜组织糜在含有胶原酶和DNA酶的溶液中于37。C进行消化2小时来分离抹S6。通过将滑膜糜进行用于产生Carticel⑧自体软骨细胞的方法来分离抹S7。分离后，将滑膜衍生的细胞在装有EGHXX培养基的组织培养瓶中分配，并如实施例1中所述的那样使用用于产生Carttcel自体软骨细胞的方法进行培养。抹S3和S5以冷藏的首次传代细胞自CellApplicationsInc.获得。融化后，将来自株S3和S5的细胞在装有EGHXX培养基的组织培养瓶中分配，并使用用于产生Carttce1⑧自体软骨细胞的方法如实施例1中所述的那样进行培养。7A^为、离和cDA^斜务——如实施例1中所描述的那样实施软骨细胞细胞培养物C3、C4、C5、C6、C7和滑膜细胞培养物S3、S4、S5、S6、S7的脂A制备。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems,Inc.,FosterCity，CA)依照制造商的指示将来自这些样品的RNA逆转录成cDNA。在本实施例中使用来自实施例1的PCcDNA。将cDNA于-20。C或-80。C贮存，直至进4亍分析。差这为Vf——如实施例1中所描述的那样使用RT-PCR来实施基因表达分析。图6描绘了多种别的软骨细胞和滑膜细胞抹中的HAPLN1表达水平。通过RT-PCR标准曲线法来测定表达水平，并关于18S核糖体RNA标准化。图7描绘了与图6中所显示的株相同的株中的MFAP5表达水平。通过RT-PCR标准曲线法来测定表达水平，并关于18S核糖体RNA标准化。图8描绘了来自图6和图7的HAPLN1和MFAP5表达水平的比率。原代软骨细胞(PC)中的比率定标成1;其它比率相应地定标。平的比率。通过RT-PCR比较Cr法来测定表达水平，并且该比率以2A(CT,MFAP5C丁,HAPLNl)计算o这些别的细胞4朱中的RT-PCR结果与实施例1中所获得的结果一致。实施例3:使用定制设计的引物和探针测试HAPLN1和MFAP5在软骨细胞、滑膜细胞和成纤维细胞中的表达用已知寡核苷酸序列的引物和探针实施多种软骨细胞、滑膜细胞、和真皮成纤维细胞培养物的测试。细^为、庸和培#——本实施例中所使用的细胞林列于下文表4和表5中。如实施例1中所描述的，使用用于产生Cartice1⑧自体软骨细胞的方法来分离和培养人软骨细胞细胞培养物C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C26、C28、C30、和C34。如实施例l中所描述的，分离(使用蛋白酶法)和培养人软骨细胞细胞培养物C21、C22、C23、C24、C25、C27、C29、C31、C32、和C33。用于人滑膜细胞培养物S1、S2、S3、S4、S5、S6、和S7的细胞分离和培养方法记载于实施例1和实施例2中。通过将滑膜组织糜在含有胶原酶和DNA酶的溶液中于37。C消化2小时来分离滑膜细胞培养物S9。如下分离滑膜细胞培养物SIO，即将滑膜组织糜在胶原酶溶液中于37。C消化3.5小时，接着在胰蛋白酶溶液中于37。C进行第二次消化达1小时。滑膜细胞抹Sll、S12、S13、S14、S15、S16、S17、和S18以冷藏的首次传代细胞自CellApplicationsInc.获4寻。真皮成纤维细月包才朱F1、F2、F3、F4、F5、F6、F8、F9、FIO、和Fl1以冷藏的原代培养细胞自CellApplicationsInc.获得。所有细胞培养物如实施例l中所描述的那样使用用于产生Cartice1⑧自体软骨细胞的方法培养。表4:RT-PCR分析口所使用的第一组细胞培养物(实施例3)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>分析。差西《这分浙——用对HAPLN1和MFAP5mRNA多个区域特异性的定制设计引物和探针来实施RT-PCR测定法。关于定制引物和探针的序列信息显示于表6中。缩写6FAM=6-羧基荧光素，VIC7M是AppliedBiosystemsInc.的商标且是荧光团，MGBNFQ二小沟结合物非荧光淬灭剂。引物自InvitrogenCorp.(Carlsbad,CA)获4寻。才笨4十自AppliedBiosystemsInc.获4寻。只十于HAPLNl，正向引物的靶物是以GenBank登录号NM—001884.2(SEQIDNO:2)存储的HAPLN1序列的核苷酸543至570,反向引物的靶物是核苦酸603至622，而探针的耙物是同一序列的核香酸584至601。对于MFAP5，正向引物的靶物是以Genbank登录号NM—003480.2(SEQIDNO:l)存储的MFAP5序列的核普酸301至322;反向引物的靶物是核苷酸353至372,而探针的靶物是同一序列的核苷酸334至350。依照TaqManTM快速通用PCR混合物方案用TaqManTM快速通用PCR主混合物，无UNG(产品目录编号4352042，AppliedBiosystemsInc.)、卯0nM引物、250nM探针、和多至5ng样品cDNA来实施实时PCR。反应体积为13pL，并且在ABI7500实时PCR系统(AppliedBiosystemsInc.)上使用缺省快速TaqManTM循环和用于此配制的数据收集程序运行扩增。对所有的测定法均使用0.1个单位的阈值。通过实施例1中所描述的RT-PCR比较CT法来测定表达水平。表6:定制引物和探针序列<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>图IOA描绘了与图2和图6中所显示的抹相同的林、以及来自表4的别的软骨细胞、滑膜细胞、和真皮成纤维细胞抹中的HAPLN1和MFAP5表达水平的定制设计的引物和探针所获得结果与实施例1和实施例2中所描述的结果类似。实施例4:HAPLN1和MFAP5在单层和胶原支架中的软骨细胞、滑膜细胞和成纤维细胞培养物中的表达水平的比较在单层和胶原支架中的多种类型的培养物中比较HAPLN1和MFAP5的表达水平。勿^敏为Sf和培#一一如实施例1中所描述的那样使用蛋白酶方法来分离软骨细胞培养物C9、CIO、Cll、C12、C13、C14、C15、C16、C17、和C18，并如实施例1中所描述的那样培养。如实施例1和实施例2中所描述的那样分离和培养滑膜细胞培养物S7。真皮成纤维细胞培养物F2和F7以冷藏的原代培养细胞自CellApplicationsInc.获得，并如实施例1中所描述的那样培养。完成第二次传代培养(培养物S7的第三次传代)后，采集样品用于RNA分离("第0天"或单层样品)，然后将细胞在EGHXX培养基中重悬，并接种至20cm2MAIX支架(ACI-MAIX胶原膜，CE,MatricelGmbH,D-52134Herzogenrath,Germany)上。让细胞于37。C附着1小时，然后向所述支架供给另外的EGHXX，并培养4天。含有滑膜细胞和真皮成纤维细胞的支架培养物也以相同的方式制备。支架培养4天后，使用8mm活组织检查穿孔器对该培养物进行取样("第4天，，或支架样品)，并实施RNA分离。为、;f和cDA64*务——使用RNeasyTM迷你试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)来分离RNA。对于RNeasyTM分离，将360iaL溶解溶液添加至MACI⑧植入物样品(每次制备多至两块8mmMACI⑧植入物穿孔物)。立即以全速涡旋振荡样品30秒，然后于37。C放置5分钟。温育后，用手摇动样品10秒以展开膜，接着再以全速涡旋振荡30秒。收集每管的内容物，并将溶胞物运行流过QiashredderTM柱(Qiagen)。在RNeasyTM规程中遵循制造商用于从动物细胞分离RNA的方案使用350(aLQiashredded溶胞物。用由30(aL水组成的单一洗脱来洗脱该柱。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems,Inc.,FosterCity,CA)依照制造商的指示来实施自样品RNA制备cDNA。将cDNA于-20。C或-80。C贝i存。表7列出了本实施例中所使用的细胞培养物和所使用的配置。表7:RT-PCR分析中所使用的细胞培养物(实施例4)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>差^《迷分^f——以上文实施例1中所概述的方式实施单层和MACI⑧植入物cDNA的基因表达分析。图ll显示了单层和胶原支架培养物中的HAPLN1和MFAP5表达水平比率之间的比较。将表达水平关于18S核糖体RNA标准化。原代软骨细胞(PC)的单层培养物中的比率定标成l;其它比率相应地定标。图12显示了单层和胶原支架培养物中的HAPLN1和MFAP5表达水平比率之间的比较，其使用与图ll中所显示的抹相同的抹进行。通过RT-PCR比较CT法来测定HAPLN1和MFAP5的表达水平，并且该比率以2A(CT,MFAP5-C-r,HAPLNl)计算。在支架培养物中所获得的结果与在单层培养物中所获得的结果类似。实施例5:作为传代次数函数的HAPLN1和MFAP5表达调查HAPLN1与MFAP5在多种培养水平的比率。细應分/f和培#——如实施例1中所描述的那样使用蛋白酶法来分离软骨细胞培养物C19、C20、C31、C32、和C33,并如实施例l中所描述的那样培养。如实施例1和实施例2中所描述的那样分离和培养滑膜细胞培养物S6和S7。通过将滑膜组织糜在含有胶原酶和DNA酶的溶液中于37。C消化2小时来分离滑膜细胞培养物S8。如实施例1中所描述的那样实施S8的细胞培养。对于软骨细胞培养物C19、C20、C31、C32、和C33,采集软骨衍生细胞(在图14A和图14B中标记为"O，，)、原代培养细胞(在图14A和图14B中标记为'T，)、首次传代细胞(在图14A和图14B中标记为"2")、和第二次传代细胞(在图14A和图14B中标记为"3")的样品。对于滑膜细胞培养物S7，采集原代培养细胞(在图13中标记为"r)、首次传代细胞(在图13中标记为"2")、第二次传代细胞(在图13中标记为"3")、第三次传代细胞(在图13中标记为"4")、和第四次传代细胞(在图13中标记为"5")的样品。对于滑膜细胞培养物S6和S8，采集首次传代细胞(在图13上标记为"2")、第二次传代细胞(在图13上标记为"3")、第三次传代细胞(在图13上标记为"4")、和第四次传代细胞(在图13上标记为"4")的样品。^A^分库和cZWv4斜备——如实施例3中所描述的那样使用RNeasyTM迷你试剂盒(Qiagen)和高容量cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystemsInc.)来制备RNA和cDNA。差^4这为V^_—如实施例l中所描述的那样实施滑膜细胞样品的基因表达分析。如实施例3中所描述的那样实施软骨细胞样品的基因表达分析。32图13、图14A、和图14B描绘了HAPLN1和MFAP5表达水平比率的变化，作为传代次数的函数。通过RT-PCR比较Gr法来测定表达水平。HAPLN1:MFAP5比率以2A(Ct,mfap5-Ct，hap固)奸算。相对于软骨细胞样品，HAPLN1与MFAP5的比率在滑膜细胞样品的所有培养水平一致地较低。相对于滑膜细胞样品，HAPLN1与MFAP5的比率在软骨细胞样品的所有培养水平一致地较高。实施例6:HAPLN1和MFAP5在混合细胞培养物中的表达将基因表达分析应用于软骨细胞和滑膜细胞的混合培养物以评估该方法在混合培养物中的灵敏度水平。使用人软骨细胞和人滑膜细胞的细胞培养物来制备下列比例的两种细胞类型的混合物1)0%软骨细胞/100%滑膜细胞；2)25%软骨细胞/75%滑膜细胞；3)50%软骨细胞/50%滑膜细胞；4)75%软骨细胞/25%滑膜细胞；和5)100%软骨细胞/0%滑膜细胞。细應分葛和培#——如实施例1和实施例2中所描述的那样分离和制备软骨细胞株C5、C6、和C8。如实施例l、实施例2、和实施例3中所描述的那样分离和培养滑膜细胞培养物S6、S7、和S9。对于混合实验l,使用软骨细胞抹6(C6)和滑膜细胞林6(S6)的第二次传代培养物。对于混合实验2，使用软骨细胞林8(C8)和滑膜细胞抹7(S7)的首次传代培养物。对于混合实验3，使用软骨细胞抹5(C5)和滑膜细胞抹9(S9)的首次传代培养物。/A^为、离和cDA64賴务——如实施例3中所描述的那样使用RNeasyTM迷你试剂盒(Qiagen)和高容量cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystemsInc.)来制备RNA和cDNA。差^7羞这为V^—一如实施例3中所描述的那样实施基因表达分析。通过RT-PCR比较CT法来测定表达水平。HAPLN1:MFAP5比率以2A(CT,MFAP5-Ct,hap固)奸算。图15中提供了混合实验的结果，该图显示了HAPLN1和MFAP5在由软骨细胞和滑膜细胞的混合群体组成的样品中的表达水平的比率。在含有75%或更少的软骨细胞和25%或更多的滑膜细胞的培养物中，HAPLN1:MFAP5表达水平比率是约1或更低。较高的比率对应于软骨细胞在所测试样品中的较高比例。该测定法辨别细胞培养物混合物的能力显示了，平均而言，由至少67。/o软骨细胞及由滑膜成纤维细胞组成的余量(balance)构成的样品产生正值的Gr.MFAP5-CT.HAPLN1。用此测定法还可以检测出其它细胞类型(诸如真皮成纤维细胞)的污染。实施例7:对测定响应和标志物分子比率之间关系的分析釆用HAPLN1和MFAP5的合成RNA转录物来确定测试样品中测定响应和标志物分子比率之间的关系。首先，使用表8中所列出的引物对人cDNA实施初次PCR(白金级PCRSupermix,Invitrogen产品目录编号11306-016)。对于HAPLNl,这些引物扩增HAPLN1基因(登录号NM—001884.2)的第256位至第117H立核苷酸。对于MFAP5，这些引物扩增MFAP5基因(登录号NM一003480.2)的第32位至第728位核苷酸。使用供参照用的100bp分子大小梯(100bpPCR分子标尺，BioRad产品目录编号170-8206)和SYBRGreenI(Invitrogen产品目录编号S-7563)凝胶染色在1.5%Tris-乙酸盐EDTA(TAE)琼脂糖凝胶上分析PCR产物。用4。/。天然Tris-硼酸盐EDTA(TBE)聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶对所得的初次扩增子进行凝胶纯化，并作为模板用于用表8中所列出的引物进行的再次PCR。以每200iiL再次反应体系0.56ng加载经凝胶纯化的初次扩增子模板，供再次MFAP5扩增用。以每900iaL再次反应体系2.5ng加载经凝胶纯化的初次扩增子模板，供再次HAPLN1扩增用。如所描述的那样自天然TBEPAGE凝胶纯化再次扩增子，并作为模板用于用AmbionMegascriptT7试剂盒进行的体外转录。每20pL转录反应体系使用多至1.3吗的再次扩增子模板。用6%TBE-尿素(TBU)聚丙烯酰胺凝胶对所得的转录物进行凝胶纯化，在O.lmMEDTA中重悬，并使用1A，个单位对应于40ng/(iLRNA浓度的转换因子以分光光度法进行量化，其中一式两份实施读数。在6%TBU凝胶上分析经凝胶纯化的转录物以评估纯度。在通过PAGE分析测定纯度并通过分光光度法定量后，使用表9中所列出的转换因子来确定每iaL的转录物拷贝数。这些转换因子假定343道尔顿的平均碱基分子量。认为阿伏伽德罗常数是6.02X1023个/摩尔。还假定的是，所转录的第一个碱基是来自T7启动子的+lG，接着是靶序列。以103至108个拷贝/|^的浓度范围将转录物在酵母RNA载体緩冲液(酵母RNA(Ambion产品目录编号AM7120G)在无核酸酶的水中的20ng/pL溶液)中稀释。然后使用本专利申请的实施例3中所给出的RT-PCIO见程来测试稀森物，只是每13iiLPCR^应体系使用2pLcDNA。然后如本专利申请的实施例4中所描述的那样使用比较Gr法来对每个稀释物计算HAPLN1:MFAP5的比率。将使用拷贝数标准品得到的测定响应与已知的分子比率进行比较。这些结果显示于表10中。确定了测定响应和分子比率之间的关系，便计算位于多个测定响应的准确分子比率。表ll中所显示的这些结果指明，在比较Ct确定的接受界限(acceptanceboundary)等于l(例如HAPLN1:MFAP5=l的情况)时，这对应于HAPLN1:MFAP5的准确分子比率2.212。表8:用于扩增拷贝数标准品的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表9:预期的转录物大小和转换因子<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表10:测定响应对标志物分子比率<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>实施例8:对软骨细胞和成纤维细胞标志物的绝对定量分析使用绝对定量方法实施基因表达分析。表12列出了本实施例中所使用的细胞培养物。如上文实施例中所描述的那样分离和培养各种培养物。如实施例3中所讨论的那样使用RNeasy试剂盒来自细胞培养物分离RNA。如实施例3中所描述的那样对细胞培养物实施RT-PCR，只是每13ji1PCR^应体系使用2jilcDNA。稀释HAPLN1和MFAP5的体外转录RNA标准品(如实施例7中所描述的那样制备的)以产生具有每uL5X102、5X103、和5X104个拷贝的终浓度的cDNA。通过与x轴上每次反应的拷贝数(103、104、和105)的对数对应地在y轴上绘制来自标准品的Ct结果，产生标准曲线。对该数据拟合一条线性趋势线，并以数学方法确定每个测试样品中所存在的HAPLN1和MFAP5mRNA拷贝数量。这种定量方法先前已经记载于例如实时PCR系统:AppliedBiosystems7900HT快速实时PCR系统和7300/7500实时PCR系统,ChemistryGuide,AppliedBiosystems,2005，PartNo.4348358Rev.E中。然后对每个样品计算HAPLN1:MFAP5的摩尔比率。图16描绘了多种细胞培养物中的HAPLN1:MFAP5摩尔比率。这些结果指明，相对于滑膜细胞和真皮成纤维细胞而言，软骨细胞中的HAPLN1:MFAP5摩尔比率较高。表12:绝对定量分析中所使用的细胞培养物(实施例8)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>就通过提及而收录的材料与本说明书矛盾或不一致而言，本说明书会取代任何此类材料。权利要求1.一种评估细胞培养物组成的方法，所述方法包括a)从所述细胞培养物获得多个细胞；b)测定成纤维细胞标志物在所述多个细胞中的平均表达水平，所述成纤维细胞标志物是这样的，即其标准化表达水平在软骨细胞中比在成纤维细胞或滑膜细胞中低；并c)根据所述成纤维细胞标志物的平均表达水平来确定所述培养物的组成，其中1)所述细胞培养物包含软骨细胞或者2)所述成纤维细胞标志物是微原纤维相关蛋白5(MFAP5)。2.—种评估细胞培养物组成的方法，所述方法包括a)从所述细胞培养物荻得多个细胞；b)测定成纤维细胞标志物在所述多个细胞中的平均表达水平，所述成纤维细胞标志物是这样的，即其标准化表达水平在软骨细胞中比在成纤维细胞或滑膜细胞中低；并组成，其中低于预定阈值的平均表达水平指明所述细胞培养物包含软骨细胞。3.—种评估细胞培养物组成的方法，所述方法包括a)从所述细胞培养物获得多个细胞；b)测定MFAP5在所述多个细胞中的平均表达水平；并其中低于预定阈值的MFAP5平均表达水平指明所述细胞培养物包含软骨细胞。4.权利要求l的方法，其中1)所述细胞培养物包含软骨细胞及2)所述成纤维细胞标志物是MFAP5。5.权利要求l的方法，其中所述成纤维细胞标志物是这样的，即其标准化6.权利要求1的方法，进一步包括测定软骨细胞标志物在所述多个细胞中的平均表达水平；并在步骤c)中，根据所述软骨细胞标志物的平均表达水平和所述软骨细胞和成纤维细胞标志物的平均表达水平来确定所述培养物的组成。7.权利要求6的方法，其中所述成纤维细胞标志物和所述软骨细胞标志物是这样的，即它们在软骨细胞中的表达水平比率(软骨细胞标志物比成纤维细胞标志物)等于或大于在真皮成纤维细胞或滑膜细胞中的比率的5倍。8.权利要求6的方法，其中所述软骨细胞标志物选自表l中所列出的软骨细胞标志物。9.权利要求6的方法，其中所述软骨细胞标志物是HAPLN1。10.权利要求6的方法，其中所述软骨细胞标志物是HAPLNl,而所述成纤维细胞标志物是MFAP5。11.权利要求6的方法，其中所述成纤维细胞标志物和软骨细胞标志物的表达水平是在RNA水平测定的。12.权利要求ll的方法，其中所述表达水平是使用PCR测定的。13.权利要求12的方法，其中所述表达水平是使用比较GrPCR方法测定的。14.权利要求6的方法，其中使用比较GrPCR方法测定得出的大于0.25的所述软骨细胞标志物与所述成纤维细胞标志物的表达水平比率指明所述细胞培养物含有软骨细胞。15.权利要求14的方法，其中所述比率指明所述细胞培养物含有至少50%的软骨细胞。16.权利要求6的方法，其中大于0.55的所述软骨细胞标志物与所述成纤维细胞标志物的摩尔比率指明所述细胞培养物含有软骨细胞。17.权利要求16的方法，其中所述摩尔比率指明所述细胞培养物含有至少50%的软骨细胞。18.权利要求l的方法，其中所述细胞培养物包含自软骨活组织检查获得的细胞。19.权利要求18的方法，其中所述软骨活组织检查是自膝关节采集的。20.权利要求18的方法，其中对所述细胞培养物评估后，给有所需要的患者施用来自所述细胞培养物的细胞。21.权利要求20的方法，其中来自所述培养物的细胞用于自体软骨细胞植入。22.—种评估细胞表型的方法，该方法包括a)测定MFAP5在所述细胞中的表达水平；并b)根据MFAP5的表达水平来确定所述细胞的表型。23.权利要求22的方法，进一步包括测定软骨细胞标志物在所述细胞中的表达水平；并在步骤b)中，根据所述软骨细胞标志物和MFAP5的表达水平来确定所述细胞的表型。24.权利要求23的方法，其中所述软骨细胞标志物选自表l中所列出的软骨细月包标志物。25.权利要求23的方法，其中所述软骨细胞标志物是HAPLN1。26.权利要求23的方法，其中所述软骨细胞标志物是HAPLN1，而所述成纤维细胞标志物是MFAP5。27.权利要求23的方法，其中所述成纤维细胞标志物和软骨细胞标志物的表达水平是在RNA水平测定的。28.—种评估细胞培养物组成的方法，所述方法包括a)从哺乳动物获得软骨活组织检查；b)从所述活组织冲企查分离细胞；c)在细胞培养物中培养步骤b)中所分离的细胞；d)获得所述细胞培养物的样品；e)测定MFAP5和HAPLN1在一个或多个来自所述样品的细胞中的表达水平；并f)根据MFAP5和HAPLN1的表达水平来确定所述培养物的组成。29.权利要求28的方法，其中所述MFAP5和HAPLN1的表达水平是在RNA水平测定的。30.权利要求29的方法，其中所述表达水平是使用PCR测定的。31.权利要求30的方法，其中所述表达水平是使用比较GrPCR方法测定的。32.权利要求28的方法，其中使用比校CtPCR方法测定得出的大于0.25的HAPLN1与MFAP5的表达水平比率指明所述细胞培养物含有软骨细胞。33.权利要求32的方法，其中所述比率指明所述细胞培养物含有至少50%的软骨细胞。34.;f又利要求28的方法，其中大于0.55的HAPLN1与MFAP5的摩尔比率指明所述细胞培养物含有:软骨细胞。35.权利要求34的方法，其中所述摩尔比率指明所述细胞培养物含有至少50%的软骨细胞。全文摘要公开了用于评估细胞培养物组成(例如用以区分软骨细胞与成纤维细胞)的方法和用于评估细胞个体的表型(例如评估为软骨细胞)的方法。该方法可以用于例如评估用于治疗软骨缺陷的软骨细胞培养物。在一些实施方案中，本发明牵涉根据成纤维细胞标志物的表达水平来鉴定细胞培养物组成或细胞身份。在其它实施方案中，本发明牵涉在细胞培养物样品中或细胞个体中比较至少一种软骨细胞标志物和至少一种成纤维细胞标志物的表达水平。在例示性的实施方案中，所述软骨细胞标志物是乙酰透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1(HAPLN1)，而所述成纤维细胞标志物是微原纤维相关蛋白5(MFAP5)。文档编号G01N33/68GK101680881SQ200880017437公开日2010年3月24日申请日期2008年4月3日优先权日2007年4月6日发明者斯蒂芬·J·杜瓜伊,斯蒂芬·M·拉普科申请人:建新公司