荧光定量pcr定性检测高危型hpv的方法及其试剂盒的制作方法

专利名称：荧光定量pcr定性检测高危型hpv的方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于病毒检测技术领域，尤指一种荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方法。
背景技术：
宫颈癌在全球妇女的癌症死因中高居第二位，世界上每年的新发病例约为45万， 死亡率为50%。Drs. Rous and Beard最早在1934曾经提出HPV为致癌物质，此后自1974 年Zur Hausen提出HPV是宫颈癌的最可能因素后，国内外学者就HPV感染与子宫颈癌的关 系进行了大量的研究，并获取了许多实验室与临床证据。1977年Laverty在电镜中观察到 子宫颈癌活检组织中存在HPV颗粒，1981年第一次在生殖道分离出了 HPV，1983-1986年依 次从宫颈癌样本中分离出HPV16、18、31、35等型别。1995年IARC专题讨论会确定HPV感 染是子宫颈癌的主要病因。目前研究发现99. 7%的宫颈鳞状细胞癌有人乳头瘤病毒的感 染，而高危型人乳头状瘤病毒的持续感染是宫颈癌发病的重要因素。人乳头瘤病毒(Human Papillomaviruses, HPV)属乳多空病毒科A亚群内的一组 DNA病毒，外形呈20多面体对称型，无包膜，直径约45nm 55nm，基因组为共价闭合环状双 链DNA分子，含近8000个碱基对(bp)。HPV基因组含8个开放读码框架；可分为三个基因 区，包括两个编码区和一个非编码调控区。编码区分为E区和L区，E区包括E1、E2、E4、E5、 E6、E7;L区包括L1、L2，分别编码早期蛋白和晚期蛋白，六个E蛋白主要负责病毒DNA的复 制、转录和细胞转化，两个L蛋白为衣壳蛋白主要负责病毒颗粒的组装和DNA包装。当分离株病毒Ll区序列与已知序列近源病毒株同源性少于90%时，就可被确定 为一种新的HPV型别，按照HPV亚型与癌症相关性的高低将HPV分为高危型和低危型。高 危型 HPV 包括 HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73 和 82 ；可能的高危型包 括 HPV26、53 和 66 ；低危型包括 HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81 和 CP6108。HPV 与 多种疾病密切相关，低危型HPV能引起良性生殖器疣；而高危型HPV则可引起宫颈癌、外生 殖器癌及高度子宫颈上皮内瘤等恶性病变。因此，HPV感染的检测和分型对了解女性生殖 道肿瘤相关病情、判断预后、指导治疗、分析HPV流行状况以及基因疫苗的研制均具有重要 价值。由于HPV具有高度种属特异性，难以在体外常规细胞培养系统中培养，也不能通 过分离病毒来确定型别，目前缺少一种可行的血清学技术检验手段，因此，HPV的检测只能 依赖对其DNA序列的分子水平的检查。第二代杂交捕获法(hybrid caputure II，HC-II)是经美国FDA认证的可应用于 临床的HPV DNA检测技术，HC-II采用孔平板法，可一次检测13种高危型HPV病毒(包括 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、69)型，具体操作步骤样本DNA双链被释放并分 解为核苷酸单链。DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交体。特异性抗体将RNA-DNA杂 交体固定在微孔壁上。结合有碱性磷酸酶的多个二抗与RNA-DNA杂交体结合，放大信号。碱 性磷酸酶使酶底物发光，根据光的强弱确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂交体的含量。检测结果的判断标准是RLU (相对光单位，光信号)/Cutoff (域值=三个阳性质控 指标的平均值)》1为阳性，< 1为阴性。HC-II检测灵敏度高、重复性好且客观性强，然而 缺点是无法明确宫颈病变中感染的HPV型别。导流杂交技术是一种结合低密度基因芯片与导流杂交的新型检测技术(简称 HybriMax)，可进行 21 种 HPV 型别(6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、 58、59、66、68、CP8304)的检测。导流杂交的技术原理为将探针固定于纤维膜上，使目标 分子在电流的引导下穿过固定有探针的薄膜并与互补探针相结合，形成复合物而被固定下 来。而非目标分子不能被结合固定而穿过薄膜被洗去。因此，导流杂交加速了互补分子之间 的相互作用，将杂交时间从几个小时降低至十几分钟，比传统杂交法省时几百倍。而21种 型别探针共同固定于同一张膜条上，检测结果可以通过肉眼或专用软件获得，阳性点为清 晰可见的蓝紫色圆点，根据膜条HPV型别分布图，判断阳性点为何种型别，结果直观易判。 一台机器每次可检测15个标本，方便易行。因此，目前国内也有医院采用这一方法。虽然 有报道表明HybriMax检测诊断与HC-II对13种高危型HPV的检测结果总符合率可达90% 左右[9、10]，但是实际应用中还有较多问题，如我们发现在使用HybriMax检测临床样本时 发现检测结果重复性较差即同一标本在不同检测人员的操作下、或者不同时间再次检测 时会出现不同结果。如我们曾经检测过凯普导流杂交实验检测HPV的重复率(对于49例 的临床样本DNA进行重复检测)，结果发现两次结果的符合例数仅为30例，即重复试验的符 合率为30/49X100%= 61%。这样的结果将不仅会对临床诊断造成影响，而且会影响临 床医生对于宫颈癌可疑患者的跟踪诊断，从而导致误诊或漏诊。我们通过大量的试验研究 发现其原因可能与下列因素有关1、杂交仪的使用与保养如杂交仪必须严格保养、隔离 条必须严格定时更换，如不及时更换可导致泄漏而造成结果的不准确；2、操作较复杂，需经 PCR及杂交两个阶段，一则因需时较长易产生误差，而则因PCR较容易受到污染而产生假阳 性；3、虽然能够分型，但是不能相对定量，只是定性和分型。然而HPV感染的定量非常重要 (如前述)。因此，这种方法也有待改进。用于HPV检测的主要方法所存在的缺陷，至今，尚未见对高危型HPV型别定量检测 的报道。

发明内容
为了解决现有技术中上述的问题，本发明提供一种本专利报道了一种即能够简单 快速的检测高危型HPV感染、又能够报告HPV感染相对定量的方法，以及用于该方法的试剂 盒，该方法可以从而大大提高高危型HPV感染的检出率。本发明的荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方法包括如下步骤A)根据待检测的HPV基因的特异性核酸序列分别合成13对引物，上下游引物之间 相距50 200个碱基；B)并根据各型HPV基因的特异性核酸序列中位于两个引物之间的序列分别设计、 合成Taqman荧光探针；C)使用步骤A)中的引物和步骤B)中的荧光探针荧光反应体系，其中镁离子的浓 度为1 10mM，Taq聚合酶0. 1 5U，各种引物及探针浓度为10 500nM ；D)从待测临床标本中提取DNA，取适量加入步骤C)中的反应体系中，经离心混合后将反应管放入实时定量PCR反应仪，进行20 50次循环扩增反应，反应结束后测定反应 管中的荧光增值；E)同时用系列阳性和阴性模板也进行D)的核酸提取反应，测得各自相应的代表 荧光增值的循环数(Ct值)，根据Ct值算出目的基因相对含量(算法详见后述)，并将其相 对于阳性模板的初始核酸量做图，制作标准曲线；F)用上述步骤中获得的各样品Ct值计算得出的目的基因的相对含量即可在标准 曲线上查出相应的样品中的核酸起始拷贝数。其中步骤A)中所述的两个引物之前相距73 104个碱基。其中步骤D)中所述的PCR反应优选进行30 50个循环。其中步骤D)中所述的PCR反应更优选进行35 45个循环。此种用于荧光定量PCR定性检测高危型HPV方法的试剂盒，它包括荧光PCR反应 液，阳性摸板，阴性摸板以及根据待测核酸的特异性核酸序列设计的PCR引物和荧光引物， 该荧光PCR反应液中镁离子的浓度为1 10mM，Taq聚合酶0. 1 5U，各种引物及探针浓 度为10 500nM。所述的待测核酸分别为HPV16，HPV18, HPV31，HPV33，HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV67，及内参照基因 HMBS。所述的待测核酸为HPV16 ；所述的特异性核酸序列为AGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACC 上游弓丨物AGCTCAGAGGAGGAGGATGAA下游引物GGTTACAATATTGTAATGGGCTC所述的荧光探针的序列为CCAGCTGGACAAGCAGAACCGG所述的待测核酸为HPV18 ；所述的特异性核酸序列为 CATTTTGTGAACAGGCAGAGCTAGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATGCGCAGGAGGTCCACAATGATGCACAAGT上游引物CATTTTGTGAACAGGCAGAGC下游引物ACTTGTGCATCATTGTGGACC所述的荧光探针的序列为AGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATG所述的待测核酸为HPV31 ；所述的特异性核酸序列为ACGATTCCACAACATAGGAGGAAGGTGGACAGGACGTTGCATAGCATGTTGGAGAAGACCTCGTACTGAAACCCAAGTGTA上游弓丨物ACGATTCCACAACATAGGAGGA
下游引物TACACTTGGGTTTCAGTACGAGGT所述的荧光探针的序列为CTCCAACATGCTATGCAACGTCC所述的待测核酸为HPV33 ；所述的特异性核酸序列为
6
CGTCGCAGGCGTAAACGTTTTCCATATTTTTTTACAGATGTCCGTGTGGCGGCCTAGTGAGGCCACAGTGTACCTGCCTCCTGT上游引物CGTCGCAGGCGTAAACG下游弓丨物ACAGGAGGCAGGTACAC所述的荧光探针的序列为AGATGTCCGTGTGGCGGCCTAG所述的待测核酸为HPV35 ；所述的特异性核酸序列为GCCTGCTCCGTGGGCACCACAGAAACCCAGAAGACAAATCACAAACGACTTCGAGGGGGTACCGAGCTCCCCTACAACCCCACCAAGCGAGTGCGACTCAGTGC上游引物GCCTGCTCCGTGGGC下游引物GCACTGAGTCGCACTCGC所述的荧光探针的序列为AGAAGACAAATCACAAACGACTTCGAGGG所述的待测核酸为HPV39 ；所述的特异性核酸序列为CGAGCAATTAGGAGAGTCAGAGGATGAAATAGATGAACCCGACCATGCAGTTAATCACCAACATCAACTACTAGCCAGACGGGATGAACCACAGCGTCACACA上游引物CGAGCAATTAGGAGAGTCAGAGG下游引物TGTGTGACGCTGTGGTTCAT所述的荧光探针的序列为AACCCGACCATGCAGTTAATCACCAAC所述的待测核酸为HPV45 ；所述的特异性核酸序列为CCATTTGTGAACAGGCAGAGCAAGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATGCGCAGGAAGTTCAGAATGATGCACAGGTGTTG上游引物CATTTTGTGAACAGGCAGAGC下游引物CAACACCTGTGCATCATTCTGA所述的荧光探针的序列为AGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATG所述的待测核酸为HPV51 ；所述的特异性核酸序列为AAAGCAAAAATTGGTGGACGAAAAAAAAAGGTTCCATGAAATAGCGGGACGTTGGACGGGGCAATGCGCTAATTGCTGGCA上游弓丨物AAAGCAAAAATTGGTGGACGA下游引物TGCCAGCAATTAGCGCATT所述的荧光探针的序列为CATGAAATAGCGGGACGTTGGACG所述的待测核酸为HPV52 ；所述的特异性核酸序列为CGTCGCAGGCGTAAACGTTTTCCATATTTTTTTACAGATGTCCGTGTGGCGGCCTAGTGAGGCCACTGTGTACCTGCCTCCTGT上游引物CGTCGCAGGCGTAAACG 下游弓丨物ACAGGAGGCAGGTACAC 所述的荧光探针的序列为AGATGTCCGTGTGGCGGCCTAG 所述的待测核酸为HPV56 ； 所述的特异性核酸序列为
TGCATTGTGACAGAAAAAGACGATTTCATCTAATAGCACATGGTTGGACCG GGTCATGTTTGGGGTGCTGGAG 上游引物TGCATTGTGACAGAAAAAGACGAT 下游引物CTCCAGCACCCCAAACATG
所述的荧光探针的序列为TCATCTAATAGCACATGGTTGGACCGGG 所述的待测核酸为HPV58 ； 所述的特异性核酸序列为
GCGTCGCAGACGTAAACGTTTTCCATATTTTTTTGCAGATGTCCGTGTGGCG GCCTAGTGAGGCCACTGTGTACCTGCCTCCTGT 上游引物GCGTCGCAGACGTAAACG 下游弓丨物ACAGGAGGCAGGTACAC 所述的荧光探针的序列为AGATGTCCGTGTGGCGGCCTAG 所述的待测核酸为HPV59 ； 所述的特异性核酸序列为
TGTATGGAGAAACATTAGAGGCTGAAACCAAGACACCGTTACATGAGCTGC TGATACGCTGTTATAGATGCCTAAAACCTCTATGTCCA 上游引物TGTATGGAGAAACATTAGAGGCTGAA 下游引物TGGACATAGAGGTTTTAGGCATCTATAA 所述的荧光探针的序列为AGACACCGTTACATGAGCTGCTGATACGC 所述的待测核酸为HPV67 ； 所述的特异性核酸序列为
CGTCGCAGGCGTAAACGGTTTCCATATTTTTTTGCAGATGTCCGTGTGGCGG CCTAGTGAGGCCACTGTGTACCTGCCTCCTGT 上游引物CGTCGCAGGCGTAAACG 下游弓丨物ACAGGAGGCAGGTACAC 所述的荧光探针的序列为AGATGTCCGTGTGGCGGCCTAG 所述的待测核酸为HMBS ； 所述的特异性核酸序列为
GCCTGCAGTTTGAAATCAGTGAGTTTTCTGGAAAGGAGTGGAAGCTAATGG GAAGCCCAGTACCCCGAGAGGAGAGAACACAACATTTCTGGCTTTGCCTAT AGCTAAAGCCCGTCCCG 上游引物GCCTGCAGTTTGAAATCAGTG 下游引物CGGGACGGGCTTTAGCTA
所述的荧光探针的序列为TGGAAGCTAATGGGAAGCCCAGTACC
该方法和试剂盒的有益效果如下1.该方法可简单快速的对HPV感染进行相对定量的检测，与DIG-II检测法检测结 果的符合率达到94. 32% (κ = 0. 87)；2.该方法测定时由实时定量PCR仪自动检测，并且反应中引入内参照基因及阴 性对照的平行检测用于检测结果的校正，减少了由于操作人员的手法不同而引起的操作误 差；3.样本检测时核酸的扩增反应发生在同一密闭管中，减少了会产生交叉污染的操 作过程。4.该检测方法成本相对较低，可适用于临床普查。5.使用本试剂盒可以准确、快速、特异和方便地检测出临床疾病相关的特异性核 酸序列。


图1是在HPV的病毒拷贝数在50-0. 005ng的范围内，本法的循环数与模板量呈线 性的反相关关系；图2是Realtime检测法与DIG-II检测法的拟合曲线图；图3是Realtime检测法与DIG-II检测法所检出的阳性例数及阴性例数的比较；图4是Realtime检测法与凯普检测法检测HPV的阳性例数(positive)与阴性例 数(Negative)比较；图5是Realtime检测法与DIG-II及凯普检测法检测HPV的阳性符合率(Positive coincidence rate) > # ^ (Negative coincidence rate) R^W n·^· (Totle coincidence rate)比较；图6是定量加入Siha细胞数后内参循环数及HPV循环数。
具体实施例方式实施例1材料与方法(一)、实验条件1、高危型HPV引物与探针序列13型HPV高危型的引物与探针序列见表1。所合 成的Taqman探针已可以同时检测13型HPV型别，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、 58、59、67等。所扩增的区域主要集中在E区和Ll区、扩增的片断长度在73_104bp (表1)。2、引物合成与探针标记所有引物与探针均在英俊公司合成。HPV探针的5’端标 记荧光为FAM，3’端标记荧光为TAMRA。内参(HMBS)探针的5’端标记为HEX，3’端标记的 荧光为iTAMRA。3、扩增仪器ABI-7500。4、试剂所用Premix Ex Taq购自Takara公司(见下)。5、反应体系20ul。样本DNA:6. 8ulProbe mixture lOul/reaction
9
Primers(mixed) :HPV :0·08ul/primers or pb内参:0. 096ul/reactionH20 :0. 512ul (无菌标准去离子水，电阻彡18. 2 Ω)PCR mixture IOul (buffer, enzyme, Mg++, dNTP)(Real time PCRMix, Takara ^ 司)。6、反应条件95度10秒，95度5秒，57度45秒，40个循环。( 二)、检测灵敏度以HPV16和18型为代表测定了本方法的检测灵敏度为 0.005ng(5pg)/样本。也即在HPV的病毒拷贝数在50_0. 005ng的范围内，本法的循环数与 模板量呈线性的反相关关系(图1)。(三)、样本中高危型HPV的相对定量由于HPV感染的量与临床上是否发展为宫 颈癌有着极为密切的关系。关于定量方法建立中内参基因的引入本实验中，引入的内参基 因为HMBS (羟甲基胆素合成酶)。HMBS为一低丰度表达的内参照，当和HPV的各型引物探针 混至一管时有可能出现竞争性结合，因此，内参与目的基因引物探针的混合比例至关重要。 本实验中经过大量混合比例的实验，发现20ul体系中，当HPV的引物探针为0. 08ul, HMBS 的引物探针为0. 096ul时，对于各型HPV及HMBS的扩增相对平衡。1.感染高危型HPV相对含量的计算相对感染量，用循环数的2 ACt次幂表示当 样本中细胞数相同时所含HPV的相对量。其计算公式为VL = 2Δε = 2_(ctHPV_ctHMBS)注CtHPV为Realtime实验中HPV的循环数，CtHMBS为HMBS的循环数。2.拟合曲线及临界值的确定为了确定阴性标本与阳性标本的临界值，将所有 样本(134例)分别用DigII检测法所得比值及Realtime检测法所得2 Δ Ct次幂做拟合 曲线图(图2)。于拟合曲线可得公式1 :y = 0.45 He0 0509x (R2 = 0. 9937)，公式2 :y = 0. 5738e0 0597x(R2 = 0. 9142)。由于在HC-II检测法中，当样品所测结果大于等于1时，被认 为HPV感染阳性，而结果小于1时，被认为HPV感染阴性，结合上述拟合曲线公式1、2，可以 得出，在Realtime-PCR检测法中，当样本值大于等于1. 46时，可被认为HPV感染阳性，而小 于1.46时，认为HPV感染阴性。3.验证临界值另收集60例病人样本，同时使用HC-II法及Realtime-PCR法进 行检测，比较其检测结果。4.与国内现在普遍使用的检测HPV方法比较a)与DIG-II检测方法对比已做平行标本194例，其中DIG-II阳性例数150例， 而本法检出为157例阳性；阴性样本44例，本法检测判断为阴性样本35例(图3)(另外有 2例样本由于检测HMBS循环数大于40，被认为样本细胞数不够，建议重新采集样本。)b)与导流杂交法(凯普检测)法相比已做的平行标本81例，其中凯普阳性为60 例，而本法检出为48例阳性；阴性样本21例，本法检测判断为阴性样本21例(图4)。c)检出率比较根据上述结果，分别计算出本法与国内现在普遍使用的检测HPV 方法平行比较检出率与DIG-II方法阳性符合率为98. 67% (148/150)，阴性符合率为 79. 54% (35/44)，总符合率为94. 32% (183/194)。与导流杂交法阳性符合率为80%，阴 性符合率为100% (图5)。5. Realtime-PCR扩增效率检测及相对感染病毒拷贝数的估算为了进一步研究能够相对检测感染样本中HPV拷贝数的方法，我们采用Siha细胞(HPV16型的宿主细胞) 进行了探索。本法中，取不同量Siha细胞(每细胞含有1到2个HPV16型病毒基因拷贝) 用同前所述的方法作Realtime-PCR检测，如图6所示，随着细胞数的增加，样本内参及HPV 的循环数逐渐减少，因此根据循环数及其2 Δ Ct次幂即可估算出样本被感染细胞数。荧光PCR检测试剂盒临床应用总结本试剂盒临床检测194例，检出阳性样本157例，阴性样本35例，2例细胞数过少 建议重新采集标本，与DIG-II检出符合率94. 32%，(κ =0.87)；并且该方法操作简便易 行，具有较为准确的检出率，且成本较低，适于临床普查。表1是高危型HPV引物与探针序列 * :5，端HEX，3，TAMRA以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
权利要求
一种荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方法，该方法依次包括如下步骤A)根据待检测的HPV基因的特异性核酸序列分别合成13对引物，上下游引物之间相距50～200个碱基；B)并根据各型HPV基因的特异性核酸序列中位于两个引物之间的序列分别设计、合成Taqman荧光探针；、C)使用步骤A)中的引物和步骤B)中的荧光探针荧光反应体系，其中镁离子的浓度为1～10mM，Taq聚合酶0.1～5U，各种引物及探针浓度为10～500nM；D)从待测临床标本中提取DNA，取适量加入步骤C)中的反应体系中，经离心混合后将反应管放入实时定量PCR反应仪，进行20～50次循环扩增反应，反应结束后测定反应管中的荧光增值；E)同时用系列阳性和阴性模板也进行D)的核酸提取反应，测得各自相应的代表荧光增值的循环数(Ct值)，根据Ct值算出目的基因相对含量(算法详见后述)，并将其相对于阳性模板的初始核酸量做图，制作标准曲线；F)用上述步骤中获得的各样品Ct值计算得出的目的基因的相对含量即可在标准曲线上查出相应的样品中的核酸起始拷贝数。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤A)中所述的两个引物之前相距73 104个碱基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤D)中所述的PCR反应进行30 50个 循环。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤D)中所述的PCR反应进行35 45个 循环。
5.一种用于荧光定量PCR定性检测高危型HPV方法的试剂盒，它包括焚光PCR反应 液，阳性模板，阴性模板以及根据待测核酸的特异性核酸序列设计的PCR引物和荧光引物， 该荧光PCR反应液中镁离子的浓度为1 10mM，Taq聚合酶0. 1 5 (0. 625) U。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测核酸分别为HPV16，HPV18， HPV31，HPV33，HPV35, HPV39, HPV45, HPV51，HPV52，HPV56, HPV58, HPV59, HPV67，及内参照基 因 HMBS。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性核酸序列在NCBI中的序 列编号分别为HPV16 NC001526, HPV 18 NC001357, HPV31 J04353, HPV33 M12732, HPV35 M74117,HPV39 M62849,HPV45 X74479,HPV51 M62877,HPV52 X74481,HPV56 X74483,HPV58 D90400, HPV59 X77858, HPV67 D21208，HMBS M95623. 1。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的引物序列分别为HPV16 上游弓丨物AGCTCAGAGGAGGAGGATGAA下游引物GGTTACAATATTGTAATGGGCTCHPV18/45 上游引物(18/45) CATTTTGTGAACAGGCAGAGC下游引物 1(18) :ACTTGTGCATCATTGTGGACC下游引物 2(45) CAACACCTGTGCATCATTCTGAHPV31 上游引物ACGATTCCACAACATAGGAGGA 下游引物TACACTTGGGTTTCAGTACGAGGT HPV33/52/58/67 上游引物 1 (33/52/67) :CGTCGCAGGCGTAAACG 上游引物 2(58) :GCGTCGCAGACGTAAACG 下游引物(33/52/58/67) :ACAGGAGGCAGGTACAC HPV35 上游引物GCCTGCTCCGTGGGC 下游弓丨物GCACTGAGTCGCACTCGC HPV39 上游引物CGAGCAATTAGGAGAGTCAGAGG 下游引物TGTGTGACGCTGTGGTTCAT HPV51 上游引物AAAGCAAAAATTGGTGGACGA 下游引物TGCCAGCAATTAGCGCATT HPV56 上游引物TGCATTGTGACAGAAAAAGACGAT 下游引物CTCCAGCACCCCAAACATG HPV59 上游引物TGTATGGAGAAACATTAGAGGCTGAA 下游引物TGGACATAGAGGTTTTAGGCATCTATAA HMBS 上游弓丨物GCCTGCAGTTTGAAATCAGTG 下游引物CGGGACGGGCTTTAGCTA。
9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的荧光探针的序列分别为HPV16 探针CCAGCTGGACAAGCAGAACCGGHPV18 探针AGAGACAGCACAGGCATTGTTCCATGHPV31 探针CTCCAACATGCTATGCAACGTCCHPV33/52/58/67 探针AGATGTCCGTGTGGCGGCCTAGHPV35 探针CAGAAGACAAATCACAAACGACTTCGAGGGHPV39 探针AACCCGACCATGCAGTTAATCACCAACHPV51 探针CATGAAATAGCGGGACGTTGGACGHPV56 探针TCATCTAATAGCACATGGTTGGACCGGGHPV59 探针AGACACCGTTACATGAGCTGCTGATACGCHMBS 探针TGGAAGCTAATGGGAAGCCCAGTACC。
全文摘要
本发明公开了一种荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方法，该方法的荧光PCR反应体系中镁离子的浓度为1～10mM，Taq聚合酶0.1～5U，各种引物及探针浓度为100nM；在PCR反应前测定反应前荧光值；在PCR反应后测得反应后荧光值；计算出差值。同时用公式VL＝2-(CtHPV-CtHMBS)算出相对病毒载量值，并根据相对病毒载量值判定是否HPV感染阳性。该方法可简单快速的对HPV感染进行相对定量的检测。本发明还提供了一种用于该方法的试剂盒，使用本试剂盒可以准确、快速、特异和方便地检测出临床疾病相关的特异性核酸序列。
文档编号G01N21/64GK101886137SQ20091005113
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月13日 优先权日2009年5月13日
发明者何昕, 姜惠民, 张艳, 李宁丽, 管爱民, 蔡佩民, 陈勇, 顾关林, 马式薇 申请人:上海多纳美企业发展有限公司