专利名称：一种hiv-1融合抑制剂体外筛选方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说是涉及一种HIV-l融合抑制剂体外 筛选方法。
背景技术：
目前HIV-1融合抑制剂体外筛选方法主要有以下两大类
1、 基于gp41N-螺旋与C-螺旋相互作用的筛选方法
位于HIV-1包膜表面的跨膜蛋白gp41是三聚体蛋白，gp41的三段C-螺 旋以反向平行的方式堆积在N-螺旋三聚体表面的疏水凹槽，形成稳定的六螺 旋束结构，将病毒包膜与宿主细胞膜拉近，导致膜融合的发生。抑制§ 411^-螺旋与C-螺旋相互作用的化合物会抑制六螺旋束结构的形成，从而抑制膜融 合的发生。基于gp41 N-螺旋和C-螺旋相互作用的筛选方法主要存在靶位不单 一、标记物影响N-螺旋/C-螺旋构象、检测时间长等缺点。
2、 基于gp41五螺旋蛋白与C-螺旋相互作用的筛选方法
Root等人(Root MJ, Kay MS， Kim PS. Protein design of an HIV國l國l entry inhibitor. Science, 2001， 291 (5505): 884-888.)报道了根据蛋白质工程原理设计 的由3个N-螺旋与2个C-螺旋交错相连而成的五螺旋蛋白。五螺旋蛋白可通 过其表面暴露出来的疏水凹槽与C-螺旋结合形成稳定的六螺旋束结构，与五 螺旋蛋白表面疏水凹槽结合的化合物可抑制五螺旋蛋白与C-螺旋的结合，具 有潜在的抗HIV-1融合活性。五螺旋蛋白可以通过基因工程的手段大量获得， 其成本大大低于化学合成方法。Frey等人(Frey Q Rits-Volloch， S， Zhang， XQ, et al. Small molecules that bind the inner core of gp41 and inhibit HIV國l envelope-mediated fbsion. Proceedings of the National Academy of Sciences, U. S. A., 2006， 103 (38): 13938-13943.)报道了基于五螺旋蛋白与荧光素标记C-螺旋 的相互作用而建立的极化荧光融合抑制剂筛选方法，即将五螺旋蛋白与待测 化合物样品在室温孵育1小时后加入荧光素标记的C-螺旋，继续室温孵育1.5 小时，用高通量药物筛选分析仪测定荧光极化指标，计算待测化合物样品的 抑制率。这种方法的缺点是对五螺旋蛋白的纯度要求较高、检测时间较长、所需检测仪器昂贵。
发明内容
本发明的目的是提供一种步骤简单、快速便捷且成本低廉的HIV-l融合
抑制剂体外筛选方法。
本发明所提供的一种HIV-l融合抑制剂体外筛选方法，包括以下步骤
(1) HIV-l gp41五螺旋蛋白的包被 将可吸附组氨酸标签的磁珠与带有组氨酸标签的HIV-l gp41五螺旋蛋白
粗提物于微孔板上在20-4(TC下孵育10-20分钟，于磁板上沉淀后甩去孔中液 体，洗板后待用；
(2) 待测化合物样品的制备 室温下将待测化合物样品用二甲亚砜配制成不同浓度的溶液，充分振荡
溶解后备用；
(3) 待测化合物样品的筛选
微孔板设阴性对照3孔，每孔分别加入2pl二甲亚砜，设阳性对照3孑L， 包被时不加五螺旋蛋白粗提物，其他孔中每孔分别加入2^1不同浓度的待测化 合物样品，之后所有孔均分别加入98pl报告基团标记C-螺旋溶液，振荡器充 分混匀后，在15-4(TC下孵育10分钟，甩去孔内液体，洗板后用荧光分析仪 检测报告基团信号，计算待测样品的抑制率。
按照以下公式计算待测样品的抑制率
阴性对照孔信号值一待测样品孔信号值 "+阴性对照孔信号值一 阳性对照孔信号值
本发明方法具有以下有益效果
本发明用可吸附组氨酸标签的磁珠对带有组氨酸标签的fflV-l gp41五螺 旋蛋白粗提物于微孔板上进行选择性包被，将原本独立进行的五螺旋蛋白纯 化与融合抑制剂筛选两个过程有机地整合起来，以达到简化步骤、縮短时间、
降低成本的目的。现有方法中五螺旋蛋白纯化与融合抑制剂筛选共需20小时 左右，而本发明方法可将这两个过程縮短至1小时以内，同时大大降低了筛选成本。
图1是HIV-1融合抑制剂N-(4-羧基-3-羟基)苯-2， 5-二甲基吡咯的抑制曲 线(样品孵育温度15'C);
图2是HIV-1融合抑制剂N-(4-羧基-3-羟基)苯-2， 5-二甲基吡咯的抑制曲 线(样品孵育温度3(TC);
图3是HIV-1融合抑制剂N-(4-羧基-3-羟萄苯-2， 5-二甲基吡咯的抑制曲 线(样品孵育温度4(TC)。
具体实施例方式
实施例l
将可吸附组氨酸标签的磁珠与带有组氨酸标签的HIV-1 gp41五螺旋蛋白 粗提物在37。C下孵育20分钟，磁板沉淀后甩去孔中液体，洗板后待用；将已 知具有抗HIV-1融合作用的化合物N-(4-羧基-3-羟基)苯-2， 5-二甲基吡咯(简 称NB-2)配制成10mg/ml、 lmg/ml、 100 pg/ml、 10吗/ml的二甲亚砜溶液， 充分振荡溶解后备用；微孔板设阴性对照3孔，每孔分别加入2iil二甲亚砜， 设阳性对照3孔，包被时不加五螺旋蛋白粗提物，其他孔中每孔分别加入2pl 不同浓度的NB-2，之后所有孔均分别加入98^1异硫氰酸荧光素(FITC)标 记C-螺旋溶液，振荡器充分混匀后，在15t:下孵育10分钟，甩去孔内液体， 洗板后用荧光分析仪检测每孔的相对荧光值(RFU)，选激发波长485nm，发 射波长528nm，计算待测样品的抑制率，绘制抑制曲线(见图1)。经计算， NB-2的半数抑制浓度为12.4 pg/ml。
实施例2
将可吸附组氨酸标签的磁珠与带有组氨酸标签的HIV-1 gp41五螺旋蛋白 粗提物在37-C下孵育20分钟，磁板沉淀后甩去孔中液体，洗板后待用；将已 知具有抗HIV-1融合作用的化合物NB-2配制成10mg/ml、 lmg/ml、 100^ig/ml、 1(^g/ml的二甲亚砜溶液，充分振荡溶解后备用；微孔板设阴性对照3孔，每 孔分别加入2pl二甲亚砜，设阳性对照3孔，包被时不加五螺旋蛋白粗提物， 其他孔中每孔分别加入2^1不同浓度的NB-2，之后所有孔均分别加入98^1FITC标记C-螺旋溶液，振荡器充分混匀后，在3(TC下孵育IO分钟，甩去孔 内液体，洗板后用荧光酶标仪检测每孔的相对荧光值(RFU)，选激发波长 485nm，发射波长528nm，计算待测样品的抑制率，绘制抑制曲线(见图2)。 经计算，NB-2的半数抑制浓度为9.0 pg/ml。 实施例3
将可吸附组氨酸标签的磁珠与带有组氨酸标签的fflV-l gp41五螺旋蛋白 粗提物在37"C下孵育20分钟，磁板沉淀后甩去孔中液体，洗板后待用；将已 知具有抗HIV-1融合作用的化合物NB-2配制成10mg/ml、 lmg/ml、 100pg/ml、 1(Hig/ml的二甲亚砜溶液，充分振荡溶解后备用；微孔板设阴性对照3孔，每 孔分别加入2pl二甲亚砜；设阳性对照3孔，包被时不加五螺旋蛋白粗提物， 其他孔中每孔分别加入2pl不同浓度的NB-2，之后所有孔均分别加入98j_il FITC标记C-螺旋溶液，振荡器充分混匀后，在4(TC下孵育10分钟，甩去孔 内液体，洗板后用荧光酶标仪检测每孔的相对荧光值(RFU)，选激发波长 485nm，发射波长528nm，计算待测样品的抑制率，绘制抑制曲线(见图3)。 经计算，NB-2的半数抑制浓度为8.4 pg/ml。
权利要求
1、一种HIV-1融合抑制剂体外筛选方法，其特征在于包括以下步骤(1)HIV-1gp41五螺旋蛋白的包被将可吸附组氨酸标签的磁珠与带有组氨酸标签的HIV-1gp41五螺旋蛋白粗提物于微孔板上在20-40℃下孵育10-20分钟，于磁板上沉淀后甩去孔中液体，洗板后待用；(2)待测化合物样品的制备室温下将待测化合物样品用二甲亚砜配制成不同浓度的溶液，充分振荡溶解后备用；(3)待测化合物样品的筛选微孔板设阴性对照3孔，每孔分别加入2μl二甲亚砜，设阳性对照3孔，包被时不加五螺旋蛋白粗提物，其他孔中每孔分别加入2μl不同浓度的待测化合物样品，之后所有孔均分别加入98μl报告基团标记C-螺旋溶液，振荡器充分混匀后，在15-40℃下孵育10分钟，甩去孔内液体，洗板后用荧光分析仪检测报告基团信号，计算待测样品的抑制率。
全文摘要
本发明公开了一种HIV-1融合抑制剂体外筛选方法，属生物技术领域。该方法是用可吸附组氨酸标签的磁珠对带有组氨酸标签的HIV-1 gp41五螺旋蛋白粗提物于微孔板上进行包被，微孔板设阴性对照3孔，每孔分别加入2μl二甲亚砜，设阳性对照3孔，包被时不加五螺旋蛋白粗提物，其他孔中每孔分别加入2μl不同浓度的待测化合物样品，之后所有孔均分别加入98μl报告基团标记C-螺旋溶液，在15-40℃下孵育10分钟，甩去孔内液体，洗板后用荧光分析仪检测报告基团信号，计算待测样品的抑制率。本发明方法步骤简单、快速便捷且成本低廉。
文档编号G01N21/64GK101498722SQ20091007951
公开日2009年8月5日 申请日期2009年3月6日 优先权日2009年3月6日
发明者何红秋, 斌 刘, 张小轶, 王存新, 谭建军, 陈慰祖 申请人:北京工业大学