专利名称：用于从生物材料中提取和检测脂溶性组分的方法
用于从生物材料中提取和检测脂溶性组分的方法
技术领域：
本发明涉及分析来自生物材料(尤其是富含脂质的食品)的脂溶性组分(尤其是 染料)、富集所述组分并随后分析的方法。所述方法包括提取和分离步骤和随后的分析步 骤的组合。
本发明还涉及用于进行所述方法的分析试剂盒和分析设备。
根据本发明的方法由多个步骤组成。是关键性的并且表征本发明的必需步骤 为
1.预处理样品，去除脂质。
2.通过特定的溶剂或溶剂混合物将染料提取进提取混合物中。
3.在最终通过眼睛或光学增强设备检测和定量之前，破坏对氧化敏感的成分例 如类胡萝卜素。
本发明的前景是溶解脂溶性组分和生物基质之间的复杂复合物，提供测定食物 和饲料中的物质(在本文下文中也称作组分)的方法的分析试剂盒和用途。
对本发明的检测方法而言，所考虑的脂溶性组分为染料。天然和合成的染料被 用于对不同应用的制品进行。它们的作用是给予某些光学品质特性。可以被染色的生 物材料是蛋黄和蛋制品、鱼和鱼制品、水果和蔬菜汁和/或制剂，以及黄油或其他乳制 品。用于人消耗的生物材料的染色可以通过饲料引入或在加工中引入。
对食物和饲料安全性以及对检测有毒物质或伪造物质的提高的要求(特别是在 国际商品贸易中)需要快速、灵敏和可靠的分析，优选地尽可能接近所述制品。因此， 需要由尽可能少的工作步骤组成和/或具有很低的技术复杂性的方法。在这种情况下， 期望使用下述方法，所述方法可以在一次性分析试剂盒的基础上应用。
在本文上下文中，提供了例如对用苏丹红或其他染料伪造食物和饲料颜色的检 测。
分析生物材料的现代方法通常包括生物材料成分(constituent)以及组分 (component)的分离(separation)、提取、离析(isolation)和/或富集。这些方法步骤在用于分离干扰或伪造结果的物质的定性和定量分析中均是不可或缺的。
WO 2008/031874公开了分析生物材料成分(尤其是类胡萝卜素和维生素)的方 法，其特征是用至少一种提取所述成分的有机溶剂处理生物材料，然后通过分光光度计 分析测量所提取的溶液。
从WO 2008/031874开始，本发明的目的是提供用于从富含脂质的生物材料中提 取天然和合成染料(特别是苏丹染料)的方法，所述方法的选择性足以将物质以相当小的 复杂性从生物材料(例如络合的固体基质)中溶解，并且需要时能够借助于一次性分析试 剂盒简单和快速地应用。
权利要求1中要求保护的方法、权利要求12中要求保护的用途和权利要求13中 要求保护的分析试剂盒实现了该目的。
优选的实施方案描述于从属权利要求中。所有权利要求的措辞通过引用并入本 说明书中。
根据本发明，预处理、提取和任何随后的分离以下述方式组合，所述方式使得 可以检测非常小量的染料。
在本发明的上下文中，“生物材料”表示从植物或动物获得的富含脂质的食物 和饲料，例如蛋、黄油、全脂奶、奶酪、香肠、油。
在所述方法的一个优选的实施方案中，在使用生物材料之前对其进行机械粉碎 和纯化的过程。
更有利的是通过振动手工进行提取，尤其是小心地振动以避免溶血。
根据本发明必须被解决的问题如下
首先，使用WO 2008/031874中所述方法，生物材料的脂质(脂肪)会与染料一 起被提取进有机相中。该脂肪提取会破坏分离，并且检测极限会显著提高。因此，脂肪 的提取应当被减少或者尽可能完全。
一种可能的解决方案可以是寻找特定的水缓冲液/有机溶剂组合，所述组合允 许选择性提取染料而不提取脂肪。这种方式的实验产生分离溶剂体系，允许选择性提取 苏丹(I、II、III、IV)和一些类胡萝卜素，但是几乎不提取脂肪。这类体系的缺点是低 提取效率(5% -10%),这导致测定的不稳定和样品体积的增加。
另一种可能的解决方法可能是在提取前对富含脂肪的材料(例如蛋黄)进行化学 处理，从而将脂肪转化为不可提取的形式或者将其破坏。例如，用水/醇KOH处理会将 脂肪转化为脂肪酸的钾盐和甘油。该溶液的缺点是使用对使用者不友好并有腐蚀性的 强碱溶剂，并且在处理期间需将混合物振动和加热若干小时。
根据本发明，申请人描述了在提取前使用至少一种脂酶来酶促消化脂肪，这会 导致与化学处理相同的结果，但是条件温和安全，并且更快速。
在本发明的上下文中，脂酶是一种酶，其催化来自生物材料的油和脂肪中存在 的甘油三酯底物中的酯键水解，产生甘油单酯和甘油二酯和游离脂肪酸。本发明的脂酶 可进一步能够以高底物特异性降解富含C8到Cw脂肪酸的膳食脂质(例如甘油三酯、脂 肪、油)。
其次，为了测定生物材料中的染料，类胡萝卜素的氧化破坏是必需的。这是 因为染料和类胡萝卜素在例如色谱分离步骤期间的分离表现或光谱特征方面是非常相似 的。
类胡萝卜素是具有共轭双键的多不饱和长链烃，及其衍生物。归因于这样的结 构，它们容易被氧化，例如被空气氧或其他温和的氧化剂例如过氧化物氧化。当双键的 共轭体系被破坏时，吸光度减少，最大吸光度的波长迁移至更短的区域。
观察到的结果是特征性橙黄色的消失。氧化以不同的速度发生，取决于氧化 剂、介质、类胡萝卜素和氧化剂的浓度、可能干扰氧化剂的其他反应性物质的浓度。
相反，染料例如苏丹对氧化过程而言稳定得多。因此，用氧化剂处理样品仅影 响类胡萝卜素而不影响苏丹染料。
作为氧化剂，优选过氧化物。所使用浓度的过氧化物有效地氧化类胡萝卜素而 不氧化苏丹。它们可以以水溶性形式(无机过氧化物，例如压02、Ii2S2O8)或有机物可 溶性的形式(苯甲酰基过氧化物)容易地获得，所述形式使得易于进行实验。
在脂酶处理前，完整蛋黄中类胡萝卜素的氧化由于两个原因而是有问题的。首先，其需要混合进多得多的氧化剂以达到工作浓度。这归因于较大的样品体积和副产物 的过量，所述副产物也经历氧化。第二，必须在添加酶之前去除或中和过量的氧化剂， 否则酶也会同样被破坏。
处理后在提取前氧化也不是可行的。含尿素的缓冲液是稳定过氧化物，其导致 反应减缓，甚至在高过氧化物浓度下导致反应减缓。
最可行的是在提取后进行类胡萝卜素的漂白。在这种情况下可以减少过氧化物 的数量，因为只有类胡萝卜素消耗过氧化物。大部分其他可氧化的物质留在较低的(含 水)缓冲液中。
可以在分离前提取了类胡萝卜素和苏丹染料的有机溶剂中进行氧化(溶剂相漂 白)，或者可以将氧化材料整合进柱材料中，最后通过在分离后例如在TLC placate上的 氧化破坏类胡萝卜素(运行后漂白)。
在本发明的一个优选的实施方案中，将类胡萝卜素漂白与特定的分离步骤组合 是便利的，所述特定的分离步骤在提取之后但是在最终检测之前(柱相漂白)，从而节省 了分析的时间。为此，申请人选择将过氧化物固定在分离吸附剂上。
结果是当分离完成时，微柱上仅出现一条红色的苏丹条带(在样品中存在苏丹 的情况下)。该途径中的检测极限估计为原始蛋黄中0.5-lppm苏丹。
在下文中更详细地描述用于进行所述方法的不同的工艺步骤、分析试剂盒和分 析设备。
L预处理
在样品制备期间添加稀释溶液的目的不仅是稀释样品，而是特别地通过复杂基 质的分散或溶解来为提取做准备。最适地，稀释溶液以下述方式修饰样品，所述方式使 得组分可以更容易地、以目标方式和更完全地被提取。在该过程中，例如蛋白质与稀释 溶液组分的相互作用发挥作用。该作用基于与纯净水相比离子浓度的一般提高，或者基 于特定组分的引入，所述特定组分与基质的组分相互作用。这与二硫键的溶解、强吸湿 性分子对蛋白质的解折叠或与磷酸根的相互作用相关。在本发明步骤的上下文中，酶对 复杂化学结构的溶解也是可能的。
发现用某些盐溶液或缓冲液预处理，尤其是用不同浓度的尿素溶液预处理，导 致生物基质复杂结构的可观改进，从而导致更有效的提取。
水溶性有机组分、洗涤剂、表面活性剂、尤其是非离子表面活性剂或乳化剂的 添加也可以提高提取效率。考虑的添加剂为例如DMSO或DTT。或者，表面活性剂和 洗涤剂可以例如是Pleuronic、Tween。
在生物材料例如蛋、鱼肌肉或肝的情况下，当在0.1到8M、优选地1到8M、特别是2到4M的浓度范围内使用尿素时，仅仅简单的摇动或使用旋转手动混合仪和电动奶 起泡机就足够了。因此，复杂的提取方法可以被可观地改进和简化。
由于脂溶性组分不同的物理化学特性和生物样品基质中巨大的差异，用于溶解 样品基质的溶剂的各自组成对于随后的提取而言极为重要。
另外，可根据使用的生物材料如下描述和/或定义用于样品制备和/或样品稀释 的溶剂
缓冲液，在本发明的上下文中包括缓冲溶液和/或缓冲体系，即一种物质的混合物，添加酸或碱后其pH(氢离子浓度)的改变小于未缓冲体系中的情况。这类缓冲溶 液含有弱酸及其共轭碱(或各自盐)的混合物。
两性电解质和双功能分子也可以发挥缓冲液的作用。决定pH的因素是缓冲对的 比例或质子迁移平衡。
缓冲溶液的例子为乙酸/乙酸盐缓冲液、磷酸缓冲液KH2P04+Na2HP04; Michaelis ‘ s巴比妥-乙酸盐缓冲液；氨缓冲液NH3+H20+NH4C1 ； HEPES (4- (2-羟乙基)-I-哌嗪乙磺酸)PBS缓冲液；MES (2- (N-吗啉代)乙磺酸)。
盐溶液是盐的溶液，所述盐是由带正电的离子(称作阳离子)和带负电的离子 (称作阴离子)组成的。盐的性质可以是有机或无机的。在最窄的含义上，盐表示氯化 钠(NaCl，常见的盐)。在最宽泛的含义上，由阴离子和阳离子组成的所有的化合物被称 作盐(如NaCl)。
当带有分子间相互作用的独立的(稳定)离子存在时，盐被称作络合盐。
除了具有一种阳离子的盐以外，具有两种不同阳离子的盐也是已知的。这些盐 被称作复盐，例如具有一般组成A^MHkSC^hW明矾。一个例子是硫酸铝钾十二水合物 (KAl(SO4)2 · 12H20)。
除了所述无机盐外，还存在有机化合物的盐。这些盐的阴离子来自于有机酸。 在本文中重要的是羧酸例如乙酸的盐，其中许多盐(称作乙酸盐(CH3COCT))是已知的。 例子是柠檬酸钠和柠檬酸钙。
在本发明的上下文中进行复杂基质溶解的有机化合物包括例如尿素。尿素来源 于人和动物的蛋白质和氨基酸代谢。尿素因为其较高的水结合能力而被用作溶解复杂基 质的角质软化剂。将其作为稳定剂添加至食物中。在欧盟，作为名称为E 927b的食物 添加剂，其仅被允许用于不添加糖的口香糖。
根据本发明，用至少一种脂酶处理生物材料的样品，用于在提取前对脂质进行 酶促消化。
在一个具体的实施方案中，添加进样品中的形式的脂酶是定义明确的。定义明 确表示脂酶制剂在蛋白质基础上至少50%纯净。在其他具体的实施方案中，脂酶制剂至 少60%、70%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%或至少95%纯净。可以通过本领 域已知的任何方法(例如通过SDS-PAGE或通过尺寸排除)来测定纯度。
在本发明上下文中，脂酶表示羧酸酯水解酶EC 3.1.1-，其包括例如以下的活 性EC 3丄1.3三酰基甘油脂酶、EC 3丄1.4磷脂酶Al、EC 3丄1.5溶血磷脂酶、EC 3.1.1J6半乳糖脂酶、EC 3.1.1.32磷脂酶Al、EC 3.1.1.73阿魏酸酯酶。EC编号表示来自 NC-IUBMB, Academic Press, SanDiego, California (包括分别在 Eur.J.Biochem.1994， 223，1-5 ； Eur.J.Biochem.1995, 232，1-6 ； Eur.J.Biochem. 1996，237，1-5 ； Eur. J.Biochem.1997, 250，1-6 ；和 Eur.J.Biochem.1999，264，610-650 中的补充)的酶命名 法。该命名法被定期补充和升级；见例如万维网http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/ enzyme/index.html.
在一个优选的实施方案中，本发明的脂酶是胰腺脂酶或Piccantase，或磷脂酶。
2.提取和分离步骤
作为用于提取和需要时随后用于分析的有机溶剂，使用极性质子溶剂，尤其是
在所述方法的又一个优选的实施方案中，使用选自甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙 醇(异丙醇)、丁醇、戊醇、己醇及其混合物的极性质子溶剂。优选地，在本文中使用乙 醇和/或DMSO的混合物。
在所述方法的又一个优选的实施方案中，作为有机溶剂使用至少一种极性非质 子溶剂，尤其是酯，优选地为乙酸乙酯。
有利地，在根据本发明的方法中，除了优选的极性质子溶剂外，也可以使用极 性非质子溶剂。
在本发明的又一个实施方案中，作为极性非质子溶剂使用腈，优选地使用乙腈。
在所述方法的又一个实施方案中，作为极性非质子溶剂使用酮，优选地使用丙酮。
在所述方法的又一个实施方案中，作为极性非质子溶剂使用二甲基亚砜和/或 N, N—二甲基甲酰胺。
在所述方法的又一个实施方案中，作为极性非质子溶剂使用醚，尤其是二乙醚。
优选地，取决于生物材料，使用混合物形式的极性溶剂。
在提取步骤的又一个优选的实施方案中，作为溶剂使用至少一种非极性溶剂， 尤其是烷，优选地使用C5到C12烷。
在提取步骤的又一个优选的实施方案中，作为非极性溶剂使用己烷、庚烷和/ 或辛烷，尤其是使用异辛烷。
在提取步骤的又一个实施方案中，作为非极性溶剂使用芳香族，尤其是使用甲 苯和/或苯。
所述非极性溶剂在根据本发明的方法中发挥提取介质的作用，用于提取所述组 分，尤其是用于提取所述亲脂性组分。
根据本发明，可便利地使用有机溶剂分子的衍生物。溶剂可以是无水、含水、 分支、不分支、环状、非环状、卤化或非卤化的。
在工业上可以从多种方面进行极性或非极性溶剂的区分。例如，可以使用化学 中已知的极性定义或溶剂表现。
另夕卜，在实践中使用根据Snyder 或 KelleHSynder, Principles ofabsorption chromatography, Decker, New York, 1986 ； Keller, Analyticalchemistry, Weinheim, 1998，piige 1%)的极性指数，用于将溶剂或溶剂混合物归类。据此，极性溶剂或溶剂混 合物表示根据Snyder具有4到8、尤其是5到7、优选地5.5到6.5的极性指数的溶剂或溶 剂混合物。极性溶剂例如为水，尤其是水性溶液。极性非质子溶剂为例如丙酮、乙腈、 乙酸乙酯、二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺。极性质子溶剂为例如包含具有1到6个 碳原子的烷基片段的醇，例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇(异丙醇)、丁醇、戊醇或己
非极性溶剂或非极性溶剂混合物表示下述溶剂或溶剂混合物，其与参考溶剂或 参考溶剂混合物相比，具有0.3或更低的极性指数。优选极性指数比参考低0.5，尤其是极性指数比参考低1，优选地比参考低多于2。因此，非极性溶剂或溶剂混合物的极性指 数根据Snyder具有5到1、尤其是4到2、优选地3.5到2.5的数值。60%甲醇/40%二氯 甲烷的溶剂混合物根据Synder具有例如3.1的极性指数。随后考虑的非极性溶剂为例如 卤化的溶剂，例如氯仿、二氯甲烷或四氯化碳。另外，可以提到脂肪族溶剂例如戊烷、 己烷、庚烷或环己烷。另外，可以提到的非极性溶剂为芳香族溶剂例如甲苯或苯。另外 考虑的是醚，例如二乙醚、叔丁基甲基醚或四氢呋喃。
在根据本发明的方法的又一个优选的实施方案中，以溶剂混合物的形式、尤其 是以包含极性和非极性溶剂的溶剂混合物的形式使用提取步骤的溶剂。
优选地，极性和非极性溶剂以1 1的比例、尤其是1 2的比例、优选地 1 10的比例(极性非极性)使用。
该手段的优点是可以产生与生物材料的特性匹配的溶剂混合物。藉此，可以解 决多种分离问题。
在又一个优选的实施方案中，用有机溶剂以1 50的比例、尤其是1 10的比 例、优选地1 3的比例处理生物材料。
根据生物材料的特性和有机溶剂的提取能力，可以便利地选择更大或更小的生 物材料与有机溶剂的比例，并且所述比例尤其取决于随后的分析。优选地，以下述方式 选择所述比例，所述方式考虑组分分析中的检测极限或测定极限。
在又一个实施方案中，在0.5bar和5bar之间、尤其是0.8bar和2bar之间的压强 下进行所述方法。
理论上所述方法可以在期望凝胶形成的温度和/或压强范围中进行。另外，必 须考虑溶剂特性，尤其是熔点、沸点、闪点。根据本发明，所述方法在室温和大气压下 进行。
在所述方法的又一个优选的实施方案中，将生物材料处理10秒到10分钟、尤其 是10秒到5分钟、优选地10秒到3分钟的时间段，用于组分的提取。
优选地，在提取前将样品用稀释缓冲液预处理。稀释比例在1 9 (缓冲液样 品)和100 1之间，尤其是1 1到50 1之间，优选地为10 1。
优选地，在用有机溶剂处理之前将生物材料转移进抗溶剂的环境中。
在又一个实施方案中，作为抗溶剂的环境，使用具有疏水表面的管，尤其是具 有通过硅烷化使其疏水的表面的管。
在又一个实施方案中，使用具有疏水表面的管，尤其是塑料管，尤其是由聚丙 烯制成的塑料管。
有利地，在根据本发明的方法中，可以使用具有疏水表面的管。在玻璃管的情 况下，可以通过将玻璃表面硅烷化，或者通过用氟化氢蚀刻玻璃表面，产生疏水表面。 另外，在根据本发明的方法中，也可以使用塑料管，优选地由聚丙烯制成的塑料管。也 可能使用复合材料用于所述管，尤其是被塑料涂覆的管。优选地，使用具有下述性质的 管，所述性质使得它们适用于分光镜检查。
在本发明的一个优选的实施方案中，在提取之后应用例如通过色谱方法富集和 分离的步骤。小型化的色谱方法是优选的。可以便利地以下述方式选择提取溶剂的组 成，所述方式使得不发生例如醇和有机溶剂的混合和/或完全分离。本文中一种合适的溶剂优选地是作为非质子双极溶剂的DMSO(二甲基亚砜)和正己烷或异辛烷。在这种 情况下，也可以向加工缓冲液中添加非极性溶剂。因此，提取溶剂可以在随后的色谱富 集和分离中等同地被用作流动溶剂。在又一个实施方案中，在5°C到60°C范围内、尤其 是10°C到40°C范围内的温度下进行所述方法。
在所述优选的实施方案中，通过与用于提取的溶剂或溶剂混合物相同的溶剂或 溶剂混合物，在固定相上进行富集和分离。
在所述优选的实施方案中，要被分离和检查的亲脂性组分在提取步骤后已经位 于移动相中。在色谱体系中通过固定相进行富集和/或分离。考虑的色谱体系是薄层色 谱或柱色谱体系。考虑的固定相是硅胶、纤维素、环糊精、氧化铝、弗洛里西(florisil) 和由于其物理化学特性而适用于各种组分的其他物质。移动相和固定相的选择取决于分 离问题。另外，可以通过定向的化学修饰对材料的表面特性进行修饰。作为脂质色谱法 的一个例子，可以提到的是用银离子对硅胶进行表面处理。然而，其他方法也可以是合 适的。
除了使用均一的固定相外，也可以将固定相组合。该组合可以通过混合多种不 同相进行，或者通过填充柱的逐层结构来进行。通过逐层结构可以实现多种分离和富集 效果。
根据本发明，类胡萝卜素的氧化破坏是必需的，其中作为氧化剂优选过氧化 物。
可以通过重力或者通过靠低压引起移动相移动的其他方法产生压强增加，用于 移动相的流动。
在所述优选的实施方案中，通过将装有固定相的小型化柱的一个开口放入闭合 的提取单元中产生移动相的流动。这通过刺穿橡胶隔膜或另一种类隔膜来实现。必须定 义刺穿的深度，以避免被提取管底部的非极性溶剂污染，并且标准化有机溶剂的体积使 其能够流经所述柱。这可以通过柱上的间隔区实现，所述间隔区定义了柱穿刺进入提取 管的深度。其他选项是特定的毛细管个体夹持器(holder)，或要被同时处理的特定数量样 品的支架。两种选项的组合也是可能的。毛细管个体夹持器可以发挥与大储液器(wast reservoir)同样好的作用。作为毛细管固定插入的结果，在恒定的样品体积和恒定的溶剂 体积下，可以确保柱的开口处于有机提取介质中，并且仅使用确定量的溶剂。
经由紧挨色谱管的针使用注射器，并且通过注射器泵入约IOml空气，通过穿孔 建立用于溶剂流动的压强。该体积取决于提取管的大小和溶剂的体积。移动相借助于产 生的超压而发生流动。
另一个空的提取管位于对侧，移动相被收集在该提取管中。因此不会污染工作 台。同样存在的橡胶隔膜在去除色谱柱后闭合，并且两个单元均可丢弃，从而检查者不 与化学品接触。在所述优选的实施方案中，这通过将毛细管整合在一次性储液器中来实 现，所述储液器还发挥间隔区的作用，用于将毛细管固定在正确的位置和距离上。
经富集和/或分离的染料的鉴定通过眼睛直接进行，或者如果涉及具有特征性 固有颜色的物质时，通过分光方法进行；或者如果物质具有特征性激发和发射光谱时通 过荧光进行。
在本发明的一个优选的实施方案中，氧化剂被固定在分离吸附剂上，例如苯甲酰基过氧化物允许在提取之后但是最终检测之前漂白类胡萝卜素。
3.分析步骤
本发明还涉及分析所提取组分的方法。为了分析组分，考虑所有已知的分析技 术或目前未知的分析技术。能够证实，对于进一步的分析而言，例如通过色谱法、尤其 是通过高效液相色谱法(HPLC)分离组分是必需的。便利地，对通过光谱法检查组分的 分析方法提供上清液。考虑的光谱方法是通过与电磁辐射的相互作用检查组分的方法， 尤其是NMR、IR、UV-VIS、激光-Raman光谱法。
分析的一个优选的实施方案通过分光光度计进行。特别优选的是可手工操作的 可移动设备，使用所述设备可快速并可靠地进行光度计测量。
4.分析试剂盒和分析装置
本发明还涉及含有有机溶剂或溶剂混合物的分析单元，及其用于直接分析所提 取的物质的用途。
尤其优选的分析单元由两个独立的分析试剂盒组成，即预处理试剂盒和提取试 剂盒，使用所述试剂盒可以在两个步骤中进行根据本发明的方法。例如，在预处理试剂 盒中破坏和稀释生物材料。随后将液体样品从预处理试剂盒中转移至提取试剂盒中，随 后将所述物质在其中提取、转移至有机相并直接用分光光度计测量。
在这种情况下两个试剂盒例如各用一个管形成，所述管由塑料或玻璃组成，并 且根据要分析的生物材料和物质含有缓冲介质和/或溶剂。
根据组分的特性，可例如通过在小型化毛细管上富集和/或分离而在分析前进 一步加工所述组分，所述毛细管装有分离材料。
在分析方法的又一个优选的实施方案中，直接富集并同时分离溶于有机溶剂中 的组分。分离可以使用复杂的色谱方法例如HPLC或气相色谱进行，或通过标准或小型 化的柱色谱或薄层色谱法进行。在所述优选的实施方案中，在压强下在小型化的色谱柱 上直接从提取单元中富集组分，并与干扰物质分离。富集和分离是一种吸附方法。在这 种情况下，物质通过范德华力、偶极-偶极相互作用或氢键保留在固定相上。
本发明以以下实施例和图表中给出的不同结果为基础描述。
图1 :缓冲液中分级DMSO浓度(总体积的％ )和不同尿素浓度(摩尔浓度)对 从蛋黄样品中提取类胡萝卜素和苏丹的效率的影响。
图2 用于蛋黄的标准提取步骤与分级浓度DMSO影响的比较。
图3 在小型柱色谱上分离类胡萝卜素和苏丹之前用脂酶消化蛋黄脂质的影 响。
图4左图缺乏脂质消化对在TLC上分离类胡萝卜素和苏丹的影响。
图4右图在TLC上分离类胡萝卜素和苏丹之前消化脂质的影响。
图5:不同脂酶对游离脂肪酸从蛋黄脂质中释放的影响。
图6 用过氧化物漂白溶剂相对通过HPLC测定的类胡萝卜素去除的影响。
图7 用过氧化物漂白柱相对小型柱中类胡萝卜素去除的影响。
图8 用过氧化物在过运行后漂白对TLC平板上类胡萝卜素去除的影响。
附图描述
图1显示了 5个不同数据集合的简图。每个简图的特征是提取介质中不同浓度的尿素。另外，在每个尿素浓度下DMSO的量从0到100%变化。该图清楚地显示，随 着递增的DMSO浓度，提取效率被显著提高。50%和75%之间的数值可以被认为是最优 的。
图2显示相似的实验，但是在这种情况下，尿素的浓度被保持恒定于1M。数据 表示为使用异丙醇乙醇正己烷(1:2:6)的溶剂混合物(第6组)时来自蛋黄的类 胡萝卜素和苏丹最大提取量的百分比。各介质的组成为
1 =水(稀释溶液)；正己烷(提取介质)
2 = 10% DMSO+1M尿素(稀释溶液)；正己烷(提取介质)
3 = 25% DMSO+1M尿素(稀释溶液)；正己烷(提取介质)
4 = 50% DMSO+1M尿素(稀释溶液)；正己烷(提取介质)
5 = 75% DMSO+1M尿素(稀释溶液)；正己烷(提取介质)
6 = IM尿素(稀释溶液)；乙醇异丙醇正己烷(V V Vl 2 6)(提 取介质)
图3显示脂酶对小型柱中类胡萝卜素分离能力的影响。在这种情况下，用脂酶 (Picantase)孵育蛋黄样品，浓度从1.5到lOOmg/ml样品递增。当采用条带锐度作为标准 时，12到25mg/ml的脂酶浓度是最佳的。
图4显示脂酶处理对TLC上类胡萝卜素和苏丹分离的影响。TLC平板为Merck 1.05583。洗脱剂为正己烷中10%丙酮。
左侧脂酶处理均未导致严重歪曲的条带，而在右侧条带是清楚和尖锐的。
图5显示作为时间因素，脂酶处理对蛋黄中脂酶消化的影响。用相似浓度 (50mg/ml)的三种不同脂酶孵育蛋黄样品。根据游离脂肪酸的释放测量脂酶的降解。最 终点认为是100%。数据显示在25°C下脂酶能够消化脂质。使用脂酶R8000在60分钟 后得到最好的结果。
图6显示溶剂相漂白对掺入所示类胡萝卜素的蛋黄提取物中去除类胡萝卜素的 结果。在该实验中，在分离前向有机提取物(异辛烷)中添加过氧化物。在指定的时间 点通过HPLC测定个体类胡萝卜素的降解。结果显示在60分钟内类胡萝卜素被过氧化物 完全破坏。然而，掺入的苏丹水平未受影响。
图7显示柱相漂白对小型柱中类胡萝卜素的去除的影响。在这种情况下，用浸 透过氧化物的材料填充所述柱。用Piccantase A进行脂质消化后，将蛋黄类胡萝卜素和掺 入的苏丹染料提取进异辛烷中。在柱上分离提取物。结果显示类胡萝卜素在流经柱期间 完全被氧化破坏。
图8显示运行后漂白对类胡萝卜素降解的影响。如图8所示，类胡萝卜素和掺 入的苏丹从蛋黄中被提取，然后进行TLC并如图4所述显影。之后，用正己烷中的过氧 化物对TLC平板喷雾。结果显示类胡萝卜素在过氧化物处理后数分钟内被完全去除。
实施例1 从蛋黄中提取并测定苏丹红的一般过程
为了改善黄色和提高彩色稳定性，染料被添加进多种天然为黄色或红色的食物 中。尽管天然或等同于天然的类胡萝卜素是安全的，但是当添加偶氮化合物时存在高水 平的健康风险。为此，它们的添加是被禁止的，并且含有这些人工色素的产品必须从市 场上除去。快速、可靠和灵敏的检测是该目的所需要的。
这类方法的一个例子在下文中针对蛋黄进行描述。
蛋黄的一大部分由脂质组成。有色成分是类胡萝卜素。在蛋中，类胡萝卜素叶 黄素、玉米黄素、类胡萝卜素和角黄素以彼此不同的关系存在。它们通过饲料进入 蛋黄中。为了强化颜色，进行偶氮化合物类合成染料的饲喂。一个重要的代表是苏丹 111(红)。
以下的实施例阐述了从蛋黄中提取和检测类胡萝卜素和苏丹红的步骤。充分高 浓度DMSO的重要性在图1和2中展示。
在每种情况下，将Igm蛋黄与4-10倍体积的缓冲溶液或蒸馏水混合，随后在单 相溶剂或溶剂混合物中在单个步骤中离析。通过HPLC或光谱法测定有机提取物中的类 胡萝卜素。通过HPLC测定维生素A和Ε。
a)将Ig蛋黄在每种情况下与4ml稀释剂混合，所述稀释剂为蒸馏水或者缓冲溶 液(例如0.1M柠檬酸铵缓冲液)。进行剧烈的手动或机械混合。
b)将混合物(通常200到400μ1)装入注射器中，并通过橡胶隔膜注射进特定的 提取单元中。提取单元含有溶剂(正己烷或异辛烷)或单相溶剂混合物。
c)在又一个步骤中，通过添加缓冲液与DMSO和SDS的混合物(例如5 2比 例的DMSO 0.1% SDS中4Μ尿素)协助提取。
d)通过剧烈的摇动将脂溶性组分提取进有机提取介质中。
e)通过重力进行3分钟的相分离。
f)可以通过添加体积优选地为500 μ 1的高浓度盐或缓冲溶液，实现相分离的优 化。
g)直接在分光光度计中测量上清液。
h)或者取出上清液并借助于HPLC或分光光度法测量组分。借助于HPLC测定 维生素A和维生素E。
i)为了富集和分离，在提取之后进行柱色谱分离。为此，将装有硅胶(固定相) 的小型色谱柱放入提取管中。为此穿透提取单元的橡胶隔膜并以下述方式放置引入的柱 的较低端，所述方式使其恰好在液相之上。在柱的相对侧安装收集单元。
j)借助于5-lOml体积的注射器，用针通过隔膜向提取单元中泵入空气，持续约 10分钟。形成超压，所述超压导致有机提取介质从提取单元经过色谱柱(固定相硅胶) 流入收集单元中。在该过程中，发生类胡萝卜素和苏丹红的富集和分离。
k)通过将含有样品的柱与具有已知浓度苏丹红的柱进行比较，实现浓度的半定 量评估。
1)通过眼睛或光学信号的数字化放大进行检测。类胡萝卜素和苏丹红位于分离 的条带中(图3)。
实施例2:从根据本发明的蛋黄中提取和检测苏丹红。通过脂酶预处理改进在 饩谱介质上的分离。
在该实验中，用脂酶处理含有天然类胡萝卜素和掺入不同的合成苏丹染料的蛋 样品，从而以TLC(图4)和小型柱色谱(图3)上分离效力的测定为基础显示其效力。
a)将Ig蛋黄在每种情况下与4ml稀释剂混合，所述稀释剂为蒸馏水或者缓冲溶 液(例如0.1M柠檬酸铵缓冲液)。进行剧烈的手动或机械混合。
b)将200ml混合物用脂酶溶液(0.1M柠檬酸铵缓冲液中PicantaseA、Picantase R8000或胰腺脂酶200ml/ml)孵育。在室温下孵育不同时间段。如果提高孵育温度(例 如40°C)，则可减少孵育时间。
c)将混合物(通常200到400 μ 1)装入注射器中，并通过橡胶隔膜注射进特定的 提取单元中。提取单元含有溶剂(正己烷或异辛烷)或单相溶剂混合物。
d)在又一个步骤中，通过添加缓冲液与DMSO和SDS的混合物(例如5 2比 例的DMSO 0.1% SDS中4M尿素)协助提取。
e)通过剧烈的摇动将脂溶性组分提取进有机提取介质中。
f)通过重力进行3分钟的相分离。
g)可以通过添加体积优选地为500 μ 1的高浓度盐或缓冲溶液，改进或协助相分 离的优化。
h)通过在TLC或小型柱上评价分离来测定脂酶活性的积极影响。
实施例3 =脂酶处理对游离脂肪酸的影响
在该实验中，用不同的脂酶处理含有天然类胡萝卜素和掺入不同的合成苏丹染 料的蛋样品，从而以测量脂酶诱导的来自甘油三酯和其他脂质分解的游离脂肪酸的释放 为基础，显示其效力。
a)将Ig蛋黄在每种情况下与4ml稀释剂混合，所述稀释剂为蒸馏水或者缓冲溶 液(例如0.1M柠檬酸铵缓冲液)。进行剧烈的手动或机械混合。
b)将200ml混合物用脂酶溶液(0.1M柠檬酸铵缓冲液中PicantaseA、Picantase R8000或胰腺脂酶200ml/ml)孵育。在室温下孵育不同时间段。如果提高孵育温度(例 如40°C)，则可减少孵育时间。
c)将混合物(通常200到400 μ 1)装入注射器中，并通过橡胶隔膜注射进特定的 提取单元中。提取单元含有溶剂(正己烷或异辛烷)或单相溶剂混合物。
d)在又一个步骤中，通过添加缓冲液与DMSO和SDS的混合物(例如5 2比 例的DMSO 0.1% SDS中4M尿素)协助提取。
e)通过剧烈的摇动将脂溶性组分提取进有机提取介质中。
f)通过重力进行3分钟的相分离。
g)可以通过添加体积优选地为500 μ 1的高浓度盐或缓冲溶液，改进或协助相分 离的优化。
h)通过测量时间依赖性的游离脂肪酸增加，测定脂酶活性的效力。
实施例4:通过在有机溶剂中处理，随后通过氧化剂提取(溶剂相漂白)来去除 类胡萝卜素
在该实验中，如实验2中所述处理样品。然而，在步骤O中，用过氧化物(约 13mg/ml)来饱和(在20°C下)有机溶剂(例如正己烷或异辛烷)。或者，也可以使用次 氯酸钠进行该实验。
为了测定氧化能力，通过HPLC测定类胡萝卜素的减少和类胡萝卜素的稳定性 (图 6)。
实施例5 =通过在柱材料中包含过氧化物去除类胡萝卜素(柱相漂白)
在该实验中，如实验4中所述处理样品。然而，向柱材料中添加氧化化学品。在这种情况下，类胡萝卜素在柱材料上分离期间被破坏(图7)。
通过用苯甲酰基过氧化物的正己烷溶液浸渍吸附剂来制备柱材料。将溶液在 20°C下饱和。该浸渍可以在填充毛细管之前或之后完成。在两种情况下，均真空干燥色 谱材料。
棚列6 :卜胃躺識寸龙TLC科反卜应謝氧魏射綠古膀卜 素(运行后漂白)
在该实验中，如实验4中所述处理样品。然而，在分离类胡萝卜素后通过喷雾 向TLC平板上添加氧化化学品。
在TLC平板上应用如先前实验中所述从蛋黄中提取的类胡萝卜素和苏丹，用于 分离和浓缩。在TLC运行后，用有机过氧化物溶液处理平板。为此将溶液喷雾在平板 上(图8)。
权利要求
1.用于从富含脂质的生物材料中提取亲脂性物质例如天然或合成(人造)的脂溶性染 料的方法，所述方法包括预处理步骤和随后的提取步骤，所述预处理步骤发挥使组分更 容易进行提取的作用，所述提取步骤中所述材料物质被提取进有机溶剂中，所述有机溶 剂由于添加水性样品而将所述材料物质分入两相中，并且所述组分可在所述有机溶剂相 中被检测到；其中在所述预处理步骤中，用至少一种酶处理所述样品从而去除脂质，并 且其中在最终检测之前通过氧化破坏对氧化敏感的成分例如类胡萝卜素。
2.权利要求1中所述方法，其中所述合成染料为偶氮化合物。
3.权利要求1或2中所述方法，其中使用的所述生物材料是得自植物或动物的富含脂 质的食物或饲料，例如蛋、黄油、全脂奶、奶酪、香肠、油。
4.前述权利要求中任一项所述方法，其中以特定的稀释步骤来发挥预处理的作用， 需要时，特别是在固体生物材料的情况下，将所述特定的稀释步骤额外地与破坏步骤组合
5.前述权利要求中任一项所述方法，所述方法包括用不同浓度的特定盐溶液或缓冲 溶液来进行预处理，尤其是用尿素溶液进行。
6.前述权利要求中任一项所述方法，其中用至少一种用于脂质的酶促消化的脂酶 处理所述生物材料的样品，其中脂酶表示羧酸酯水解酶EC3丄1-，其包括例如以下的 活性EC 3.1丄3三酰基甘油脂酶、EC 3.L1.4磷脂酶Al、EC 3丄1.5溶血磷脂酶、EC 3丄1.26半乳糖脂酶、EC 3丄1.32磷脂酶Al、EC 3.1丄73阿魏酸酯酶。
7.前述权利要求中任一项所述方法，其中使用极性质子溶剂作为有机溶剂用于提取。
8.权利要求7中所述方法，其中所述极性质子溶剂选自由甲醇、乙醇、1-丙醇、 2_丙醇(异丙醇)、丁醇、戊醇、己醇、DMSO及其混合物组成的组。
9.前述权利要求中任一项所述方法，其中通过极性非质子溶剂增强类胡萝卜素和苏 丹的提取。
10.权利要求9中所述方法，其中所述极性非质子溶剂是DMSO。
11.前述权利要求中任一项所述方法，其中在最终检测之前通过色谱方法富集所提取 的组分，并且通过用氧化剂处理来破坏干扰最终分析的伴随物质，例如对氧化敏感的成 分例如类胡萝卜素。
12.权利要求9中所述方法，其中所述氧化剂是过氧化物，优选地为无机过氧化物例 如压02、K2S2O8,或有机过氧化物例如苯甲酰基过氧化物。
13.前述权利要求中任一项所述方法，其中用光谱法、尤其是用比色法、优选地用荧 光法分析所提取的物质。
14.前述权利要求中任一项所述方法用于检测食物和饲料中、优选地检测蛋或含蛋制 品中染料的用途。
15.用于进行前述权利要求中任一项所述方法的分析装置，其由预处理试剂盒和提取 试剂盒组成，其中两种试剂盒均各自含有上述类型的溶剂和/或溶剂混合物，所述类型 取决于待分析的生物材料和物质。
全文摘要
本发明涉及用于从生物材料中提取和检测脂溶性组分的方法，尤其是从富含脂质的食品中提取、检测和分析燃料的方法。所述方法包括提取和分离步骤和随后的分析步骤的组合。本发明还涉及用于进行所述方法的分析试剂盒和分析设备。根据本发明的方法由多个步骤组成。其中关键性的步骤为1.预处理样品，去除脂质；2.通过特定的溶剂或溶剂混合物将染料提取进提取混合物中；3.在最终通过眼睛或光学增强设备检测和定量之前，破坏对氧化敏感的成分例如类胡萝卜素。
文档编号G01N1/40GK102023109SQ20091024655
公开日2011年4月20日 申请日期2009年11月30日 优先权日2009年9月23日
发明者弗洛瑞娜·J·斯楚威戈特 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司