用于诊断和作为癌症治疗靶标的ttk的制作方法

专利名称：：用于诊断和作为癌症治疗靶标的ttk的制作方法
技术领域：
：本发明的涉及疾病诊断和癌症治疗以及抗癌剂的鉴定。发明的背景有丝分裂关卡基因在发育中的作用及在疾病如癌症中的潜在作用已广泛研究。有丝分裂关卡包括一些不同的确保正确细胞分裂的机制。例如，纺锤体关卡相应于在赤道板染色体不正确的排列而调节(细胞分裂)后期开始的定时。如果检测到缺陷，转换信号以暂停细胞周期进一步进行，直到达到正确的两极结合纺锤体。一些哺乳动物纺锤体关卡相关蛋白开始在芽殖酵母中鉴定，最近被确定并部分特征鉴定。这些蛋白与所有的活性人类着丝粒相关，包括在后期开始前有丝分裂早期阶段的新着丝粒。发现与关卡蛋白复合体(BUB1、BUBR1、BUB3、MAD2)、后期促进复合体(Tsg24、p55CDC)联系的蛋白，和其它与有丝分裂关卡调控(ERKl、3F3/2抗原表位、hZWIO)联系的蛋白仅和活性着丝粒特异性联系，说明只有活性着丝粒参与纺锤体关卡。SafferyR等，HumGenet.107:376-84(2000)。酪氨酸苏氨酸激酶(TTK)，一种蛋白激酶，磷酸化丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸羟氨酸(Mills等，Biol.Chem.267:16000-6(1992))。激酶与TTK联系最紧密，包括SPLK1丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶、Piml、PBS2、CDC2丝氨酸/苏氨酸激酶和TIK激酶(Mills等，Biol.Chem.267:16000-6(1992))。人TTK的核苷和氨基酸序列在如GenBankAccessionNo.M86699中提供。TTK表达在静止细胞和低增殖指数的组织中显著减少或缺乏(Hogg等，Oncogene9:89-96(1994)。TTKmRNA在人睾丸、胸腺、骨髓和其它含许多增殖细胞的组织中表达，且在含少量或没有分裂细胞的组织中没有检测到。TTK表达在一些迅速增殖细胞系中检测到，包括许多癌细胞系。TTK表达也在来自两个恶性卵巢癌患者的样品组织样本中检测到(Mills等，ibid.;Schmandt等，J.Immunol.152:96-105(1994))。TTK表达与细胞增殖相关，并在细胞周期调控中发挥作用(Hogg等，ibid.)。非常低水平的TTKmRNA和蛋白质在饥饿细胞中存在。当细胞被引导进入细胞周期时，TTKmRNA、蛋白质的水平和激酶活性在细胞周期的Gl/S期增加，在G2/M达到顶峰。TTKmRNA水平及激酶活性在Gl早期剧烈下降，而蛋白质水平大量地维持着。TTK是酿酒酵母(S.cerevesiae)激酶mpsl和S.pombe蛋白mphl的人同源物，它们都参与细胞周期纺锤体关卡，因此显示TTK是纺锤体关卡基因(例如参见Cahill等，Genomics58:181-7(1999))。尽管有丝分裂关卡损伤在人类癌症中发现(如，这类损伤存在于约40%人肺癌细胞系中)，MAD有丝分裂关卡基因和BUB基因家族中的突变很少发生。HarukiN等，CancerLett.162:201-205(2001);MimoriK等，OncolR印.8:39-42(2001);Cahill等，ibid.)。因此需要鉴定在人类癌症中发挥作用的有丝分裂关卡基因，因为它们可作为提供信息的诊断和/或预测指示物和治疗对象。发明概述本发明提供了通过检测TTK的表达水平鉴定癌细胞的方法，以及利用哺乳动物癌症中这些基因的不同表达的诊断、预测和治疗方法。这些方法可在确定受试者对一具体治疗作出反应的能力中起作用，如作为合理治疗的基础。此外本发明提供了鉴定在癌症中调节这些基因活性的药物的试验，这些基因参与癌症，本发明也提供了通过抑制TTK活性抑制肿瘤生长的方法。在第一个实施方案中，本发明提供了鉴定被怀疑患有癌症(如肺、结肠、前列腺(prostrate)或乳房组织活组织检查)的受试者样品中TTK水平的方法，包括定量样品中TTK水平。鉴定样品中TTK水平增加提供了在样本细胞中细胞周期关卡损伤的指示。在另一个实施方案中，发明提供了确定恶性或前恶性生长的特征，包括确定(或定性或定量)生长细胞中的TTK水平，与在癌症和/或正常组织不同阶段中已知的水平比较。例如，为确定一具体受试者结肠癌的特征，癌症的样品可去除，确定癌症中TTK的水平，与正常组织和/或来自相同细胞类型的结肠癌不同阶段中的水平比较。因此样品中鉴定的TTK水平可作为恶性或前恶性生长的许多特征的指示，由已知组织和癌症的特征确定。TTK的水平可直接与其它单个样品中的水平比较，或者可与来自多样品数据的标准比较。在又一个实施方案中，样品的TTK水平可用于作为确定恶性或前恶性生长的受试者的适当治疗干涉的一个指标。例如，高增长的TTK水平可指示需要更多的侵入性治疗，因为它指示较晚起的癌症。另外，TTK的表达水平可指示一具体药物的受试者的反应，特别是通过有丝分裂关卡影响癌症的治疗干涉。在另外一个实施方案中，发明描述了鉴定抑制肿瘤剂的方法，具体是乳腺或结肠肿瘤，通过使表达TTK的细胞接触候选试剂，并评估试剂对TTK活性的效果。因此，一方面发明描述了在受试者中诊断癌症的方法，方法包括在获得自受试者的试验样品中检测TTK多核苷酸或多肽，从而确定基因产物的表达水平；比较试验样品中TTK的表达水平和相应于相同组织的正常细胞中的表达水平；其中发现试验样品中的TTK表达水平比正常细胞中的表达水平显著增加说明试验细胞示癌细胞。在具体实施方案中，癌症是除卵巢癌外的癌症，对结肠癌和乳腺癌具有特别的兴趣。另一方面，发明描述了确定受试者中癌症疾病预测的方法，方法包括检测来自受试者的试验细胞中TTK的表达水平；其中试验细胞中相对于对照细胞中表达水平的TTK的表达水平指示癌症疾病的预测。例如，当对照细胞是正常细胞时，试验细胞中相对于正常细胞的TTK表达水平上升显示受试者中癌细胞继续存在，因此预测比当试验细胞中TTK的表达水平相当于正常(非癌症)细胞中发现的水平时相对较差。在具体的实施方案中，除卵巢癌外的癌症的发展弓I起特别的兴趣，尤其是结肠癌和乳腺癌。另外一方面，发明描述了抑制癌细胞生长的方法，包括导入反义多核苷酸到细胞中抑制TTK表达，其中TTK表达的抑制抑制了癌细胞的复制。还有一方面，发明描述了评估受试者肿瘤负担的方法，方法包括检测来自受试者试验样品中的TTK表达水平，试验样品怀疑包括提高的TTK表达；其中检测试验样品中的TTK表达水平指示受试者的肿瘤负担，试验样品中相对于对照非癌细胞的TTK表达水平上升表明受试者中存在肿瘤。又一方面，发明描述了鉴定具有抗TTK活性的试剂的方法，方法包括使呈现提高的TTK表达的癌症细胞接触候选试剂；并确定候选试剂对TTK活性的效果；其中TTK活性减少表明试剂有抗TTK活性。在具体的实施方案中，TTK活性通过检测TTK表达或检测TTK生物活性来测定。而另一方面，发明描述了鉴定抑制癌细胞生长的候选试剂的试验，包括使表达TTK多肽的细胞接触候选试剂；检测TTK多肽的活性，比较候选试剂存在时细胞中TTK多肽的活性和没有候选试剂时细胞中TTK多肽的活性；其中相对于没有候选试剂时细胞中TTK活性，候选试剂存在时TTK活性的减少表明候选试剂降低TTK活性并抑制癌细胞的生长。发明的一个主要目的是使用TTK作为治疗对象，例如通过鉴定调节，通常减少靶细胞中TTK活性的候选试剂，如为了抑制细胞生长。本发明的一个目的是通过抑制有丝分裂关卡基因产物的活性抑制肿瘤生长，具体是通过抑制目的肿瘤细胞中的TTK活性。发明的另一目的是简化合理的癌症治疗。例如，当受试者中的癌症与增高的TTK活性水平相联系时，相应地选择治疗试剂以促进TTK活性水平降低。本发明的又一目的是在癌症中TTK表达水平的基础上设计临床试验，更具体的是在结和其他病人特征的基础上设计临床试验。发明的另一个目的是鉴定TTK表达和干扰的关系，这在选择的疾病进展评估中会产生有效的变化。发明的一个优势是在恶性或前恶性生长中以TTK表达为基础设计疾病进展的能力。本发明的另一优势是使用更系统的方法用于以目的标记为基础的癌症疾病的发明。本领域的技术人员通过阅读下面更详细描述的方法的细节可了解这些和其它发明的目的、优势和特征。附图简述图1是说明由PCR检测的在不同正常组织类型中TTK表达的柱状图。图2是说明由PCR检测的在不同肿瘤细胞系中TTK表达的柱状图。图3-6是说明结肠直肠癌症病人中IGF2、MAPKAPK2、TTK和MARCKS表达分布的图。图7和8是说明反义抑制TTK表达后MDA-MB-231细胞生长抑制的图。图9是说明反义抑制TTK表达后S怖20细胞生长抑制的图。图10是说明反义抑制TTK表达后在软琼脂中S怖20细胞群落形成抑制的图。图11是说明反义抑制TTK对正常的无限纤维原细胞没有可检测的效果的图。图12是说明从SW620细胞去除TTK诱导细胞死亡的柱状图。优选实施方案的详细说明在描述本发明前，需要理解的是本发明不限于所述具体方法学，当然也可多样化。也需理解的是本文使用的术语仅是为了描述具体实施方案，并不想要限制，因为本发明的范围仅由所附的权利要求限制。当提供了一系列数值时，应理解除非明确地另有所指，在此范围上限和下限之间的各干涉值也被具体说明，它们可至下限单位的十分之一。在一定范围中任意规定值或干涉值和此一定范围中任何其它规定值或干涉值之间的每个较小范围包括在发明中。这些较6小范围的上限和下限可独立地包括或排除于范围中，每个范围也包括在发明中，其中任一、无一或两个界限都都包括在较小范围中，满足一定范围中任何特定排除的界限。当一定的范围包括一个或两个界限时，排除任一或两个那些包含的界限的范围也包括在发明中。除非另外定义，所有本文使用的技术和科学术语有相同的意义，如本发明所属领域普通技术人员普遍理解的。尽管任何与那些本文所述类似或相同的方法和材料可用于本发明的实践或试验，现在描述优选方法和材料。本文提到的所有出版物纳入参考文献并描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。必须指出的是如本文和所附加的权利要求中所用，除非另有说明单数形式也包括复数所指物。因此，例如，提及"一个细胞"包括这些细胞的复数，提到"此试剂"涉及一种或更多试剂和那些本领域技术人员所知的它们的同等物等。提供了这里讨论的出版物，这仅是因为其公开先于本申请的申请日。本文没有任何地方承认，由于前面的发明，本发明不能在这些出版物之前授权。此外，出版物提供的日期也许与可能需要单独确定的实际的出版物日期不同。定义术语"多核苷酸"和"核酸"，在本文交换使用，涉及任何长度核苷的聚合形式，或核苷酸或脱氧核苷酸。因此，这些术语包括，但不限于，单、双或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交，或包括嘌呤和嘧啶碱基或其它天然、化学或生物化学修饰、非天然或衍生核苷碱基的聚合体。这些术语进一步包括，但不限于，包括内含子序列的mRNA或cDNA(例如参见Niwa等，(1999)Cel199(7):691-702)。多核苷酸的主链可包括糖和磷酸基团(如在RNA或DNA中典型发现的)，或者修饰或置换的糖或磷酸基团。另外，多核苷酸的主链可包括合成亚基的聚合体如氨基磷酸酯，因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯或混合氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚体。Peyrottes等，(1996)Nucl.AcidsRes.24:1841-1848;Chaturvedi等，(1996)Nucl.AcidsRes.24:2318-2323。多核苷酸可包括修饰过的核苷，如甲基化核苷和核苷类似物、uracyl、其它糖，及连接基团如荧光核糖和thioate和核苷分枝。核苷序列可又非核苷成分中断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，如结合标记成分。包括在此定义中的其它类型的修饰是加帽、用类似物置换一个或更多天然发生的核苷、引入附着多核苷酸到蛋白质的方法、金属离子、标记成分、其它多核苷酸或固体支持物。术语"多核苷酸"和"蛋白质"，在本文交换使用，是涉及任何长度氨基酸的聚合形式，包括编码和非编码氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有修饰过的肽主链的多肽。术语包括融合蛋白，包含但不限于，有不同氨基酸序列的融合蛋白，与不同和同源前导序列融合，有或没有N末端甲硫氨酸残基；免疫标记蛋白质等。如本文所用，"TTK多核苷酸"和"TTK多肽"包括具有与人TTK类似或相同序列的多核苷酸和多肽(GenBank加入号M86699;SEQIDNO:13禾P14)，或酿酒酵母(S.cerevesiae)激酶mpsl基因和基因产物(SEQIDNO:29和30)，S.pombe蛋白mphl基因和基因产物(SEQIDNO:31和32)，其它涉及TTK的基因和基因产物，如SPK1(SEQIDNO:15和16)、Piml(SEQIDN0:17和18)、TIK(SEQIDNO:23和24)，至少约65%，至少约80%交加，至少约85%更佳，可以是约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。序列类似性和序列同一性在参考序列基础上计算，可是更长序列的亚群，如保守基序、编码区域、侧翼区域等。参考序列通常至少约18nt长，更常见的是至少约30nt长，可延长到在比较的全序列。一般而言，序列同一性百分比的计算可通过计数质疑序列和试验序列间配对残基的数量(如核苷残基或氨基酸残基)，并将总配对数除以在最强比对区域中发现的各序列残基数目。因此，ll个残基的质疑序列中的IO个残基与试验序列配对，上述同一性百分比为11分之10或约90.9%。在计算机基础上序列分析的算法在本领域已知，如BLAST(例如参见Altschul等，J.Mol.Biol.，215:403-10(1990))，具体是Smith-Waterman同源搜索算法如用于MPSRCH程序(OxfordMolecular)。为了本发明的目的，计算同一性百分比的优选方法是使用下列的Smith-Waterman算法。总体DNA序列同一性必须大于65%，如用于MPSRCH程序(OxfordMolecular)的Smith-Waterman同源搜索算法所确定，使用具下列搜索参数的精确缺口搜索缺口开放罚分为12;缺口衍生罚分为1。人TTKcDNA以SEQIDNO:13的多核苷酸序列表示，人TTK多肽以SEQIDNO:14的序列表示。"反义多核苷酸"或"反义寡核苷酸"在本文交换使用以代表未修饰或修饰过的核酸，具有与给定多核苷酸序列(如编码TTK的多核苷酸序列)互补的核苷序列，包括与给定多核苷酸序列(如编码TTK的多核苷酸的启动子)转录或翻译联系的多核苷酸序列，其中反义多核苷酸能和TTK-编码多核苷酸序列杂交。有特殊兴趣的是或在体外或体内能抑制TTK-编码多核苷酸的转录和/或翻译的反义多核苷酸。如本文所用，术语"cDNA"用于包括共享天然成熟mRNA种类中发现的序列元件排列的所有核酸，其中序列元件是外显子(如编码编码多肽的可读阅读框的序列)和3'及5'非编码区域。正常mRNA种类有邻近的外显子，通过核RNA剪接去除间隔内含子以产生连续编码TTK的可读阅读框。如"变化多肽"中所用，"变体"是指由一个或更多相对参考氨基酸序列的氨基酸改变的氨基酸序列。变体可有"保守"变化，其中置换的氨基酸有类似结构或化学特性，如用异亮氨酸置换亮氨酸。更罕见的是，变体可有"非保守"变化，如用色氨酸置换甘氨酸。类似的小变化也可包括氨基酸缺失或插入，或两者都有。确定哪些和多少氨基酸残基可置换、插入或缺失而不去除生物或免疫活性的指南，可用本领域熟知的计算机程序发现，如DNAStar软件。"缺失"定义为氨基酸或核苷序列中的变化，其中与参考氨基酸序列或核苷序列相比，分别缺失一个或更多氨基酸或核苷残基。缺失可以是任何长度，但优选的是约50、20、15、10、5或3个氨基酸或核苷长度。"插入"或"添加"是氨基酸或核苷序列中的变化，导致与参考氨基酸序列或核苷序列相比，分别加入一个或更多氨基酸或核苷残基。插入或添加可以是任何长度，但优选的是约50、20、15、10、5或3个氨基酸或核苷长度。"置换"来自用不同氨基酸或核苷分别置换一个或更多氨基酸或核苷，如与参考氨基酸序列或核苷序列相比。置换可以是任何长度，但优选的是约50、20、15、10、5或3个氨基酸或核苷长度。术语"单核苷多态性"和"SNP"指相对于参考序列的单碱基变化的多态性。术语"生物活性"指基因产物，通常是多肽，具有天然发生基因产物的结构、调节或生物功能，如蛋白质。"免疫活性"定义天然、重组或合成多肽，或任何它的寡肽的能力，以在适当动物或细胞中引起特异的免疫应答和结合特异的抗体。如本文所用，术语"衍生"指相对于参考核酸或氨基酸序列的一个核酸或氨基酸序列的化学修饰。这些修饰的说明是用烷基、酰基或氨基基团置换氢。核酸衍生物一般编码多肽，编码的多肽保留由参考核酸编码的多肽的必要生物特征(如，"亲本"分子)。如本文所用，术语"分离"意味着描述感兴趣的化合物(或多核苷酸或多肽)，化合物所处环境不同于天然发生的化合物所处的环境。"分离"意味着包括样品中的化合物，样品显著浓縮用于感兴趣的化合物和/或其中感兴趣的化合物部分或充分纯化。如本文所用，术语"充分纯化"指从其天然环境中去除的化合物(或多核苷酸或多肽)，且至少60%没有，较佳的是75%没有，最佳的是90%没有与其天然相联系的其它成分。"严紧性"通常在从约-5t:温度(低于探针或抗体温度5°C)到低于温度约20°C到25t:的范围中发生。如本领域技术人员所理解的，严紧性杂交可用于鉴定或检测相同多核苷酸序列或者鉴定或检测类似或相关多核苷酸序列。如本文所用，术语"杂交"包括"核酸链通过碱基配对连接互补链的任何过程"(Coombs，生物技术字典，StocktonPress,纽约NY(1994))。在聚合酶链反应技术中采用的扩增描述于Dieffenbach等，PCR引物，实验室手册，ColdSpringHarborPress，PlainviewNY(1995)。如本文所用，术语"转化"指永久或暂时遗传变化，在下列结合新DNA(即细胞外源DNA)的细胞中诱导。遗传变化可通过结合新DNA到宿主细胞基因组或者暂时或稳定维持新DNA作为游离成分获得。当细胞是哺乳动物细胞时，永久遗传变化一般通过引导DNA到细胞基因组中达到。如本文所用，术语"构建物"指重组核酸，一般是重组DNA，产生重组核酸用于表达具体核苷序列，或用于构建其它重组核苷序列。如本文所用，术语"差异表达"一般指在试验细胞中表达水平与参考细胞中的水平显著不同的多核苷酸，如，当与相同类型的非癌细胞相比时，癌细胞中mRNA以至少约25X、至少约50%到约75%、至少约90%增加或减少水平发现，通常至少约1.2倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、或者至少约50倍或更多增加或减少。比较可在2种组织间进行，例如，如一种试验使用原位杂交或另一种使组织中细胞类型间一定程度识别的试验方法。比较也可在取自它们组织来源的细胞间进行。"差异表达"指基因时间和/或细胞表达模式中定量以及定性的不同，在如正常和赘生性肿瘤细胞间，和/或经历不同肿瘤发展事件的肿瘤细胞间。如本文所用，术语"相应于"或"表现"，例如，短语"相应于差异表达基因的多核苷酸"用于指给定多核苷酸和从中获得多核苷酸的基因(如，获得自基因编码区域、基因剪接变体、外显子等的多核苷酸)或多核苷酸在更严紧条件下杂交的基因之间的关系。如本文所用，"差异表达的多核苷酸"指核酸分子(RNA或DNA)，包括表现或相应于差异表达基因的序列，如差异表达的多核苷酸包括独特识别差异表达基因的序列(如，编码基因产物的可读阅读框；非编码序列)，从而在样品中差异表达的多核苷酸的检测与样品中存在差异表达的基因相关。"差异表达的多核苷酸"也意味着包括所示多核苷酸的片断，如保留生物活性的片断以及与所示多核苷酸同源、显著类似、或显著相同(如有约90%序列同一性)的核酸。如本文所用，"诊断"一般包括确定受试者对疾病或紊乱的感受性，确定受试者是否受疾病或紊乱的影响，受疾病或紊乱的影响(如，鉴定转移前或转移癌症状态、癌症阶段或癌症对治疗的反应)的受试者的预测，和治疗(监控受试者的情况以提供用于治疗效果或功效的信息)。如本文所用，"与癌症联系的多肽"(如，在与结肠癌联系的多肽中)指多肽在癌细胞中相对同样类型的正常细胞以相对更高或更低的水平存在。术语"生物样品"包括从生物体获得的多种样品种类并可用于诊断或监控试验。术语包括血液和其它生物来源的液体样品、固体组织样品，如活组织检查样本或组织培养物或从那里获得的细胞和其后代。术语包括在获得后以任何方式操作的样品，如用试剂处理、溶解、或浓縮某些成分。术语包括临床样品，也包括在细胞培养、细胞上清液、细胞溶解产物、血清、血桨、生物液体和组织样品中的细胞。如本文所用，术语"治疗"、"处理(treating)"、"处理(treat)"等一般指获得理想的药理和/或生理效果。效果可根据完全或部分防止疾病或它的症状起预防作用，和/或根据部分或完全稳定或治疗疾病和/或对疾病的反效果起治疗作用。如本文所用，"治疗"涵盖对哺乳动物疾病的任何治疗，具体是人，包括(a)防止疾病或症状在受试者上产生，可先倾向于疾病或症状但还未诊断具有；(b)抑制疾病症状，即抑制其发展；或者缓解疾病症状，即引起疾病或症状的退化。因此"治疗癌症"包括一种或更多细胞增殖的抑制、转移的抑制等。术语"个体"、"受试者"、"宿主"和"病人"，在本文交换使用，指任何受试哺乳动物，它们的诊断、治疗或疗法是所需的，具体是人。其它被试的可包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等等。如本文所用，短语"特异性结合对"包括一个特异性结合部分和结合伙伴，它们对彼此有特殊的特异性并在严紧条件下优先于其它分子彼此结合。具体结合对的例子是抗原和抗体、分子和受体以及互补核苷序列。本领域的技术人员通过阅读本说明可了解结合对的其它例子。此外，术语"特异性结合对"也可用于特异性结合部分和结合伙伴之一或两者都包括部分大分子。在特异性结合对是核酸序列的实施方案中，优选的是在10到200核苷长度，更优选的是大于15到100核苷长度。"抗体"意味免疫球蛋白蛋白质，能结合抗原。如本文所用，抗体意味着包括完整抗体及任何能结合抗原表位、抗原或感兴趣的抗原片断的抗体片断(如，F(ab')2、Fab'、Fab、Fv)。发明的抗体具免疫反应性或免疫专一性，因此特异和选择结合感兴趣的蛋白质，如人TTK蛋白质。优选免疫反应性的和对人TTK免疫专一的抗体。人TTK抗体优选免疫专一性的_即与相关材料没有显著交叉反应，尽管它们也许识别TTK同源交叉品种(acrossspecies)。术语"抗体"包括所有类型的抗体(如单抗和多抗)。"特异性结合"意味抗体高亲合力和/或高亲和性地结合特异多肽，如TTK蛋白的抗原表位。抗体结合到此特异多肽上的抗原表位强于相同的抗体结合任何其它的抗原表位，具体是那些可存在于分子中，与相同样品联系或在其中，如感兴趣的特异多肽。特异性结合感兴趣的多肽的抗体能以弱但可检测的水平结合其它多肽(如显示10%或更低的结合感兴趣的多肽)。这种弱结合或背景结合，可从结合感兴趣的化合物或多肽的特异抗体中辨别，如通过用适当对照。术语"癌症"、"赘生物"、"肿瘤"等在本文交换使用，指表现出相对自发生长的细胞，因此它们表现出异常生长表性，特征为对照的细胞增殖显著减少。一般，本应用中检测或治疗的感兴趣的细胞包括前恶性(如良性增生)、恶性、转移和非转移细胞。如本文所用，"TTK活性"指TTK多肽在磷酸化受体底物中的活性。如本文所用，"调节TTK活性"指TTK活性的增加或减少，可由于，例如试剂与TTK多肽相互作用(如可逆或不可逆结合抑制剂，从而干扰在TTK活性磷酸化中TTK多肽与供体分子或接受(受体)分子的相互作用)、抑制TTK转录和/或翻译(如通过与TTK基因或TTK转录物的反义相互作用，通过促进TTK表达的转录因子的调节)等。本发明对导致TTK活性下降的TTK活性调节感兴趣。在此情况下，TTK活性可通过抑制剂相对没有试剂时的TTK活性下降至少10%、25%、50%、75%、85%、90%到100%。TTK活性可通过测定酶活性、测定TTK多肽水平或测定TTK转录水平来评估。比较TTK活性也可通过比较试验样品中测定的TTK活性(或定性或定量)和标准TTK活性(如与正常细胞相联系的在没有抑制剂或拮抗剂时的TTK活性水平，选定组织类型的癌细胞的TTK活性水平等)。人TTK是有丝分裂关卡基因，编码857个氨基酸的蛋白质，表现出混合特异性(tyr/thr)激酶活性。例如参见MillsGB等，JBiolChem.267:16000-6(1992)。本发明以TTK在结肠肿瘤细胞中相对正常结肠细胞表达不同的发现为基础，如微阵列分析所测。不同表达在来自不同形式癌症的细胞系中证实，表明TTK作为一个更普遍的机制参与癌症。此外，用反义寡核苷酸"敲除"TTK信息破坏TTK功能使增殖减少、抑制不依赖贴壁生长并诱导癌细胞系程序性死亡，包括转移性乳腺癌细胞系(MDA-MB-213)和结肠直肠癌细胞系(SW620)。这些数据说明TTK在癌症化疗中可作为治疗对象，其中TTK过度表达。TTK与癌症相联系的鉴定和抑制TTK活性(如通过减少TTK表达)的证实作为发明材料和方法的基础，如本文所示和讨论的，用于如诊断病人的癌症，具体是接受降低TTK活性治疗的癌症。发明也提供了设计和选择适当治疗和/或预防治疗，可通过靶向那些最有可能产生作用的进行流水治疗。发明也提供了与异常TTK水平相联系的癌症的治疗(如与TTK过度表达或过度生成联系)，例如抑制基因产物生成(如降低转录和/或翻译的水平)、减少TTK活性(如减少TTK基因产物生成(如在转录或翻译水平)和/或降低一种或更多TTK激酶的活性)。现在更详细地描述发明的不同方面。诊断方法发明的一个方面以一个发现为基础，TTK活性在癌细胞(具体是结肠癌和乳腺癌)中以比相同细胞类型的正常细胞高的水平存在。此发现作为鉴定癌细胞以及鉴定接受抑制TTK活性治疗的肿瘤的基础，如，通过在转录或翻译或两者水平上抑制TTK表达等。TTK基因产物如TTK编码mRNA或TTK多肽有特别兴趣作为标记(例如在体液中(如血液)或在组织中)来检测癌症发生途径中最早的变化(如从非癌症组织中区分癌症组织)和/或监控不同治疗和预防干涉的效果。例如，与相同类型正常细胞或组织比较相对增加的TTK表达水平可指示较差的预测，因此允许对病人采取更具侵入性的治疗(如化疗或放射治疗)或反之亦然。替代肿瘤具体特征与患者对治疗的反应和结果间的相互关联可确定预测指示物，这样可基于肿瘤的分子分布设计专门的治疗。这些治疗包括靶向抗体、拮抗物(如小分子)和基因治疗。确定TTK表达和比较病人的分布与正常组织中已知的表达以及疾病的变体可确定对病人尽可能最佳的治疗，既根据治疗的特征也根据病人的舒适水平。替代肿瘤标记如多核苷酸，也可用于更好的分类，从而诊断和治疗癌症的不同形式的疾病状态。两种广泛用于肿瘤学且受益于鉴定TTK表达水平的分类划分癌症疾病的阶段，为癌症组织的性质分级。TTK多核苷酸以及它们的编码基因产物，可用于监控患有或易患癌症的病人以在潜在恶性发展总形态水平可检测之前检测分子水平的潜在恶性发展。此外，检测TTK基因产物可用作治疗方法，如评估用多核苷酸或它们编码基因产物的治疗的效果，评估如病人治疗前、中和后的肿瘤负担。此外，多核苷酸鉴定为响应在一种癌症中不同表达且因此对此种癌症重要的基因，多核苷酸也可指示其它类型癌症的发展或发展风险，如多核苷酸表现为在不同癌症种类中不同表达的基因。因此，例如，与对转移性结肠癌有临床指示的基因相应的多核苷酸表达也可对胃癌症或子宫癌症有临床指示。在以TTK酶活性或TTK多肽表达水平或TTK编码多核苷酸为基础进行的诊断、预测、风险评估或肿瘤负担测定中，活性或表达水平可与适当的癌症或非癌症对照样品比较。例如，如果1"11(活性相对同种组织类型的正常非癌细胞增加25%、50%、75%、90%到100%，或另外提高5倍、10倍、50倍或100倍以上，则可作出癌症的诊断。在癌细胞中相对于例如不同潜在恶性癌细胞间的非癌细胞(如非恶性肿瘤细胞对高潜在恶性的细胞)不同表达的其它基因产物，除了试验细胞中TTK不同表达也可测试。这些示例基因产物包括，但不必须限于MAPKAP激酶2(SEQID.No.33和34)、MARCKS(SEQID.No.35和36)和/或IGF2(SEQID.No.37和38)。皿分段是医生用于描述病人中癌症状态如何发展的方法。分段协助医生确定预测、计划治疗和评估治疗的结果。分段系统根据癌症种类变化，但一般包括下列"TNM"系统肿瘤类型，用T表示；癌症是否转移至邻近淋巴结，用N表示；癌症是否转移至体内更远的部分，用M表示。通常，如果癌症仅在主要损伤区域可检测而没有扩散到任何淋巴结，称为阶段I。如果只扩散到最近的淋巴结，称为阶段II。在阶段II中，癌症一般扩散到主要损伤位置附近。癌症扩散到体内较远的部分，如肝脏、骨、脑或其它位置，是阶段iv，最高级的阶段。TTK的不同表达水平可促进分段方法精细调整，通过鉴定癌症侵入性的标记，如转移潜力，和存在于身体不同区域。因此，处于阶段II的癌症有大为不同的TTK表达水平，可表示有高转移潜力的癌症并可用于改变阶段II肿瘤的界限为阶段III肿瘤，证明需要更具侵入性的治疗。划为癌症等级分级是用于描沭肿瘤有多类似相同类型的iH常组织的术语。肿瘤显微镜下的外形用于在参数的基础上鉴定肿瘤级别，如细胞形态、细胞组织和其它分化标记。作为一般原则，肿瘤的级别与它的生长速度或侵入性相当，未分化或高等级肿瘤通常比很好分化或低等级肿瘤更具攻击性。下列指南一般用于划分肿瘤等级1)GX等级不能评估；2)G1很好分化；G2中等较好分化；3)G3分化差；4)G4未分化。TTK活性水平(如表达水平)对确定肿瘤等级特别有价值，因为它们不仅能帮助确定肿瘤细胞的不同状况，它们也可鉴定除了分化对确定肿瘤攻击性有价值的因素，如转移潜力。结肠癌的柃测l相应于TTK的多核苷酸和多肽可用于柃测l受试者中的结肠癌。结肠直肠癌症是人类最常见赘生物，也许是遗传性瘤最频繁的形式。预防和早期检测在控制和治疗结肠直肠癌症中是关键因素。结肠直肠癌症开始是息肉，息肉是在结肠内侧形成的小的、良性生长的细胞。过了几年后，一些息肉聚集其它的突变并成为癌症。多种家族性结肠直肠癌症疾病已鉴定，总结如下l)家族性腺瘤息肉病(FAP);2)加德纳综合症；3)遗传性非息肉结肠癌(HNPCC);4)德系犹太人中的家族性结肠直肠癌症。表达适当多肽和多核苷酸可用于诊断、预测和控制结肠直肠癌症。检测直肠癌症可用TTK单独表达水平或结合在结肠癌中不同表达的其它基因的表达水平确定。确定结肠癌的攻击性和/或转移潜力可通过比较TTK水平和与正常细胞相连的水平，比较另一种已知不同表达的序列的总水平，或其它癌症组织的标记，如表达p53、DCC、rat、FAP(例如参见FearonER等，Cell(1990)61(5):759;HamiltonSR等，Cancer(1993)72:957;BodmerW等，NatGenet(1994)4(3):217;FearonER，AnnNYAcadSci.(1995)768:101)或MAPKAP激酶2(SEQID.No.33和34)、MARCKS(SEQID.No.35和36)和/或IGF2(SEQID.No.37和38)。例如，结肠癌的发展可通过测定基因表达的水平检测，基因相应于本文所述的多核苷酸、致癌症基因的水平(如ras)或肿瘤抑制基因(如FAP或p53)。因此特异标记多核苷酸的表达可用于区分正常和癌症结肠组织，区分不同细胞来源的结肠癌，区分具有不同潜在转移速度的结肠癌等。回顾癌症标记，参见，如Hanahan等(2000)Cell100:57-70。乳腺癌的检测l大部分乳腺癌是腺癌亚类，可总结如下1)原位ductal癌症(DCIS)，包括粉剌状癌症；2)渗透(或侵入)ductal癌症(IDC);3)原位小叶癌(LCIS);4)渗透(或侵入)小叶癌(LIC);5)炎性乳腺癌；6)骨髓癌症；7)粘蛋白癌症；8)乳头佩吉特病；9)叶状柄癌症；10)管状癌症。TTK表达水平可用于诊断和控制乳腺癌，以及区分乳腺癌的类型。检测乳腺癌可用TTK表达水平确定，TTK单独表达或结合已知在乳腺癌中不同表达的其它基因的表达。确定乳腺癌的攻击性和/或转移潜力也可通过比较TTK水平和比较在癌症组织中另一种已知变化的序列的水平，如ER表达。此外，乳腺癌的发展可通过测定TTK表达相对甾类激素(如睾丸激素或雌激素)水平或其它激素(如生长激素、胰岛素)的比例检测。因此，特异标记多核苷酸和多肽的表达可用于区分正常和癌症的胸组织，区分不同细胞来源的乳腺癌，区分具有不同潜在转移速度的乳腺癌等。检测方法本领域已知的一些用于分析来自个体的生物样品的方法增加TTK基因产物的表达(如RNA或蛋白质)，通过检测来自受试者生物样品的TTK基因产物。如先前所讨论，这种分析的目的可用于诊断，检测现有癌症的存在，帮助鉴别癌症类型，协助医生确定癌症的严重性或可能的发展，和/或最优化治疗癌症。在具体非限制的实施方案中，方法有助于检测癌细胞、促进诊断受试者的癌症和癌症的严重性(如肿瘤等级、肿瘤负担等)、促进确定受试者的预测和评估受试者对治疗的反应(如提供测定治疗效果，通过如评估化疗中或之后的肿瘤负担)。在另外的实施方案中，方法有助于分类或分层癌细胞，如用于选择病人加入临床试验人群，用于选择适当治疗(根据癌细胞表达分布选择治疗)等。试剂盒检测方法可提供作为试剂盒的一部分。因此，发明进一步提供检测TTK活性存在和/或水平的试剂盒，如在生物样品中，检测TTK-编码mRNA和/或从而编码的多肽或者测定TTK活性。用这些试剂盒的过程可由临床实验室、实验性实验室、医学实践者或私人进行。发明用于检测癌细胞中不同表达的TTK多肽的试剂盒包括特异性结合多肽的部分，可以是特异的抗体。发明用于检测癌细胞中不同表达的TTK-编码多核苷酸的试剂盒包括于多核苷酸特异性杂交的部分，如引物。发明检测TTK活性的试剂盒包括能被TTK磷酸化的受体底物，和标记供体底物。试剂盒可随意提供其它在操作过程中有用的成分，包括但不限于缓冲液、展开齐U、标记、反应表面、检测方法、对照样品、标准、说明和解释信息。筛诜TTK核酸或多肽检测TTK活性的方法包括筛选表现表达的TTK基因或其等位基因的TTK核酸序列的存在，检测TTK多肽。方法使用来自个体的生物样品，这些个体怀疑含核酸序列或多肽。生物样品的例子包括血液、血浆、血清、组织样品、肿瘤样品、唾液和尿。检测TTK核酸或多肽的示例方法包括(a)确定TTK基因编码的多肽的存在；(b)使用能结合TTK核酸序列(如一种已知互补序列)的特异性结合成分，特异性结合成分包括在严紧条件下与TTK序列杂交的核酸(c)使用物质包括对TTK核酸序列或其编码的多肽有特异性的抗体结构域，用于检测特异性结合成分到其结合伴侣的被标记特异性结合成分是可检测的；(d)使用包括一种或更多引物的PCR确定来自病人样品的TTK相对水平；(e)使用TTK活性试验，如TTK底物的磷酸化。确定TTK水平包括正常TTK和/或TTK变体形式的水平。基因的一种变体形式可包含与野生型序列相比一个或更多插入、缺失、置换和/或加入一个或更多核苷，也许改变或也许没有改变基因功能。由于遗传密码的简并性，核酸水平的区别不必然反映在编码多肽的氨基酸序列的不同。然而，基因突变或其它不同可导致移框或终止密码子，可严重影响产生多肽(如果有)的性质，或者编码多肽的点突变或总体突变变化，包括在多肽中插入、缺失、置换和/或加入一个或更多氨基酸区域。启动子序列或其它调控区域的突变可改变(如减少或提高)来自基因的表达或影响mRNA转录物的加工或稳定性。有许多方法用于在试验样品中检测具体核酸序列。试验可在含mRNA或cDNA的制品中进行，mRNA或cDNA以反映样品中mRNA转录物相对水平的方式产生于分离的mRNA。RNA水平可确定特异扩增反应如使用一对或更多引物PCR，可用于扩增核酸区域，优选的是与其它基因同源性较少的区域。用于试验的核酸可从细胞中取出的核酸中制备，或在使用许多其它技术如限制性酶消化和电泳的库中制备。核酸可用TTK-特异探针筛选。这种探针在序列上相应于TTK基因区域或它的互补区域。在严谨条件下，这种探针与试验核酸的特异杂交指示在样品中存在TTK核酸。为了有效筛选的目的，超过一种的探针可用于相同的试验样品。探针可包含少到15、20、50或100SEQID.No.13的TTK基因的核苷，或可长达500、lkb或者长度为3.8kb或更长。如果序列在试验样品中存在，等位基因_或变体_特异寡核苷酸可类似地用于PCR以特异扩增具体序列。评估PCR带是否含基因变体可采用本领域技术人员熟悉的一些方法。PCR产物可，例如以使其在变性聚丙烯酰胺DNA序列胶上呈现突变或多态性的方法处理，特异的带连接选定的基因变体。这可同时或连续进行以确定正常TTK序列的水平，如确定总TTK的结合水平。在启动子或其它调节序列中没有损伤也可通过确定转录产生的mRNA水平或从mRNA翻译产生的多肽水平来评估。核酸分子序列中存在不同可用限制性酶消化的方法检测，如在DNA指纹分析方法中，当一种或更多限制性酶用于切割核酸样品时，比较产生的限制图谱和获得自含正常基因或变体或等位基因的样品的图谱，样品用同样的酶或几种酶消化。可提供核酸的试验样品，例如从细胞中提取核酸，如来自肿瘤活组织检查的细胞。柃测TTK多肽有许多确定试验样品中存在或没有TTK多肽的方法。可测试样品是否存在特异性结合成分如抗体(或抗体混合物)的结合伴侣，特异于野生型TTK和/或一种或更多TTK多肽的具体变体(如等位基因变体)。在这些情况中，可在适当条件下使特异性结合成分如抗体与样品特异性结合来进行试验。当使用一组抗体时，不同报告标记可用于每种抗体，从而可确定每种抗体的结合。除了用抗TTK抗体检测TTK多肽，TTK多肽也可用TTK-特异活性试验鉴定。试验结合剂(如抗体或核酸序列)也可固定在小的不连续的位置和/或如固体支持物或诊断芯片上的阵列。这些方法有具体价值，因为它们可提供大灵敏性，具体通过使用荧光标记反应物，仅需非常少量的来自试验个体的生物样品且允许多种不同试验同时进行。后一种优势是有用的，因为它提供了与TTK试验协作的不同蛋白质(如致癌症基因或肿瘤抑制物)的试验。因此，本发明进一方面提供了固定于一种或更多结合剂的支持物或诊断芯片，结合剂能特异性结合TTK核酸或多肽，随意结合其它进行试验需要的反应物。TTK多肽表达的方法TTK编码的全长或部分多肽可在任何表达系统中表达，包括例如细菌、酵母、昆虫、两栖动物和哺乳动物系统。合适载体和宿主细胞描述于美国专利号5，654，173。用标准重组DNA技术纯化合适的多核苷酸构建物，技术描述于，例如Sambrook等，(1989)分子克隆实验室手册，第二版。(冷泉港出版社，ColdSpring，纽约)，遵循现有的规则描述于美国NHS部门，国家卫生研究所(NIH)重组DNA研究指南。细菌的表达系统包括那些描述于Chang等，Nature(1978)275:615，Goeddel等，Nature(1979)281:544，Goeddel等，NucleicAcidsRes.(1980)8:4057;EP0036，776，美国专利号4，551，433，DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)(1983)80:21-25和Siebenlist等，Cell(1980)20:269。監度酵母的表达系统包括那些描述于Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)(1978)75:1929;Ito等，J.Bacteriol.(1983)153:163;Kurtz等，Mol.Cell.Biol.(1986)6:142;Kurtz等，J.BasicMicrobiol.(1985)25:141;Gleeson等，J.Gen.Microbiol.(1986)132:3459，Roggenkamp等，Mol.Gen.Genet.(1986)202:302)Das等，J.Bacteriol.(1984)158:1165;DeLouven固rt等，J.Bacteriol.(1983)154:737，VandenBerg等，Bio/Technology(1990)8:135;Kurtz等，J.BasicMicrobiol.(1985)25:141;Cregg等，Mol.Cell.Biol.(1985)5:3376，美国专利号4，837，148和4，929，555;Beach和Nurse，Nature(1981)300:706;Davidow等，Curr.Genet.(1985)10:380，Gallardin等，Curr.Genet.(1985)10:49，Balance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)112:284-289;Tilburn等，Gene(1983)26:205—221，Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)(1984)81:1470-1474，Kelly和Hynes，EMBOJ.(1985)4:475479;EP0244,234和WO91/00357。昆虫细胞昆虫中异源基因的表达如美国专利号4，745，051，Friesen等(1986)"杆状病毒基因表达的调控"收录于杆状病毒的分子生物(W.Doerfler编)，EP0155，476，和Vlak等，J.Gen.Virol.(1988)69:765-776，Miller等，Ann.Rev.Microbiol.(1998)42:177，Carbonell等，Gene(1988)73:409，Maeda等，Nature(1985)315:592-594，Lebacq-Verheyden等，Mol.Cell.Biol.(1988)8:3129;Smith等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)(1985)82:8404，Miyajima等，Gene(1987)58:273;Martin等，DNA(1988)7:99中所述获得。许多杆状病毒株和变体和来自宿主的相应允许的昆虫宿主细胞，描述于Luckow等，Bio/Technology(1988)6:47-55;Miller等，GenericEngineering(Setlow，J.K等编)，第8巻(PlenumPublishing,1986)，pp.277—279，Maeda等，Nature(1985)315:592—594。哺乳动物细胞哺乳动物表达如Dijkema等，EMBOJ.(1985)4:761，Gorman等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)(1982)79:6777，Boshart等，Cell.(1985)41:521和美国专利号4，399，216中所述获得。哺乳动物表达的其它特征如Ham和Wallace,Meth.Enz.(1979)58:44，Barnes和Sato，Anal.Biochem.(1980)102:255，美国专利号4，767，704、4，657，866、4，927，762、4，560，655、W090/103430，W087/00195和美国RE30，985中所述促进。鉴定化疗剂的筛选试验发明也包括鉴别调节TTK活性试剂的筛选试验，在受侵入的细胞中特异性地降低异常TTK活性，如TTK不同表达的癌症或前癌细胞。这些试验可在体外或体内进行。候选试剂如本文所用，术语"试剂"描述任何能改变不同表达基因的基因产物的表达或生理功能的分子。一般，试验混合物的集合用不同试剂浓度平行进行以获得对不同浓度的不同反应。通常，这些浓度中的一种作为阴性对照，即零浓度或低于检测水平。候选试剂涵盖许多化学种类，包括但不限于有机分子(如具有大于50和小于约2，500道尔顿分子量的小的有机化合物)、肽、单克隆抗体、反义多核苷酸和核酶等。候选试剂可包括与蛋白质结构上相互作用必需的功能基团，具体是氢键，通常包括至少一个氨基、羰基、羟基或羧基基团，优选的是至少2种功能化学基团。候选试剂通常包括碳环或杂环结构和/或芳香族或者用一个或更多上述功能基团置换的聚芳香族结构。候选试剂也在生物分子中发现，包括但不限于多核苷酸、肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。候选试剂从多种来源获得，包括合成或天然化合物的库。例如，许多方法可用于随机和定向合成多种有机化合物及生物分子，包含随机寡核苷酸和寡肽的表达。另外，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的库已可使用或生产。另外，天然或合成产生的库和化合物通过常规化学、物理和生化方法修饰，可用于产生组合库。已知的药理试剂可进行定向或随机化学修饰，如酰化、烷化、酯化、酰胺化等，来生成机构类似物。候选试剂可评估TTK活性的调节，或单独或集中。体外筛选候选试剂多种体外试验可用于筛选候选试剂获得理想生物活性，包括但不限于，体外标记蛋白质_蛋白质结合分析、蛋白质-DNA结合分析(如鉴定影响表达的试剂)、电泳迁移率变动分子、蛋白质结合的免疫分析等。例如，通过提供大量不同表达多肽的生成，可鉴定结合的配体或底物，调节或模拟多肽的作用。鉴别这些配体和底物进一步的方法在下面提供。纯化的多肽也可用于确定3维环状结构，用作模拟分子内相互作用、转录调控等。筛选试验是结合试验，其中一个或更多分子可结合标记，标记直接或间接提供可检测的信号。不同的标记包括放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、特异性结合分子、粒子如磁性粒子等。特异性结合分子包括配对如生物素和链霉抗生物素蛋白、地高辛和抗地高辛等。对特异性结合成分，互补成分通常用提供检测的分子标记，根据已知操作过程。多种其它可包括在本文所述的筛选试验中。当试验是结合试验时，包含的反应物像盐、中性蛋白质，如用于促进最佳蛋白质_蛋白质结合、蛋白质-DNA结合和/或减少非特异性或背景相互反应的清蛋白、洗涤剂等。可使用提高试验效果的反应物，如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。成分的混合物以提供必需结合的顺序加入。在适当温度进行培育，通常在4和4(TC之间。选择最佳活性的培育时间，但也可最优化以促进快速高通量筛选。一般0.1和1小时之间足够。许多哺乳动物基因在酵母和低等动物中有同系物。这些同系物生理作用和与其它蛋白质体内或体外相互作用的研究可推动理解生物功能。除了以遗传互补为基础的模式系统，酵母显示成为研究蛋白质_蛋白质相互作用的有力工具，通过描述于Chien等，1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1984)88:9578-9582的双杂交系统。体内筛选候选试剂候选试剂可在非人的动物癌症模型中筛选(如在注射癌细胞的动物中；在用于改变不同表达基因的表达的转基因动物中，如本文所述，例如，转基因"敲除"、或转基因"敲入"、编码所有或部分不同表达基因产物且包括可操作连接报告基因的多核苷等)，—般，候选试剂给药于动物，确定候选试剂的效果。候选试剂可以理想和/或合适传送试剂的方式给药，以产生所需结果。例如，候选试剂可通过注射(如静脉内、肌肉、皮下注射，或直接注入待获得所需效果的组织)、口服或其它理想方式给药。通常，体内筛选包括一些接受不同量和浓度候选试剂的动物(从没有试剂到可成功传送给动物上限量的试剂量)，可包括以不同配方传送试剂。试剂可单独或结合两种或更多给药，特别是当试剂组合给药产生协同作用时。试剂给药对转基因动物的效果可通过评估基因产物表达、被注射的肿瘤细胞的生长等监控。鉴定的候选试剂具有所需药理活性的化合物可在生理学可接受运载体中给药于宿主，通过调节不同表达基因产物的表达用于治疗可作用的情况。治疗试剂可以多种方式给药，口头、局部、肠胃外，如皮下、腹膜内、病毒感染、血管内等。口头和吸入治疗有具体的兴趣。取决于导入的方式，化合物可以多种方法配制。配方中治疗活性化合物的浓度变化从约0.l_100wt%。治疗试剂在治疗过程中可以单剂量或多剂量给药。药物组合物可以不同形式制备，如颗粒、片剂、药丸、栓剂、胶囊、药膏、洗液等。药物等级有机或无机运载体和/或适于口头和局部使用的稀释液，可用于构成含治疗活性化合物的组合物。本领域已知的稀释液包括含水介质、植物和动物油和脂肪。用于不同渗透压的稳定齐U、润湿剂和乳化齐U、盐类或者用于维持适当PH值的缓冲液，及皮肤渗透增加剂可用作佐剂。筛诜调节TTK活件的药物的方法根据本发明的TTK多肽或TTK-编码核酸可用于筛选影响或调解TTK活性或功能的分子。这些分子对治疗和/或预防有用。筛选潜在有助于治疗或预防癌症的物质的方法由本发明提供。一般，发明的方法促进鉴定TTK活性的调节物(如通过调节TTK多肽或其它TTK基因产物的活性，或通过基因产物的靶向活性影响TTK活性，基因产物作用于引起TTK活性的级联反应中TTK上游或下游)，使用降低一般特别感兴趣的TTK活性的试剂。鉴别为TTK活性调节物的物质在抵抗癌症中表现出发展，因为它们为设计和研究用于体内的药物提供了基础。筛选调节多肽活性物质的方法包括在合适反应培养基中使一种或更多试验物质接触多肽，测试处理多肽的活性(如磷酸化其底物的能力)并比较此活性和未用一种或几种试验物质处理的对比反应培养基中多肽的活性。处理和未处理多肽间活性的不同指示相关的一种或几种试验物质的调节效果。结合库技术提供测试潜在巨大数量的不同物质的有效方法，用于调节多肽活性。这些库和它们的使用在本领域已知。使用肽文库优选。试验物质也可根据与多肽相互作用筛选，如在酵母双杂交系统中。这可在测试物质调节多肽活性的实际能力前用作粗略筛选。另外，筛选可用于筛选试验物质结合TTK特异性结合伴侣。鉴定为用作TTK多肽功能调节物的物质本质可以是肽或非肽。非肽"小分子"通常在许多体内药物使用中优选。因此，物质的拟似物和模拟物(具体如果是肽)可按药物使用设计。TTK活性分析TTK活性可用本领域已知的适当激酶试验测定。例如，不通过限制的方法，可使用的方法描述于Hogg等(Oncogene19949:98-86)，Mills等(J.Biol.Chem.1992267:16000-006)禾口Tomizawa等2001(FEBSLett.2001492:221-7)，Schmandt等，(J.Immunol.1994,152:96-105)。此外，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶试验描述于Ausubel等(分子生物的简要操作，1997，17.6单元)。TTK分析一般使用TTK多肽、标记供体底物和TTK特异或非特异的受体底物。在这些试验中，TTK从供体底物转移标记部分到受体底物，激酶活性通过从供体底物转移到受体底物的标记部分的量测定。TTK多肽可用如上详述的不同表达系统生成，从细胞中纯化，以裂开或未裂开的重组融合蛋白形式且有非TTK多肽序列，例如在其N-或C-末端的His标记或13-半乳糖苷酶。如果癌细胞系用作待分析的TTK的来源，TTK活性可在癌细胞系中分析。用于TTK分析的适当供体底物包括易受TTK脱磷酸化影响的分子，包含Y_标记的ATP和ATP类似物，其中标记是33P、32P、35S或其它放射性同位素或合适荧光标记。用于TTK分析的适当受体底物包括易受TTK磷酸化影响的多肽或其它分子。受体底物通常来自体内TTK靶的片断。受体底物片断可以是8到50个氨基酸长度，大多是10到30氨基酸，优选的是约10、12、15、18、20和25个氨基酸长度。进一步的TTK受体底物可用一批不同多肽或其它分子根据经验确定。适于TTK分析的TTK耙包括tau和cdc25。一旦反应进行，TTK受体底物通常能从反应的其它成分中纯化。纯化常常通过分子相互作用完成，其中受体底物通过与链霉抗生物素蛋白相互作用进行生物素化和纯化，或存在可特异识别受体底物的特异抗体。反应可在多种条件下进行，如在固体支持物上、在胶中、在溶液中或活细胞中。TTK磷酸化的一种示例受体底物是SEQIDNO:26的人蛋白质cdc25，TTK在氨基酸位置214和216的丝氨酸残基磷酸化。cdc25的两个片断用作下面所述的激酶试验中的底物。这些片断包括肽A(SEQIDN0:27)，相应于cdc25多肽的209至lj225氨基酸，或者肽B(SEQIDNO:28)相应于cdc25多肽的210到223氨基酸。在此分析中，使用两种生物素化的多肽，包括SEQIDNO:27(生物素-SGSGSGLYRSPSMPENLNRPR-NH2)或SEQIDN0:28(生物素-GGGGLYRSPSMPENLNRK-OH。选择检测方法取决于用作供体分子的标记类型，可包括例如用放射能照像、闪烁、扫描或荧光图象摄影测定掺入的放射或荧光。翻月中齡K織W台e服隨去发明进一步提供减少癌细胞生长的方法，具体是乳腺或结肠癌细胞。一般，方法包括使以相对正常细胞异常的水平表达TTK的癌细胞接触一种物质，这种物质可(1)调节TTK的表达，通常减少TTK表达(如相应于TTK的反义多核苷酸)；或(2)另外在具有异常TTK活性的癌细胞中调节，通常减少TTK多肽水平和/或TTK活性。"降低癌细胞生长"，包括但不限于，减少癌细胞增值和降低正常细胞发展癌症表型或形态的发生率。癌细胞生长是否得到降低可用任何已知试验确定，包括但不限于，[3H]_胸苷掺入；计数一段时间的细胞数量；检测、测定与结肠癌相联系的标记(如CEA、CA19-9和LASA)和/或本领域熟知的用于评估肿瘤负担的方法。本发明提供治疗癌症(具体是乳腺和结肠癌或与异常高的TTK活性相联的其它癌症)的方法，方法一般包括将试剂给药于个体，试剂以降低癌细胞生长以治疗癌症的足够的量来减少TTK活性。物质或物质的具体量是否有效治疗癌症可用多种已知诊断试验中任一种评估，如在结肠癌的情况中，S状结肠镜、直肠镜、直肠检测、用活组织检查的结肠镜、对比放射显影研究、CAT扫描、血管照相术和检测在个体血液中与结肠癌相关的肿瘤标记。物质可全身或局部给药。因此，在一些实施方案中，物质局部给药，结肠癌生长在给药位置减少。局部给药对治疗有用，如实体瘤。在一种实施方案中，发明特征为作为反义多核苷酸且降低TTK活性的多核苷酸。反义TTK多核苷酸一般包括至少约20到3000个核苷的多核苷酸，通常至少约20到1000个核苷且更常见的是至少约8到50个核苷，优选的是约26、20、18、17、15、10个核苷。示例TTK多核苷酸提供于实施例和SEQIDN0:l-12中，尽管SEQIDNO:13的任何反义片断足够。根据表达分布选择治疗。例如，如果病人的肿瘤表明肿瘤产生相对于正常细胞异常的高水平TTK，然后选择在治疗如TTK-表达肿瘤中有效的药物，用于治疗该病人。药物组合物发明的药物组合物可包括治疗有效量的多肽、抗体、多核苷酸(包含反义核苷和核酶)或者小分子或其它鉴定为调节TTK活性的化合物，优选降低TTK活性。如本文所用，术语"治疗有效量"指治疗、改进或预防目标疾病或情况的治疗试剂的量，或者表现出可检测的治疗或预防效果的量。效果可检测，如通过化学标记或抗原水平。治疗效果也包括减少身体症状如降低的血液温度，和/或对减少受试者肿瘤负担的效果(如肿瘤大小减少或抑制肿瘤生长)。用于受试者精确有效的量取决于受试者的大小和健康、情况的性质和程度、给药选择的治疗或治疗组合。因此，预先指定精确的有效量没有用。然而，特定情形的有效量由常规实验确定且处于临床医生的判断中。为了本发明的目的，一般给药个体中的有玄女齐U量/人约0.01mg/kg至lj50mg/kg或0.05mg/kg至lj10mg/kgDNA构建净勿。药物组合物也包含药物可接受运载体。术语"药物可接受运载体"指给药治疗试剂的运载体，如抗体或多肽、基因和其它治疗试剂。术语指本身不诱导有害接受组合物的个体的抗体产生的任何药物运载体，可无不适当毒性地给药。合适运载体可以是大、缓慢代谢的大分子如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活病毒颗粒。这些运载体为本领域普通技术人员熟知。治疗组合物中的药物可接受运载体包括液体如水、盐水、甘油和乙醇。辅佐物质也可存在于这些载体中，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，治疗组合物制备成可注射的，或液体溶液或悬浮液；适于溶液或悬浮液中的固体形式，注射前也可准备液体载体。脂质体包含在药物可接受运载体的定义中。药物可接受运载盐类也可存在于药物组合物中，例如无机酸盐类如氢氯化物、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；有机酸盐类如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸、安息香酸盐等。关于药物可接受赋形剂的充分讨论在雷明顿药物科学(MarkPub.Co.，N.J.1991)中。运载体或其它材料的精确性质取决于给药途径，如口头、静脉内、皮肤或皮下、鼻、肌肉、腹膜内途径。口头给药的药物组合物可以片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可包括固体运载体如凝胶或佐剂。液体药物组合物一般包括液体运载体如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或乙二醇如乙二醇、乙二醇或聚乙烯。对于静脉内、皮肤或皮下注射，或注射在疼痛位置，活性组分以肠胃外可接受水溶液的形式，有适当pH、等渗性和稳定性。适当溶液，例如，随意包含但不限于等渗载体如氯化钠、防腐齐U、稳定齐U、缓冲液、抗氧化剂和/或其它所需添加剂。药物给药以预防有效的量或治疗有效的量给药。给药的实际量、给药速度和时程取决于在治疗者的性质和严重性。剂量等的决定可由本领域技术人员在所示方法的基础上确定，通常考虑待治疗的紊乱、各病人的情况、传送的位置、给药方法和其它实践者已知的因素。先前提过的技术和操作的例子可发现于雷明顿药物科学，第16版，0sol，，A.(编)，1980。另外，靶向治疗通过使用靶向系统如抗体或细胞特异配体，可用于更特异地传送活性试剂到某些种类的细胞。靶向出于多种原因是理想的；例如如果试剂是不可接受的毒性，或如果另外需要过高的剂量，或如果另外不能进入靶细胞。靶向可获得，例如给药受试者药物-抗体复合物，其中抗体特异于癌症-相联抗原，且药物降低癌细胞生长。靶向可通过偶联获得(如连接，直接或通过连接分子，或共价或非共价，以形成药物_抗体复合物)药物到特异于癌症_相联抗原的抗体。偶联药物到抗体的方法在本领域熟知，不需要在本文中详细阐述。药物试剂也可通过导入细胞的编码基因的表达在靶细胞中产生，如在病毒或脂质体载体。载体可靶向待治疗的具体细胞，或者它可包含调节元件，元件由靶细胞或多或少打开。另外，试剂可以前体的形式给药，通过产生的活化试剂转化成活性形式，或靶向待治疗的细胞。组合物可单独或结合其它治疗给药，或同时或继续取决于待治疗的情况。肝辦,送诚—旦配制，发明的组合物或用发明的方法鉴定的组合物可直接给药于受试者(如作为多核苷酸或多肽)。直接传送组合物一般可通过肠胃外注射达到，如皮下、腹膜内、静脉内或肌肉、肿瘤内或组织间隙。给药的其它方式包括口头和肺部给药、栓剂、和经皮给药、针、和基因枪或无针注射器。剂量治疗可以是单剂量或多剂量安排。—旦发现相应于发明的多核苷酸的基因与增生紊乱相关，如赘生物、发育异常和增生，紊乱可通过给药治疗试剂接受治疗，治疗试剂以提供的多核苷酸、相应的多肽或其它相应的分子(如反义、核酶等)为基础。给药的剂量和方式在治疗组合物的具体性质，病人的情况、年龄和重量，疾病的发展和其它相关因素的基础上确定。例如，给药发明的多核苷酸治疗组合物试剂包括局部或全身给药，包含注射、口头给药、粒子枪或导管插入给药和局部给药。优选的是治疗多核苷酸组合物包含表达构建物，此构建物包括可操作地连接于含至少12、15、17、18、22、25、30或35个本文所示多核苷酸的邻近核苷的多核苷酸的启动子。可使用不同的方法直接给药治疗组合物到身体的具体位置。例如，定位一个小的转移性损伤且在肿瘤体内几个不同位置注射几次治疗组合物。另外，鉴定为肿瘤服务的动脉，注射治疗组合物到这种动脉中，以传送治疗组合物到肿瘤中。有坏死中心的肿瘤被抽出并将组合物直接注入肿瘤目前空的中心。反义组合物直接给药于肿瘤表面，例如，通过局部使用组合物。X射线用于协助某些上述传送方法。也可使用受体调节靶向传送治疗组合物，治疗组合物包含反义多核苷酸、次基因组多核苷酸或具体组织的抗体。受体调节DNA传送技术描述于，如Findeis等，TrendsBiotechnol.(1993)11:202;Chiou等，GeneTher即eutics:直接基因转移的方法和应用(MethodsAndApplicationsofDirectGeneTransfer)(J.A.Wolff编)(1994);Wu等，J.Biol.Chem.(1988)263:621;Wu等，J.Biol.Chem.(1994)269:542;Zenke等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)(1990)87:3655;Wu等，J.Biol.Chem.(1991)266:338。含多核苷酸的治疗组合物以从约100ng到约200mgDNA的范围给药，用于基因治疗操作中的局部给药。约500ng到约50mg、约1iig到约2mg、约5iig到约500iig和约20iig到约100iigDNA的范围也可用于基因治疗操作中。因素如作用的方法(例如提高或抑制编码的基因产物的水平)和转化效果和表达是要考虑的，会影响反义次基因组多核苷酸最终效果所需的剂量。当更大区域组织需要更大表达时，在连续的给药操作中重新给药更大量的反义次基因组多核苷酸或相同量，或者几次给药于不同的邻近或接近的组织部分，例如也许需要肿瘤位置以产生积极的治疗效果。对于编码多肽或具抗炎症活性的蛋白质的多核苷酸相关基因，适当的使用、剂量和给药描述于USPN5，654，173。本发明的治疗多核苷酸和多肽可用基因传送载体传送。基因传送载体可以是病毒或非病毒来源(一般可参见Jolly，CancerGeneTherapy(1994)1:51;Kimura，H丽nGeneTherapy(1994)5:845;Co騰lly，HumanGeneTherapy(1995)1:185;禾口Kaplitt，NatureGenetics(1994)6:148)。这些编码序列的表达可用内源哺乳动物或异源启动子诱导。这些编码序列的表达或是组成型或是调节型。以病毒为基础的传送所需多核苷酸的载体和在所需细胞中的表达在本领域熟知。示例以病毒为基础的载体，包括但不限于，重组反转录病毒(例如参见W090/07936;WO94/03622;WO93/25698;WO93/23234;USPN5，219，740;WO93/11230;USPN4，777，127;GB专利号2，200，651;EP0345242;和WO91/02805)，以甲病毒属为基础的载体(如辛德比斯病毒载体、Semliki森林病毒(Semlikiforestvirus)(ATCCVR-67;ATCCVR-1247)、罗斯河病毒(ATCCVR-373;ATCCVR-1246)和委内瑞拉马病毒(ATCCVR_923、ATCCVR-1250、ATCCVR1249;ATCCVR-532)，腺伴随病毒(AAV)载体(例如参见WO94/12649，WO93/03769;WO93/19191;W094/28938;WO95/11984和WO95/00655)。连接于杀死的腺病毒的DNA的给药如Curiel，Hum.GenTher.(1992)3:147中所述，也可使用。非病毒传送载体和方法也可使用，包括但不限于，单独连接或未连接于杀死的腺病毒的聚阳离子凝聚DNA(例如参见Curiel，Hum.GenTher.(1992)3:147);配体-连接DNA(例如参见Wu，J.Biol.Chem.(1989)264:16985);真核细胞传送载体细胞(例如参见USPN5，814，482;W095/07994;WO96/17072;WO95/30763;和WO97/42338)和核电荷中性或与细胞膜融合。裸露DNA也可使用。示例裸露DNA导入方法描述于WO90/11092和USPN5,580,859。作为基因传送载体的脂质体描述于USPN5，422，120;WO95/13796;WO94/23697;WO91/14445;和EP0524968。其它方法描述书Philip,Mol.Cell.Biol.(1994)14:2411和Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91:1581。更多适合使用的非病毒传送载体包括机械传送系统如描述在Woffendin，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91(24):11581中的方法。此外，编码序列和这种表达产物可通过沉积光聚合水凝胶材料或使用电离辐射传送(例如可参见USPN5，206，152和WO92/11033)。其它用于传送编码序列的基因传送的常规方法包括，例如使用手控基因转移粒子枪(例如可参见USPN5，149，655);使用活化转移的基因的电离辐射(例如可参见USPN5，206，152和WO92/11033)。作为使用病毒载体的替代，导入核酸到细胞中的其它已知方法包括电穿孔、磷酸钙共沉淀、机械技术如微量注射、脂质体调节的转移和直接DNA吸收和受体-调节DNA转移。选择性靶向TTK核酸至受影响的细胞类型的基因转移技术优选。这种例子包括受体-调节基因转移，其中核酸通过聚赖氨酸连接于蛋白质配体，配体特异于在靶细胞表面存在的受体。筛选影响TTK表达物质本发明也提供了在筛选调节启动子活性和增加或减少TTK表达的物质的方法中，所有或部分TTK启动子和/或增强子区域的核酸序列的使用。可进行此试验以鉴别用于治疗和/或预防目的的抗癌症试剂。启动子活性水平，如起始转录的能力，可定量如通过评估启动子转录产生的mRNA的量或通过评估启动子转录产生的mRNA翻译生成的蛋白质产物的量。表达系统中存在的具体mRNA的量可确定，如使用能与mRNA杂交的具体寡核苷酸，寡核苷酸标记或可用于具体扩增反应入PCR。报告基因的使用通过参考蛋白质生成促进确定启动子活性。—般，在TTK启动子和/或增强子控制下的报告基因可转录成mRNA，mRNA可翻译成可检测并在表达后优选定量的肽或多肽产物。报告基因优选编码催化产生可检测信号反应的酶，优选视觉可检测信号如有色的产物。许多例子已知，包括P-半乳糖苷酶和荧光素酶。P-半乳糖苷酶的可通过在底物上产生蓝色来分析，分析用肉眼或使用分光光度计来测定吸光率。例如荧光作为荧光素酶活性的结果产生，可用分光光度计定量。可使用放射性分析，如用choloramphenicol乙酰转移酶，它也可在非放射性分析中使用。来自报告基因表达的基因产物的存在和/或量可用能结合产物的分子确定，如抗体或其片断。结合分子可用任何标准技术直接或间接标记。本领域技术人员熟知多种可能的报告基因和分析技术，这些技术可用于根据目前所示的技术确定基因活性。可使用任何适当的报告/分析且本发明打算涵盖这些系统。鉴别调解或影响启动子活性的物质后，物质可进一步研究。此外，它可生产和/或用于制备，即生产或配置组合物如药剂、药物组合物或药物。総赫復良碰样品中的TTK水平可用于综合疾病信息系统以协助分析如建议病人干涉、设计临床试验、进行药物经济(pharmacoeconomic)分析和图解不同病人一段时间的疾病发展。例如，根据发明的方法确定的TTK信息可用于系统如描述于美国专利号6，108,635Herren等在2000年8月22日发表。这个系统可收集给予多个位置病人的医学治疗的结果。例如参见美国专利号5，713，350Yokota等在1998年2月3日发表。实施例提出下列实施例以提供本领域技术人员关于如何获得和使用本发明的完整阐述和描述，不打算限制发明者认为他们是发明的范围，也不想声称下面的实验是所有或仅有的进行的实验。做了努力来确保关于使用数量的精确性(如量、温度等)但一些实验误差和偏差应该予以考虑。除非另外说明，部分是重量份数，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。实施例1:病人组织样品的来源用激光捕获显微解剖(LCM)技术从病人中收集正常和癌症组织，技术在本领域熟知(例如参见0hyama等(2000)Biotechniques29:530-6;Curran等，(2000)Mol.Pathol.53:64-8;Suarez-Quian等(1999)Biotechniques26:328-35;Simone等(1998)TrendsGenet14:272-6;Conia等(1997)J.Clin.Lab.Anal.11:2838;E騰rt-Buck等(1996)Science274:998-1001)。表1(插入实施例最后一页之后)提供了从中分离样品的各个病人的信息，包括病人身份和途径报告ID，为病人设计的数量和用于鉴别目的的病理报告；肿瘤的解剖位置(解剖位置，AnatomicalLoc);主要肿瘤大小；主要肿瘤等级；组织病理学等级；肿瘤侵入的局部位置的描述(局部入侵，LocalInvasion);淋巴结转移的存在(淋巴结转移，LymphNodeMetastasis);淋巴结转移的发生率(以转移阳性淋巴结的数量相对检测淋巴结的数量提供)(淋巴结转移发生率)；局部淋巴结等级；鉴别或检测远离肿瘤位置的转移和它们的位置(远距离转移和位置，DistantMet&Loc);远距离转移的描述(描述远距离转移，DescriptionDistantMet);远距离转移等级(远距离转移等级，DistantMetGrade);关于病人或肿瘤的一般评论(评论，Comments)。任何病人中没有描述腺瘤；腺瘤发育异常(病理学家描述为发育异常)描述于病人身份号695。两个病人中描述了结外延伸，病人身份号784和791。七个病人中描述了淋巴血管入侵，病人身份号128、278、517、534、784、786和791。七个病人中描述了淋巴管侵入，病人身份号52、264、268、392、393、784和791。实施例2:TTK的差异表汰从分离自病人细胞的总RNA中制备的cDNA探针，病人细胞在实施例1中描述。由于LCM提供具体细胞类型的分离以供应显著同源的细胞样品，这提供了类似的纯RNA样品。总RNA首先用含T7RNA聚合酶启动子的引物反转录成cDNA，接着进行第二条DNA链的合成。cDNA随后用T7启动子-调节表达在体外转录以生成反义RNA(例如参见Luo等(1999)NatureMed5:117-122)，然后反义RNA转变成cDNA。第二套cDNAs再次体外转录，用T7启动子来提供反义RNA。随意地，RNA再次转变成cDNA，允许至第三轮的T7-调节扩增以生成更多的反义RNA。因此过程提供了两或三轮体外转录来产生用于荧光标记的最终RNA。荧光探针生成通过首先加入对照RNA导反义RNA混合物，从起始物质的RNA中生成荧光标记cDNA。从肿瘤RNA样品中制备的荧光标记cDNAs与从正常细胞RNA样品中制备的荧光标记cDNAs比较。例如，来自正常细胞的cDNA探针用Cy3荧光颜料(绿色)标记且从肿瘤细胞制备的cDNA探针用Cy5荧光颜料(红色)标记。使用的每个阵列有相同的空间分布和对照点设置。每个微阵列分成两个区域，每个区域在各半边有一列十二组32x12个点，每列总共有约9，216个点。两个区域同样地点样，提供每列至少两种各克隆的重复。点样用从O.5kb到2.Okb的PCR扩增产物进行，用分子动力学基因III点样仪(MolecularDynamicsGenIIIspotter)根据生产商推荐点样。阵列上各个24区域的第一排有约32个对照点，包括4个阴性对照点和8个试验多核苷酸。试验多核苷酸在标记反应前掺入每个样品，用2-600pg/片浓度的范围和l:l的比率。对于每个阵列的设计，两张片与在标记反应中反标记的试验样品杂交。对每个样品，这提供了每个克隆约4次重复测定，两次一种颜色，两次另一种颜色。差异表达分析通过混合来自同一个病人相同量的肿瘤细胞和正常细胞的探针进行。阵列通过6(TC在5XSSC/O.2%SDS/lmMEDTA中培育约2小时进行预杂交，然后用水洗三次并用异丙醇洗两次。阵列预杂交后，接着探针混合物在高严紧条件下(421:在50%甲酰胺、5XSSC和O.2%SDS中过夜)与阵列杂交。杂交后，阵列在55t:如下洗三次1)第一次用IXSSC/0.2%SDS洗；2)第二次用0.IXSSC/0.2%SDS洗；3)第三次用0.IXSSC洗。然后用分子动力学基因III双色激光扫描仪/探测仪(MolecularDynamicsGenIIIdualcolorlaser-scanner/detector)扫描阵列寻找绿色和红色荧光。图像用BioDiscoveryAutogene软件处理，每次扫描的数据设置标准化以提供表达相对于标准的比率。分析微阵列实验的数据，根据的算法描述于美国应用序列号60/252，358,2000年11月20日提交，E.J.Moler、M.A.Boyle和F.M.Randazzo，题目为"cDNA微阵列数据的精度和准确度，，(PrecisionandaccuracyincDNAmicroarraydata)，专禾U申请特另U纟内入本文的参考文献。重复实验，这次用相反的颜色标记2种探针以在两种"颜色方向"中进行分析。每个实验不时用另两张片(每个颜色方向一种)重复。阵列上每种序列的荧光水平以8个来自四列的重复点/基因几何平均数的比率表示，或来自2列或一些其它列的4个重复点/基因。数据用存在于每个重复区的掺入的阳性对照标准化，此标准化的精度包含于各差异显性的最终确定中。各点样的荧光强度也与各重复区的阴性对照比较以确定每个样品中哪些点检测出显著表达水平。荧光强度的数据分析应用于每组重复点样以评估各差别测定的精度和显著性，导致P-值试验零假说，每个病人肿瘤和正常样品间表达水平没有差别。在微阵列最初分析中，如果p>10—3接受假设，那些点的差异比率设为1.000。所有其它点在肿瘤和正常样品间表达有显著不同。如果肿瘤样品有可检测的表达且正常样品没有，比率截在1000，因为正常样品中的表达值为零，该比率是数学上没用的值(如无穷大)。如果正常样品有可检测的表达且肿瘤样品没有，比率截止0.001，因为肿瘤样品中的表达值为零且该比率是数学上没用的值。后两种情况本文称为"开/关"。数据库表用95%置信水平(p>0.05)处理。结肠肿瘤细胞中相对于匹配正常结肠细胞的TTK表达水平的不同，在39X病人中大于或等于2倍(">=2,)，在36%病人中大于或等于2.5倍，在27%检测病人中大于或等于5倍。—些正常组织和肿瘤细胞系的定量PCR，具体是结肠直肠癌细胞系用于分析TTK表达。进行定量实时PCR，首先根据生产商的说明用RocheRNA分离试剂盒(RocheRNAIsolationKit)从细胞中分离RNA。使用一张RNA显微照片合成cDNA的第一条链，用匪LV反转录酶(Ambion)、生产商的缓冲液和推荐浓度的寡dT、核苷和RNA酶抑制剂。cDNA的第一条链作为定量实时PCR的模板，如机器手册推荐使用Roche光周期计(light-cycler)。TTK用正向引物CGGAATCAAGTCTTCTAGCT(SEQIDN0:1)和反向引物GGTTGCTCAAAAGTTGGTATG(SEQIDNO:2)扩增。PCR产物在循环的基础上定量，扩增进入与内部标准比较扩增的线性阶段，使用生产商提供的软件。cDNA的第一条链反应中量或总模板的少许不同用标准化肌动蛋白量消除，肌动蛋白在不同定量PCR反应中扩增，反应用正向引物5'-CGGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3'(SEQIDNO:3)和反向引物5'-TGATCTCCTTCTGCATCCTGTCGG-3'(SEQIDNO:4)。在正常组织中的TTKmRNA水平的结果显示于图1;肿瘤细胞系中TTKmRNA水平的结果显示于图2。分析的细胞系的简述提供在下面的表格中。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>TTK在正常细胞中表达(图l)，用鉴别为最高表达TTK基因的正常组织的胸腺和睾丸。然而，与大部分野生型组织相比，许多癌细胞表现出显著提高水平的TTK表达(图2)。輔你l3:,綠汰数潜對及,膽驗M^来自实施例2的差异表达模式通过应用分等级聚集方法于数据组分析(参见Eisen等(1998)PNAS95:14863-14868)。简而言之，分等级聚集算法以Sokal和Michener(Sokal，RR禾PMichener，CD(1985)Kans.Sci.Bull大学38，1409-1438)的平均连接方法为基础，方法被发展用于聚集相关矩阵。此算法的目的是计算系统树图，将所有要素集合于单一的树中。对任意组n个基因，计算上对角线类似矩阵，矩阵含所有配对基因的相似得分。扫描矩阵以鉴定最高值(代表类似基因配对)。使用这种技术，鉴定了四组差异表达模式并分配给串。将分等级聚集应用于来自实施例2的数据，显示IGF2(胰岛素类似生长因子2)、TTK(细胞周期中包含的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸激酶)、MAPKAPK2(有丝分裂原-活化蛋白质(MAP)激酶_活化蛋白激酶)、和MARCKS(肉豆蔻酰化丙氨酸_丰富C激酶底物，是蛋白激酶C的底物)同时正调节，如检测的33个结肠癌病人样品中的9个中发现的。这些实验的数据存在于图3-6中的图形中。同时正调节说明这些基因共调节，具有增高血清水平的IGF2的病人可以是治疗TTK、MAPKAP激酶2、MARCKS和/或IGF2的候选者。实施例4:TTK表汰的反义调节TTK的其它功能信息用反义敲除技术产生。进一步分析癌细胞中的TTK表达来确定肿瘤发生中基因产物的作用和功能，如在促进转移表型中。设计一些不同的TTKmRNA互补寡核苷酸作为潜在反义寡核苷酸，测试它们抑制TTK表达的能力。每个设计的反义寡核苷酸抑制基因表达的能力通过转染到S怖20结肠直肠癌细胞中测试。对于各转染复合物，运载体分子，lipitoid或cholesteroid优选，制备成水中O.5mM的作用浓度，超声处理以产生均匀溶液，通过0.45iimPVDF膜过滤。然后反义或对照寡核苷酸制备成无菌微孔过滤器水中100mM的作用浓度。寡核苷酸进一步用OptiMEMTM(Gibco/BRL)在microfuge管中稀释至2iiM，或约20iig寡/mlOptiMEM。通常以约1.5-2nmollipitoid/yg量的反义寡核苷酸在单独microfuge管中的lipitoid或cholesteroid，在相同体积的OptiMEM中稀释，OptiMEM用于稀释寡核苷酸。立即加入稀释的lipitoid到稀释的反义寡核苷酸中，并用吸管上下混合。加入寡核苷酸到细胞至30nM的终浓度。靶mRNA(TTK)在转染细胞中的水平用RocheLightCyclerTM实时PCR仪在癌细胞系中定量。耙mRNA的值相对内部对照(如13_肌动蛋白)标准化。对每个20ill反应，提取的RNA置于无菌0.5或1.5mlmicrofuge管中，加入水至12.5总体积。每管加入7.5缓冲液/酶混合物，通过混合(按列出的顺序)2.5illH20、2.0ill10X反应缓冲液、10ii1寡dT(20pmo1)、1.0ii1dNTP混合物(各lOmM)、0.5ii1RNAsin(20u)(Ambion，Inc.，Hialeah，FL)、0.5匪LV反转录酶(50u)(Ambion，Inc.)制备。组分用吸管上下混合，反应混合物在42t:培育1小时。各管的组分在扩增前离心。扩增混合物以下列顺序混合制备1XPCR缓冲液II、3mMMgCl2、140yM各种dNTP、0.175pmol各寡(oligo)U:50，OOOdil绿色SYBR⑧、0.25mg/mlBSA、1单位Taq聚合酶禾口1120至20ii1。(PCR缓冲液II来自Perkin-Elmer，Norwalk，CT以10X浓度存在)。在IX浓度中，它包含10mMTrispH8.3禾口50mMKC1。绿色SYB胸(MolecularProbes,Eugene,OR)是结合双链DNA时发荧光的颜料。随着双链PCR产物在扩增中生成，来自绿色SYBR⑧的荧光增加。每20等分扩增混合物加入21模板RT，扩增根据标准操作进行。下列反义寡核苷酸显示在转染试验中可有效去除TTKRNA:寡79-5AS:GGGACTCTTCCAAATGGGCATGACT(SEQIDNO:5)寡79-9AS:TCCAGTAACTCTTGCGTTCCCATGG(SEQIDNO:6)合成每个这些反义寡核苷酸的反向对照，因为具反义寡核苷酸相同序列的寡核苷酸存在于反向中(反向对照)。寡79-5RC:TCAGTACGGGTAAACCTTCTCAGGG(SEQIDNO:7)寡79-9RC:GGTACCCTTGCGTTCTCAATGACCT(SEQIDNO:8)反义寡核苷酸导入试验细胞中，对相应基因TTK表达的效果以及诱导癌症表型的效果检测如下所述实施例5:TTK表汰对增殖的效果TTK对增殖的效果在转移癌细胞系(MDA-MB-231("231"))、SW620结肠直肠癌细胞或847人无限纤维原细胞中评估。转染如实施例4中所述进行。细胞接种到96-孔培养皿中，约60-80%铺满。反义或反向对照寡核苷酸用OptiMEMTM稀释至2iiM并加到OptiMEM中，在其中传送载体被稀释，SW620中是lipitoid116-6或MDA-MB-231中是1:llipitoid1:胆固醇(cholesteroid)1。寡核苷酸/传送载体混合物进一步在细胞上血清培养基中稀释。所有实验的寡核苷酸终浓度是300nM，所有实验中寡核苷酸相对传送载体的最终比率为1.5nmollipitoid/iig寡核苷酸。细胞37t:过夜转染且转染混合物第二天用新鲜培养基替换。转染反义寡核苷酸到S怖20结肠直肠癌细胞(图7)和231细胞(图8)都导致增殖相较匹配反向对照(RC)和寡核苷酸速度下降，但没有抑制847人无限纤维原细胞的生长(图ll)，说明可能的组织或转化特异性对TTK蛋白质的功能作用。实施例6:TTK表汰对集落形成的效果TTK表达对集落形成的效果在软琼脂试验中测试。进行软琼脂试验首先在新铺培养基中形成2ml0.6%琼脂的底层，这是在铺层细胞的几小时内。细胞层通过用0.05%胰蛋白酶从平板中去除如上所述转染的细胞从而在底层形成，并用培养基洗两次。细胞用Coulter计数器计数，在培养基中悬浮至106每ml。10y1等分样品用培养基接种于96-孔板(以核对用WST1计数)，或为软琼脂试验进一步稀释。2000个细胞接种于0.6%琼脂底层上相同孔的800iU0.4%琼脂中。细胞层琼脂凝固后，在顶部滴下2ml培养基且反义或反向对照寡核苷酸在没有传送载体的情况下加入。每3-4天加入新鲜培养基和寡核苷酸。集落在10天到3周中形成。集落区域用肉眼计数。Wst-l代谢值可用于弥补起始细胞数的微小区别。较大的区域可扫描以直观记录区别。如图9所示，TTK(79-9AS)的反义寡核苷酸导致集落大小和数量相较对照反向对照寡核苷酸(79-9RC)减少，或相对于对照寡核苷酸(52-3AS:TAGGTCTTTGGCCGGTGATGGGTCG(SEQIDNO:9)和52-3RC:GCTGGGTAGTGGCCGGTTTCTGGAT(SEQIDNO:IO))。52-3反义寡核苷酸是对于hD53mRNA，作为实验中的阴性对照。实施例7:细胞死亡对TTK消耗的诱导("反义敲除")S怖20细胞如增殖试验所述转染。为了顺式铂氨(cis)存在时细胞毒性的效果，遵循相同的操作但细胞在2iiM药物存在时被留下。每天通过测定培养基中由于细胞膜破损释放的LDH酶的量来监控细胞活性。用来自RocheMolecularBiochemicals的细胞毒性检测试剂盒测定LDH的活性。数据以在相同时间点和处理时培养基中释放的LDH相对孔中存在的总LDH的比率提供(rLDH/tLDH)。使用BCL2(已知的抗细胞程序性死亡的基因)反义和反向对照寡核苷酸的正对照显示缺少BCL2信息导致细胞死亡相较于用对照寡核苷酸处理增加(由于转染的背景细胞毒性)。测试下列反义寡核苷酸去除与所示集落相应的基因的信息水平的能力。寡核苷酸名字AS或RC提供了耙基因的名字或寡核苷酸的名字，以及寡核苷酸是反义(AS)或反向对照(RC)。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>如图12所示，Chir79-9(TTK)反义不使细胞对顺式铂氨治疗以可检测的水平敏感，但导致死亡在第3天相较于对照寡核苷酸增加。实施例8:调节TTK活件试剂的样品分析此分析可在微量滴定板中进行。TTK用杆状病毒表达系统纯化为6xHis标记融合蛋白。TTK激酶缓冲液中的20iU的20nMTTK(100kDa)加入5iU候选试剂，TTK激酶缓冲液包括50mMH印espH7.4、2mMMgCl2、10mMMnCl2、lmMNaF、50mMNaCl、lmMDTT和lmg/mlBSA，候选试剂稀释于微量滴定板孔中的20XDMSO、10的2.8yM来自cdc25的生物素化的底物肽溶液，如生物素-SGSGSGLYRSPSMPENLNRPR-NH2(SEQIDNO:27)或生物素-GGGGLYRSPSMPENLNRK-OH(SEQIDNO:28)禾P5ii1的80nM33P_yATP。混合样品，培育2小时且每个反应用20ill0.5MEDTApH8.0终止。50样品转移至96孔平底链霉抗生物素蛋白覆盖薄平板，样品在平板中室温培育1小时。平板的孔用250钙和无镁的磷酸缓冲盐水洗，加入闪烁液至样品中。TTK的活性通过计算33P的释放测定，通过闪烁用来自3P-yATP的TTK转移至底物肽。调节TTK活性的试剂可通过比较候选试剂存在时TTK活性和没有候选试剂时TTK活性来鉴定。本发明用它的具体实施方案描述，本领域技术人员应该理解可作不同变化且同等物可被替换而不离开发明的实际精神和范围。此外，可进行许多修饰来使具体情况、材料、物质的组合物、过程、一步或几步过程适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修饰确定为发明的范围内。序列表〈110>C.莱因哈德A.B.杰斐逊V.W.占〈120〉用于诊断和作为癌症治疗靶标的TTK〈130>PP-16923.003〈140〉待定〈141>2002-02-21〈150>60/289，813〈151>2001-02-21〈160>38〈170〉FastSEQforWindowsV'〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡核苷酸〈400>1cggaatcaagtcttctagct〈210>2〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡核苷酸〈400>2ggttgctcaaaagttggtatg〈210>3〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡核苷酸〈400>3cgggaaatcgtgcgtgacatt朋g〈210>4〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡核苷酸〈400>4tgatctccttctgcatcctgtcgg〈210>5〈211>25〈212>DNA20212424〈220〉〈223〉合成的寡核苷酸〈400>5gggactcttccaaatgggcatgact〈210>6〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡核苷酸〈400>6tccagtaactcttgcgttcccatgg〈210>7〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡核苷酸〈400>7tcagtacgggtaaaccttctCElggg〈210>8〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡核苷酸〈400>8ggtacccttgcgttctcaatgacct〈210>9〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡核苷酸〈400>9taggtctttggccggtgatgggtcg〈210>10〈211>25说明书28/87页2525252525〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>合成的寡核苷酸〈400>10gctgggtagtggccggtttctggat25〈210>11〈211>25〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡核苷酸〈400>11actcatctggctgggctatggtggt25〈210>12〈211>25〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉合成的寡核苷酸〈400>12tggtggtatcgggtcggtct25〈210>13〈211〉3866〈212>DNA<213>智人(Homosapien)〈220〉〈221>CDS〈222〉(1026).(3551)〈221>misc_feature〈222〉(0).(0)〈223〉TTK〈400>13ggaattcctttttttttttttttg卿tggagtttcactcttgttggccaggctggagtg60caatggcacaatctcagcttactgcaacctccgcctcccgggttc卿cgattctcctgc120ctcagcctctcaagtagctggg￡ltt￡lC￡lggcatgtgccaccacccctggc180cttttctatttagtagagatggggtttcaccatgttggtcaggctggtcttgaactcctg240acctcaggtgatccacttgccttggcctccggattecagcCgtg皿3Ctg300tgcctggctgattctttttttgttgttggatttttgaaacagggtctcccttggtcgccc360aggctggagtgcagtggtgcgatcttggctcactataacctccacctcctggtttcaagt420gatcctcccactttagcctcctgagtegctgtgattecaggcgtgcaccaccacacccgg■ctaatttttgtatttttatt3g3g3C3gggtttcaccatgttggccaggctgttctcaaa540ctcctggactC33ggg3tCCgcctgcctccacttcccaaagtcccgagattacaggtgtg600agtcaccatgcctgaccttataattcttaagtcattttttctggtccatttcttccttag660ggtcctcacaacaaatctgcatteggeggtac^teatccttaacttcatgattcacaaa7203gg朋gatg3agtgattcatgattteg^agggg^gtagtaagcccactgcacactcct780gg￡ltg￡ltg￡ltcctaaatccatggg朋ggteg朋tec朋朋840tttggtttaaattaattatctaaatatctaaaaacatttttggatacattgttgatgtga■atgteagactgtacagacttccteg^^cagtttgggttccatcttttcatttccccag960tgcagttttcg^tccgaggattteagtggC3g3g朋ttg3C朋ttg3tt1020ccateatg朋c3朋gtgg3C3tt皿gtttgac1070MetAsnLysValArgAsplieLysAsnLysPheLysAsnGluAsp151015cttactgatetaagettgaatatttctgetg3t3Ctgat1118LeuThrAspGluLeuSerLeuAsnLyslieSerAlaAspThrThrAsp202530朋ctegggaactgttaaccaaattEltg3tgEltggC3朋CCC3gag1166AsnSerGlyThrValAsnGinlieMetMetMetAlaAsnAsnProGlu354045g￡lCtggttgagtttgttgetcaaaetagag3朋aacagtgttccgeta1214AspTrpLeuSerLeuLeuLeuLysLeuGluLysAsnSerValProLeu505560Elgtgatgetcttttettgattggtcgttecagtc朋gcaatt1262SerAspAlaLeuLeuAsnLysLeulieGlyArgTyrSerGinAlalie657075g朋gcgcttcccccagattetggcgagagttttgetaga1310GluAlaLeuProProAspLysTyrGlyGinAsnGluSerPheAlaArg80859095attgtgtttgetgaattagetattc朋gagccagatgat1358lieGinValArgPheAlaGluLeuLysAlalieGinGluProAspAsp100105110gCElcgtgactactttcaaatggcc3gagca朋ctgc朋ga朋tttget1406AlaArgAspTyrPheGinMetAlaArgAlaAsnCysLysLysPheAla115120125tttgttcatatetcttttgcacaatttg朋ctgteac朋ggt朋tgtc1454PheValHislieSerPheAlaGinPheGluLeuSerGinGlyAsnVal130135140皿aagtcaacttcttcaagetgte!g朋cgtggagcagte1502LysLysSerLysGinLeuLeuGinLysAlaValGluArgGlyAlaVal145150155CC3etag朋Eltgctgg朋attgccctgegg朋ttte朋cetcc朋a朋1550ProLeuGluMetLeuGlulieAlaLeuArgAsnLeuAsnLeuGinLys160165170175朋gCElgctgcttteagaggagg朋朋g朋g朋ttteteagcatctacg1598LysGinLeuLeuSerGluGluGluLysLysAsnLeuSerAlaSerThr180185190gt￡lttaactgccc朋g朋teattttecggtteacttgggcatttecag1646ValLeuThrAlaGinGluSerPheSerGlySerLeuGlyHisLeuGin195200205朋t￡igg朋c朋cElgttgtgattec3g3ggacagactact333gcc3gg1694AsnArgAsnAsnSerCysAspSerArgGlyGinThrThrLysAlaArg210215220tttttatatgag朋cEltgCC3ccac朋gatgcag朋ateggttec1742PheLeuTyrGlyGluAsnMetProProGinAspAlaGlulieGlyTyr225230235egg朋tteattg3gac朋act朋caaaactaaacagteatgcccattt1790ArgAsnSerLeuArgGinThrAsnLysThrLysGinSerCysProPhe2402452502553gagtcCC3gtt朋cctteta朋tageccagattgtgatgtg33g1838GlyArgValProValAsnLeuLeuAsnSerProAspCysAspValLys260265270gatgatteagttgt￡lccttgtttt3tg3333g3acctct3g31886ThrAspAspSerValValProCysPheMetLysArgGinThrS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