专利名称：反相高效液相色谱法分离多黏菌素e甲磺酸钠及其类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种色谱分离分析方法，具体是一种分离分析多黏菌素E甲磺酸钠及 其异构体或类似物的高效液相色谱(HPLC)方法，属于药物分析领域。
背景技术：
很多严重的感染是由具有很强耐药性的绿脓假单胞菌引起的，而多黏菌素类药物 对该类感染的致病菌具有较好的抑制效果。自从硫酸多黏菌素类化合物于1947年从不同 种类的多黏芽孢杆菌提取得到，就被应用于体外抗菌实验中。但由于其毒副作用较大，应用 并未得到普遍推广。而以其作为原料合成的多黏菌素E甲磺酸钠则较其毒性低，且抑菌效 果不减。而目前，国内尚无对该类药物的分析方法，因此，对该类药物的分析研究成为当前 一项具有重要意义的工作。发明内容
本发明的目的在于填补目前国内对于多黏菌素E甲磺酸钠及其异构体或类似物 的分离及分析方法的空白，提供一种能准确的分离分析多黏菌素E甲磺酸钠及其异构体或 类似物的高效液相色谱方法，从而对该类药物进行分离分析研究。
本发明方法的特征是液相色谱条件为以烷基键合硅胶填充柱为固定相，流动相 为有机溶剂和酸的水溶液组成的混合溶剂。
当以烷基键合硅胶填充柱为固定相时，优化条件为C18烷基键合硅胶填充柱。更 优为Optimapak C18烷基键合硅胶填充柱。
当流动相为有机溶剂和酸的水溶液组成的混合溶剂时，有机溶剂可以为乙腈、甲 醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、四氢呋喃、丙酮，或上述两种及两种以上有机溶剂的混合物等，酸 可以为盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、烷基磺酸、苯磺酸、取代苯磺酸、五氟丙酸、 七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、十五氟辛酸或上述两种及两种以上酸的混 合物等，混合溶剂组成的体积比为有机溶剂酸的水溶液3 97 80 20。优化条件为 流动相中有机溶剂和酸的水溶液组成的混合溶剂体积比为15 85 50 50。更优化条 件为在10 20分钟内，混合溶剂组成的体积比(乙腈三氟乙酸水溶液)在15 85 60 40内线性变化，其中三氟乙酸的体积浓度为0.05% 1%。等度洗脱的优化条件为混 合溶剂中乙腈三氟乙酸水溶液体积比为20 80 45 55。
下面通过以下的实验研究对本发明做进一步说明。
1.分离目标
分离目标为合成多黏菌素E甲磺酸盐过程中所产生的多黏菌素E甲磺酸盐及其类 似物，多肽硫酸盐结构式见附
图1，多黏菌素E甲磺酸盐的结构式见附图2。
2.多黏菌素E甲磺酸钠供试品溶液制备
多黏菌素E甲磺酸钠极易溶于水，因此确定了标准品的制备首先选用水溶解，然 后以适量的乙腈定容。优选流动相来溶解标准品。
3.高效液相色谱条件
(1)色谱柱选择确定
选用烷基键合硅胶固定相为分离介质进行试验，比较了 Agela公司C18、C8、C4烷 基键合硅胶填料柱，Agilent公司C18、C8、C4烷基键合硅胶填料柱，Waters公司C18、C8、 C4烷基键合硅胶填料柱，Shimadzu公司C18、C8、C4烷基键合硅胶填料柱，Optimapak公司 C18、C8、C4烷基键合硅胶柱等。确定了 C18柱有较好的分离效果，以Optimapak公司C18烷 基键合硅胶填充柱(150X4. 6mm i. d，5 μ m，pH范围2. 0 8. 0)为优，因此选用Optimapak 公司C18柱。
(2)检测方法确定
多黏菌素E甲磺酸钠具有紫外吸收，因此可用紫外检测器检测。样品分别溶于水、 该方法采用的流动相来测定其紫外光谱，数据见表一。对比这两个波长检测的HPLC谱图， 以波长214nm波长图谱的吸收更明显，因此确定用紫外检测法波长选用212 216nm。此 外，还可用蒸发光散射检测器来检测。
表一多黏菌素E甲磺酸钠紫外光谱数据
权利要求
1.一种分离多黏菌素E甲磺酸钠及其异构体或类似物的高效液相分析方法，其特征是 以烷基键合硅胶填充柱为固定相，以有机溶剂和水组成的混合溶剂为流动相，进行等度或 梯度洗脱，用紫外检测器或蒸发光散射检测器进行检测。
2.如权利要求1所说高效液相色谱方法，其特征是利用烷基键合硅胶填充柱为固定 相，优化条件为以已知的各类型商品化碳18烷基键合硅胶填料为固定相，优化的固定相填 料粒径为1. 5 10 μ m，更优为的optimapak碳18烷基键合硅胶填料。分析柱柱长为3 50cm，更为优化的柱长为15 25cm。
3.如权利要求1所说高效液相色谱方法，其特征是有机溶剂和酸的水溶液组成的混合 溶剂，其中有机溶剂可以为乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、四氢呋喃、丙酮，或上述两种 及两种以上有机溶剂的混合物；酸可以为盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、烷基磺 酸、苯磺酸、取代苯磺酸、五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、十五氟 辛酸或上述两种及两种以上酸的混合物。
4.如权利要求1所说高效液相色谱方法，其特征在于流动相所用水为脱盐水，流动相 经0. 45 μ m的滤膜过滤。所用高效液相色谱的操作条件为色谱柱=Optimapak碳18烷基 键合硅胶填充柱[(150 250) X (2. 1 4. 6)謹i. d，2 10 μ m]，流速为0. 2 1. Oml/ min，检测波长为205 225nm，PH为1. 0 10. 0，温度为0 60°C。更优化为色谱柱 optimapak碳18烷基键合硅胶填充柱[(150 250) X O. 1 4. 6)] mm i. d，2 5μπι)，流 速为0. 8ml/min，检测波长为:214nm, PH为1. 5 8，温度为常温。
5.如权利要求1所说高效液相色谱方法，其特征为梯度洗脱条件为梯度变化时间为 5 80分钟，混合溶剂组成的体积比为有机溶剂酸水溶液3 97 80 20 ；线性洗脱 条件为有机溶剂酸水溶液15 85 50 50。混合溶剂中酸的质量浓度为0.01% 5%。更为优化的洗脱条件为梯度变化时间为10 20分钟，混合溶剂组成的体积比为乙 腈三氟乙酸水溶液15 85 60 40，三氟乙酸的浓度为0.05% 1%。
6.如权利要求3所说高效液相色谱方法，其特征为在上述的混合溶剂中也可以添加表 面活性剂，如二乙胺、三乙胺、季铵盐、磺酸盐等。
全文摘要
本发明公开了一种利用烷基键合硅胶填充柱成功分离及分析多黏菌素E甲磺酸钠及其异构体或类似物的方法。本发明方法的特征是液相色谱条件为以烷基键合硅胶填充柱为固定相，流动相为有机溶剂和酸的水溶液组成的混合溶剂。其中以Optimapak公司的C18烷基键合硅胶填充柱为固定相，乙睛与0.05％三氟乙酸水溶液梯度(体积比20∶80～50∶50)洗脱时，达到了好的分离效果。
文档编号G01N30/02GK102033111SQ20091017410
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月24日 优先权日2009年9月24日
发明者杨更亮, 杨静, 白立改, 闫宏远, 马正月 申请人:杨更亮