专利名称：一种美洲大蠊提取物中活性成份的检测方法
技术领域：
本发明涉及药物检测方法，具体涉及中药康复新液主要活性成分美洲大蠊提取物 的检测方法，尤其涉及一种美洲大蠊提取物中活性成份的检测方法。
背景技术：
中药康复新液是本申请人已上市多年的产品，主要成分为美洲大蠊提取物。功能 主治为通利血脉，养阴生肌。内服用于瘀血阴滞，胃痛出血，胃、十二指肠溃疡；以及阴虚 肺痨，肺结核的辅助治疗。外用于金疮、外伤、溃疡烧伤、褥疮之创面。有关美洲大蠊中的药效活性成分报道较少，其主要的化学成分为信息素类及氨基 酸和各种昆虫神经肽类，此外还有蜚蠊酸、蜚蠊酮、蟑螂油、过敏原成分、各种酶、细胞色素 A、B、C、甲壳素、烟酸及微量元素等，有明确药效活性化学成分的报道也比较少。康复新液的临床疗效明确，但因所含成分复杂，真正的活性物质基础不够明确，现 行质量标准中仅收录性状、鉴别(氨基酸和嘧啶碱的鉴别)、PH值及总氨基酸含量等，并以 此作为主要质控指标。由于含量测定项仅有总氨基酸，不能真正控制康复新液的质量。随 着对药品质量的要求不断提高，对康复新液进一步深入研究，找到能真正体现其活性的物 质基础，提高其质量标准具有重要的意义。为此，本发明人从分子水平基础上阐明康复新液的药效活性成分，经过艰苦努力， 从康复新液中成功地分离到了一种具有显著的抗炎、促进肉芽组织增生、创伤愈合等活性 作用的化合物单体成分(化学名(3R)-3-甲基-7-羟甲基-8-羟基-3，4-二氢异香豆 素-6-0- β -D-吡喃葡萄糖苷，简称KFX-4)，专利申请号=200910200557. 9。目前，对于美洲大蠊提取物及康复新液的质量标准中只有总氨基酸的质量控制， 与其药效没有直接的关系，而本发明人对KFX-4的药效试验表明具有显著的抗炎、促进肉 芽组织增生、创伤愈合等活性作用，与其适应症一致。康复新液中KFX-4的质控检测方法未 见文献报道，且因其含量较低，杂质干扰非常严重，常规检测方法难以实施，存在困难。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究康复新液的药效活性成分(3R)-3-甲 基-7-羟甲基-8-羟基-3，4- 二氢异香豆素-6-0- β -D-吡喃葡萄糖苷，简称KFX-4的含 量，设计更好控制该产品质量的方法。本发明提供了一种美洲大蠊提取物中活性成份的检测方法。具体提供了美洲大蠊 提取物中的活性成份(3R) -3-甲基-7-羟甲基-8-羟基-3，4- 二氢异香豆素-6-0- β -D-吡 喃葡萄糖苷，KFX-4的检测方法。有关康复新液及美洲大蠊提取物中活性成份KFX-4的检测方法未见文献报道，且 因其含量较低，杂质干扰非常严重，常规检测方法难以实施。本发明人经多次研究，试用了 多种分离富集KFX-4的方法，选用多种树脂和固相萃取柱，并试用了多种洗脱液和色谱分 离条件，最终建立了康复新液中KFX-4的检测方法。
本发明采用HPLC色谱法，包括下列步骤(1)色谱条件与系统以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇或乙腈_水 (0-50 100-50V/V)为流动相，流速 0. 2-2. Oml/min ；检测波长为 210nm_400nm 中的一个 或几个波长或二极管阵列检测器，进样量5-50 μ 1，理论板数按(3R)-3-甲基-7-羟甲 基-8-羟基-3，4- 二氢异香豆素-6-0- β -D-吡喃葡萄糖苷峰计算应不低于4000，且与相邻 杂质峰的分离度均大于1. 5 ；(2)对照品溶液的制备取KFX-4对照品(京新药业提取精制，制备方法见专利， 申请号=200910200557. 9)适量，精密称定，加甲醇或乙腈的5_50%水溶液，制成每ml含 2-100 μ g (3R) -3-甲基-7-羟甲基-8-羟基-3，4- 二氢异香豆素-6-0- β -D-吡喃葡萄糖苷 的溶液，即得；(3)美洲大蠊提取物供试品溶液的制备取美洲大蠊提取物lg，精密称定，置IOml 量瓶内，加水约5-7ml，加热或超声使溶解，定容，离心，取离心清液l_5ml，过固相萃取小柱 或聚苯乙烯型吸附树脂，用水l_5ml洗涤两次，弃去，用甲醇或乙腈或其中任一的5-50%水 溶液2ml洗脱或梯度洗脱，合并洗脱液，置水浴蒸干，残渣用甲醇或乙腈的5-50%水溶液溶 解并定量转移到Iml或2ml量瓶，离心，上清液作为供试品溶液；(4)分别取上述溶液进行色谱分析，以峰面积外标法计算(3R)-3-甲基-7-羟甲 基-8-羟基-3，4- 二氢异香豆素-6-0-β -D-吡喃葡萄糖苷含量(参照中华人民共和国药 典2005年版二部附录V D)。本发明方法可用于中药康复新液的质量控制，检测其中的KFX-4含量，有效控制 药品质量。具体方法为康复新液供试品溶液的制备精密量取康复新液10ml，经lOOOOrpm， 离心lOmin，取上清液过固相萃取小柱或聚苯乙烯型吸附树脂，用l-5ml水洗涤，弃去洗涤 液，再用0. 01-0. 5mol/L氢氧化钠溶液l_5ml洗涤，弃去洗涤液；最后用甲醇或乙腈或其中 任一的5-50%水溶液l-5ml洗脱或梯度洗脱，收集洗脱液，作为供试品溶液，分别取上述溶 液按上述方法进行色谱分析，以峰面积外标法计算KFX-4含量。本发明方法所述固相萃取柱为反相聚合物固相萃取柱，包括ODS或HLB或Strata X固相萃取柱的任一种；所述聚苯乙烯型吸附树脂，包括D101、丽200、HPD100, HPD400、 HPD450、AB-8、D4020、S_8，HZ806 或 HP-20 的任一种。本发明提供了美洲大蠊提取物中活性成份(3R)-3_甲基-7-羟甲基-8-羟基_3， 4- 二氢异香豆素-6-0- β -D-吡喃葡萄糖苷，KFX-4的检测方法，为中药康复新液提供有效 的质量控制方法，对于提高产品质量和药物的安全性有较大的实用价值。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明。美洲大蠊提取物批号Τ09070101、Τ09070102、Τ09070103、Τ09070104、Τ09070201、 Τ09070202、Τ09060103、Τ09060104、Τ09060201、Τ090104。康复新液批号:090602、090608、090609、090709、090805、090807、091101、091103、 091201,081003,071004,071003ο以上美洲大蠊提取物和康复新液样品均由内蒙古京新药业有限公司提供，供下列实施例使用。实施例1美洲大蠊提取物制备(以下检测用的各批号美洲大蠊提取物均按此法制备)取干燥美洲大蠊1kg，置提取罐罐内，加入90%的乙醇溶液，于60°C温浸三次，每 次12小时，第一次用乙醇为美洲大蠊的八倍量；第二次为六倍量；第三次四倍量。合并温浸 液，过滤浓缩，回收乙醇至无醇味。所得浓缩液加纯化水为美洲大蠊的1-2倍量。静置24 小时以上，分离并弃去沉淀、油层，水溶液过滤，减压浓缩至相对密度1. 15-1.20(70°C )，即 得。实施例2取T09070101批号美洲大蠊提取物lg，精密称定，置IOml量瓶内，加水约5_7ml， 超声溶解，定容至10ml。离心，取离心清液lml，过Strata X固相萃取小柱，用水洗涤两次， 每次2ml，弃去，用20%甲醇，30%甲醇，50%甲醇各2ml依次洗脱，合并洗脱液，置水浴蒸 干，残渣用50%甲醇溶解并定量转移到Iml或2ml量瓶，离心，取上清液进行色谱分析[色 谱分析条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(20 80)V/V为流动相，流 速0. 8ml/min ；检测波长为265nm，进样量5 μ 1，以峰面积外标法计算KFX-4的含量]。结 果测得KFX-4含量为0. 485mg/g。实施例3取T09070101批号美洲大蠊提取物约lg，精密称定，置IOml量瓶内，加水约 5-7ml，加热或超声使溶解，定容。离心，取离心清液Iml，过ODS (十八烷基硅烷健合硅胶) 固相萃取小柱，用水洗涤两次，每次2ml，弃去，用20%甲醇，30%甲醇，50%甲醇各2ml依次 洗脱，合并洗脱液，置水浴蒸干，残渣用50%甲醇溶解并定量转移到Iml或2ml量瓶，离心， 取上清液进行色谱分析(方法同实施例1)。结果测得KFX-4含量为0. 483mg/g。实施例4取T09070101批号美洲大蠊提取物约lg，精密称定，置IOml量瓶内，加水约 5_7ml，加热或超声使溶解，定容。离心，取离心清液1ml，过HLB固相萃取小柱，用水洗涤两 次，每次2ml，弃去，用20%甲醇，30%甲醇，50%甲醇各2ml依次洗脱，合并洗脱液，置水浴 蒸干，残渣用50%甲醇溶解并定量转移到Iml或2ml量瓶，离心，取上清液进行色谱分析 (方法同实施例1)。结果测得KFX-4含量为0. 478mg/g。实施例5精密移取090807批康复新液10ml，lOOOOrpm，离心lOmin，取离心清夜过DlOl大 孔树脂柱(lg，内径15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗涤，洗涤液弃去，继续用50%乙醇50ml 洗脱，洗脱液置水浴蒸干，残渣用50%甲醇溶解并定量转移到Iml或2ml量瓶，离心。取上 清液进行色谱分析(方法同实施例1)。结果测得KFX-4含量为2. 09 μ g/ml。实施例6精密移取090807批康复新液IOml，lOOOOrpm,离心lOmin，取离心清夜过MN200大 孔树脂柱(lg，内径15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗涤，洗涤液弃去，继续用50%乙醇50ml 洗脱，洗脱液置水浴蒸干，残渣用50%甲醇溶解并定量转移到Iml或2ml量瓶，离心。取上 清液进行色谱分析(方法同实施例1)。结果测得KFX-4含量为2. 16 μ g/ml。实施例7
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精密移取090807批康复新液10ml，IOOOOrpm,离心lOmin，取离心清夜过HPDlOO 大孔树脂柱(lg，内径15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗涤，洗涤液弃去，继续用50%乙醇 50ml洗脱，洗脱液置水浴蒸干，残渣用50%甲醇溶解并定量转移到Iml或2ml量瓶，离心。 取上清液进行色谱分析(方法同实施例1)。结果测得KFX-4含量为2. 14yg/ml。实施例8精密移取090807批康复新液10ml，IOOOOrpm,离心lOmin，取离心清夜过HPD400 大孔树脂柱(lg，内径15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗涤，洗涤液弃去，继续用50%乙醇 50ml洗脱，洗脱液置水浴蒸干，残渣用50%甲醇溶解并定量转移到Iml或2ml量瓶，离心。 取上清液进行色谱分析(方法同实施例1)。结果测得KFX-4含量为2. 08g/ml。实施例9精密移取090807批康复新液10ml，IOOOOrpm,离心lOmin，取离心清夜过HPD450 大孔树脂柱(lg，内径15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗涤，洗涤液弃去，继续用50%乙醇 50ml洗脱，洗脱液置水浴蒸干，残渣用50%甲醇溶解并定量转移到Iml或2ml量瓶，离心。 取上清液进行色谱分析(方法同实施例1)。结果测得KFX-4含量为2. 12 μ g/ml。实施例10精密移取090807批康复新液10ml，lOOOOrpm，离心lOmin，取离心清夜过AB-8大 孔树脂柱(lg，内径15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗涤，洗涤液弃去，继续用50%乙醇50ml 洗脱，洗脱液置水浴蒸干，残渣用50%甲醇溶解并定量转移到Iml或2ml量瓶，离心。取上 清液进行色谱分析(方法同实施例1)。结果测得KFX-4含量为2. 10 μ g/ml。实施例11精密移取090807批康复新液IOml，lOOOOrpm,离心lOmin，取离心清夜过D4020大 孔树脂柱(lg，内径15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗涤，洗涤液弃去，继续用50%乙醇50ml 洗脱，洗脱液置水浴蒸干，残渣用50%甲醇溶解并定量转移到Iml或2ml量瓶，离心。取上 清液进行色谱分析(方法同实施例2)。结果测得KFX-4含量为2. 13 μ g/ml。实施例12精密移取090807批康复新液IOml，lOOOOrpm,离心lOmin，取离心清夜过S-8大孔 树脂柱(lg，内径15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗涤，洗涤液弃去，继续用50%乙醇50ml洗 脱，洗脱液置水浴蒸干，残渣用50%甲醇溶解并定量转移到Iml或2ml量瓶，离心。取上清 液进行色谱分析(方法同实施例1)。结果测得KFX-4含量为2. 08 μ g/ml。实施例13精密移取090807批康复新液IOml，lOOOOrpm,离心lOmin，取离心清夜过HZ806大 孔树脂柱(lg，内径15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗涤，洗涤液弃去，继续用50%乙醇50ml 洗脱，洗脱液置水浴蒸干，残渣用50%甲醇溶解并定量转移到Iml或2ml量瓶，离心。取上 清液进行色谱分析(方法同实施例1)。结果测得KFX-4含量为2. 12 μ g/ml。实施例14 精密移取090807批康复新液IOml，lOOOOrpm,离心lOmin，取离心清夜过HP-20大 孔树脂柱(lg，内径15mm)，用水，5%乙醇各IOml洗涤，洗涤液弃去，继续用50%乙醇50ml 洗脱，洗脱液置水浴蒸干，残渣用50%甲醇溶解并定量转移到Iml或2ml量瓶，离心。取上 清液进行色谱分析(方法同实施例1)。结果测得KFX-4含量为2. 10 μ g/ml。
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实施例15本发明检测方法的条件选择试验1.检测波长的选择二极管阵列检测器全波长扫描，显示最大吸收波长两个为220nm和265nm，由于 220nm接近紫外末端吸收，故选择265nm为检测波长。2.流动相的选择洗脱方式一梯度洗脱。流动相A 0. 2%冰乙酸的水溶液流动相B 0. 2%冰乙酸的的乙腈溶液
时间(分钟)流动相)流动相B(%)010005100020802035595洗脱方式二 等度洗脱。流动相为甲醇-水(20 80)V/V，流速为0.8ml/min两种洗脱方法，KFX-4与前后峰均完全分离且峰纯度大于990，分离度均符合要 求。表明流动相适应良好。质控标准中选用洗脱方式二作为色谱条件。3.专属性试验取美洲大蠊提取物按测定法检测，显示KFX-4的吸收峰在DAD峰纯度检测中，峰纯 度大于990。表明此法有较强的专属性。4.定量限稀释KFX-4对照品溶液，使液相色谱图中显示的KFX-4峰的信噪比约等于10 1， 结果此时KFX-4浓度为0. 618 μ g/ml。5.线形与范围配制KFX-4对照品溶液贮备液，稀释至不同浓度，注入HPLC，记录色谱图，以 KFX-4对照品的峰面积⑴和KFX-4浓度⑴为X轴进行线性回归，得回归方程y = 11. 498x-0. 883r = 0. 99998。表1 线性与范围检测结果
KFX-4 的 量(μ g/ml)0. 6181. 8443. 6889. 22018. 4427. 6646. 1092. 2峰面积7. 720. 542. 38106.04211. 66311. 01528. 601060. 15 由上述结果可知在0.618-9. 28 μ g/ml范围内，线性关系良好，可采用外标一点法
7计算含量。6.仪器精密度取浓度21. 74 μ g/ml的KFX-4对照品溶液，连续进样6次，进样量5 μ 1，记录峰面 积，计算相对标准偏差RSD)。结果表明仪器精密度良好，见表2。表2仪器精密度考察结果
权利要求
一种美洲大蠊提取物中活性成份KFX 4的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)色谱条件与系统以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇或乙腈 水0 50∶100 50V/V为流动相，流速0.2 2.0ml/min；检测波长为210nm 400nm中的一个或几个波长或二极管阵列检测器，进样量5 50μl，理论板数按KFX 4峰计算应不低于4000，且与相邻杂质峰的分离度均大于1.5；(2)对照品溶液的制备取KFX 4对照品适量，精密称定，加甲醇或乙腈的5 50％水溶液，制成每ml含2 100μg KFX 4的溶液，即得；(3)美洲大蠊提取物供试品溶液的制备取美洲大蠊提取物约1g，精密称定，置10ml量瓶内，加水约5 7ml，加热或超声使溶解，加水定容，离心，取离心清液1 5ml，过固相萃取小柱或聚苯乙烯型吸附树脂，用水1 5ml洗涤两次，弃去，用甲醇或乙腈的5 50％水溶液2ml洗脱或梯度洗脱，合并洗脱液，置水浴蒸干，残渣用甲醇或乙腈的5 50％水溶液溶解并定量转移到1ml或2ml量瓶，离心，上清液作为供试品溶液；(4)分别取上述溶液进行色谱分析，以峰面积外标法计算KFX 4含量。
2.根据权利要求1所述一种美洲大蠊提取物中活性成份的检测方法，其特征在于所述 活性成份为(3R)-3-甲基-7-羟甲基-8-羟基-3，4-二氢异香豆素-6-0-β-D-吡喃葡萄 糖苷。
3.根据权利要求1所述一种美洲大蠊提取物中活性成份的检测方法，其特征在于所 述方法用于检测中药康复新液中的(3R)-3-甲基-7-羟甲基-8-羟基-3，4- 二氢异香豆 素-6-0-β -D-吡喃葡萄糖苷含量。
4.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述检测中药康复新液中的(3R)-3-甲 基-7-羟甲基-8-羟基-3，4- 二氢异香豆素-6-0- β -D-吡喃葡萄糖苷含量包括下列步骤(1)色谱条件与系统以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇或乙腈-水0-50 100-50V/V为流动相，流速0.2-2. Oml/min ；检测波长为210nm_400nm中的一个或几 个波长或二极管阵列检测器，进样量5-50μ 1，理论板数按KFX-4峰计算应不低于4000，且 与相邻杂质峰的分离度均大于1. 5 ；(2)对照品溶液的制备取KFX-4对照品适量，精密称定，加甲醇或乙腈的5-50% 水溶液，制成每ml含2-100μβ(3Κ)-3-甲基_7_羟甲基-8-羟基-3，4-二氢异香豆 素-6-0-β -D-吡喃葡萄糖苷的溶液，即得；(3)康复新液供试品溶液的制备精密量取康复新液10ml，经IOOOOrpm，离心lOmin， 取上清液过固相萃取小柱或聚苯乙烯型吸附树脂，用l_5ml水洗涤，弃去洗涤液，再用 0. 01-0. 5mol/L氢氧化钠溶液l-5ml洗涤，弃去洗涤液；最后用甲醇或乙腈的5-50%水溶液1-5ml洗脱或梯度洗脱，收集洗脱液，作为供试品溶液；(4)分别取上述溶液进行色谱分析，以峰面积外标法计算(3R)-3-甲基-7-羟甲 基-8-羟基-3，4- 二氢异香豆素-6-0- β -D-吡喃葡萄糖苷含量。
5.根据权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于所述固相萃取柱为反相聚合物固 相萃取柱，包括ODS或HLB或Strata X固相萃取柱的任一种；所述聚苯乙烯型吸附树脂，包 括 D101、MN200、HPDlOO、HPD400、HPD450、AB-8、D4020、S-8，HZ806 或 HP-20 的任一种。
全文摘要
本发明提供了美洲大蠊提取物中活性成份(3R)-3-甲基-7-羟甲基-8-羟基-3，4-二氢异香豆素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，KFX-4的检测方法。采用HPLC色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇或乙腈-水(0-50∶100-50V/V)为流动相，流速0.2-2.0ml/min；检测波长为210nm-400nm中的一个或几个波长或二极管阵列检测器，进样量5-50μl，理论板数按KFX-4峰计算应不低于4000，且与相邻杂质峰的分离度均大于1.5进行色谱分析，以峰面积外标法计算KFX-4含量。本发明为中药康复新液提供有效的质量控制方法，对于提高产品质量和药物的安全性有较大的实用价值。
文档编号G01N30/02GK101957345SQ201010118350
公开日2011年1月26日 申请日期2010年3月5日 优先权日2010年3月5日
发明者余国珍, 陈鉴东 申请人:浙江京新药业股份有限公司;内蒙古京新药业有限公司